JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:28 min • August 31st, 2026
Pobrać kulturę genetycznie zmodyfikowanych bakterii krętkowców. Bakterie te posiadają gen oporności na gentamycynę.
Dodaj zawiesinę bakteriofagów do kultury bakteryjnej.
Fagi przenoszą plazmidowe DNA kodujące gen oporności na kanamycynę.
Inkubować mieszaninę.
Bakteriofag przyczepia się do powierzchni bakterii i wstrzykuje DNA do wnętrza komórki.
Plazmid replikuje się niezależnie i jest przekazywany podczas podziału bakterii.
Wymieszać inkubowaną kulturę z roztopionym medium agarozowym uzupełnionym o antybiotyki gentamycynę i kanamycynę.
Wlej mieszaninę do płytki. Pozostaw do stężenia, a następnie inkubuj.
W warunkach selekcji podwójnym antybiotykiem rosną i tworzą kolonie tylko komórki posiadające oba markery oporności, natomiast pozostałe komórki giną.
Wybrać kolonię i zaszczepić ją w pożywce zawierającej oba antybiotyki.
Inkubować w celu ułatwienia wzrostu bakterii z przetransdukowanym plazmidem do dalszych analiz.
Zlej nadsącz i zawieś osad w 14,5 milliliters świeżej pożywki BSK. Do kultury klonu biorcy dodaj mniej niż lub równo 500 microliters próbki fagów wytrąconych za pomocą PEG.
Po dokładnym wymieszaniu inkubować w temperaturze 33 °C przez 72 do 96 godzin. Selekcję transduktantów przeprowadzić poprzez wysiew na podłoże stałe po wymieszaniu z fagami wytrąconymi w PEG, zgodnie z opisem w manuskrypcie. W zależności od tła klonu biorcy należy sprawdzić, czy kolonie pojawiły się wewnątrz agarozy na płytkach selekcyjnych po 10 do 21 dniach inkubacji.
Za pomocą wysterylizowanej pipety borokrzemianowej o długości 5,75 cala z bawełnianym czopkiem pobierz co najmniej 5 do 10 kolonii rosnących na płytce w obecności obu antybiotyków i zaszczep je do 1,5 ml BSK z odpowiednim antybiotykiem.