Wprowadzanie genów do jelitowych organoidów mysich przy użyciu wektorów lentiwirusowych

Zacznij od organoidów jelita mysiego, które zostały częściowo dysocjowane w celu ułatwienia transdukcji lentiwirusowej.

Przygotuj wektory lentiwirusowe w medium do transdukcji.

Lentiwirus przenosi gen będący przedmiotem zainteresowania w celu stabilnej integracji z genomem gospodarza.

Dodaj lentiwirus do dołka.

Inkubuj mieszaninę, aby umożliwić wnikanie wirusa.

Wirusowe RNA ulega odwrotnej transkrypcji do postaci DNA i integruje się z genomem gospodarza.

Dodać medium do organoidów i przenieść mieszaninę do probówki.

Odwiruj w celu usunięcia niewiązanych wirusów.

Wymieszaj osad w macierzy błony podstawnej.

Umieść organoidy w dołku i poczekaj, aż stwardnieją.

Macierz tworzy sieć, która więzi organoidy i zapewnia wsparcie strukturalne.

Dodać pożywkę do organoidów uzupełnioną o promotory wzrostu, aby wspomóc proliferację organoidów.

W rezultacie powstają pączkujące organoidy zawierające przetransdukowany gen, które mogą być wykorzystane do dalszych analiz funkcjonalnych.

Przenieś organoidy w tej ostatniej niewielkiej ilości pożywki dołka na płytce 48-dołkowej.

Dodaj wcześniej przygotowany lentiwirus o wysokim mianie w medium do transdukcji do organoidów i resuspenduj. Inkubuj mieszaninę organoidów i