JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:40 min • August 31st, 2026
Przygotować hodowle komórek raka piersi.
Przeprowadź koinfekcję dwoma typami adenowirusów. Jeden z nich niesie gen białka zielonej fluorescencji lub GFP pod kontrolą konstytutywnie aktywnego promotora.
Drugi zawiera gen reporterowy kodujący czerwone białko fluorescencyjne lub RFP, pod kontrolą promotora reagującego na SMAD.
Do kultury testowej dodać TGF-beta i inkubować.
Wirusy wiążą się z receptorem, aby wniknąć do komórki gospodarza, dostarczyć geny do jądra komórkowego i umożliwić ekspresję GFP.
W komórkach testowych TGF-beta wiąże się ze swoim receptorem i aktywuje szlak SMAD poprzez fosforylację białek SMAD2 i SMAD3.
Białka te tworzą kompleks z SMAD4.
Kompleks ten wiąże się z promotorem genu reporterowego, umożliwiając ekspresję RFP oprócz GFP.
W grupie kontrolnej szlak SMAD pozostaje nieaktywny, co pozwala komórkom na ekspresję wyłącznie GFP.
Wykonaj obrazy fluorescencyjne żywych komórek.
Obecność obu sygnałów potwierdza aktywację szlaku SMAD przy użyciu podwójnej transdukcji adenowirusowej.
W dniu infekcji adenowirusami, wysiej do studni płytki 12-dołkowej około 1,25 × 10⁵ komórek MDA-MB-231 w 500 µL pożywki, aby uzyskać 35% konfluencji. Zainfekuj komórki we wszystkich studniach, dodając 75 µL adenowirusa CMV-GFP oraz 7,5 µL adenowirusa CAGA12-Td-Tomato, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 2500, co pozwala na osiągnięcie 100% pozytywności infekcji. Następnie, bezpośrednio po infekcji adenowirusami, dodaj TGF-beta do studni przeznaczonej do traktowania.
Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 10% CO2 przez 24 godziny. Następnego dnia wykonać obrazowanie żywych komórek za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu fazokontrastowego.