JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:30 min. • August 31st, 2026
Zacznij od organoidów jelita mysiego, które zostały częściowo dysocjowane w celu ułatwienia transdukcji lentiwirusowej.
Przygotuj wektory lentiwirusowe w medium do transdukcji.
Lentiwirus przenosi gen będący przedmiotem zainteresowania w celu stabilnej integracji z genomem gospodarza.
Dodaj lentiwirus do dołka.
Inkubuj mieszaninę, aby umożliwić wnikanie wirusa.
Wirusowe RNA ulega odwrotnej transkrypcji do postaci DNA i integruje się z genomem gospodarza.
Dodać medium do organoidów i przenieść mieszaninę do probówki.
Odwiruj w celu usunięcia niewiązanych wirusów.
Wymieszaj osad w macierzy błony podstawnej.
Umieść organoidy w dołku i poczekaj, aż stwardnieją.
Macierz tworzy sieć, która więzi organoidy i zapewnia wsparcie strukturalne.
Dodać pożywkę do organoidów uzupełnioną o promotory wzrostu, aby wspomóc proliferację organoidów.
W rezultacie powstają pączkujące organoidy zawierające przetransdukowany gen, które mogą być wykorzystane do dalszych analiz funkcjonalnych.
Przenieś organoidy w tej ostatniej niewielkiej ilości pożywki dołka na płytce 48-dołkowej.
Dodaj wcześniej przygotowany lentiwirus o wysokim mianie w medium do transdukcji do organoidów i resuspenduj. Inkubuj mieszaninę organoidów i wirusa przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby umożliwić transdukcję. Po godzinie dodaj jeden mililitr medium do hodowli organoidów do mieszaniny organoidów i wirusa, resuspenduj, a następnie przenieś mieszaninę do probówki do mikrocentryfugi i wiruj przy 850 x g przez pięć minut.
Aby uzyskać pellet organoidów, należy usunąć nadsącz i resuspendować pellet w 20 µL lodowatego Matrigelu. Kroplę należy umieścić na środku dołka. W płytce 48-dołkowej inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aż kropla stwardnieje. Po 15 minutach ostrożnie dodać 250 µL pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej o nikotynamid i inhibitory kinazy.