JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:40 min. • August 31st, 2026
Przygotować hodowle komórek raka piersi.
Przeprowadź koinfekcję dwoma typami adenowirusów. Jeden z nich niesie gen białka zielonej fluorescencji lub GFP pod kontrolą konstytutywnie aktywnego promotora.
Drugi zawiera gen reporterowy kodujący czerwone białko fluorescencyjne lub RFP, pod kontrolą promotora reagującego na SMAD.
Do kultury testowej dodać TGF-beta i inkubować.
Wirusy wiążą się z receptorem, aby wniknąć do komórki gospodarza, dostarczyć geny do jądra komórkowego i umożliwić ekspresję GFP.
W komórkach testowych TGF-beta wiąże się ze swoim receptorem i aktywuje szlak SMAD poprzez fosforylację białek SMAD2 i SMAD3.
Białka te tworzą kompleks z SMAD4.
Kompleks ten wiąże się z promotorem genu reporterowego, umożliwiając ekspresję RFP oprócz GFP.
W grupie kontrolnej szlak SMAD pozostaje nieaktywny, co pozwala komórkom na ekspresję wyłącznie GFP.
Wykonaj obrazy fluorescencyjne żywych komórek.
Obecność obu sygnałów potwierdza aktywację szlaku SMAD przy użyciu podwójnej transdukcji adenowirusowej.
W dniu infekcji adenowirusami, wysiej do studni płytki 12-dołkowej około 1,25 × 10⁵ komórek MDA-MB-231 w 500 µL pożywki, aby uzyskać 35% konfluencji. Zainfekuj komórki we wszystkich studniach, dodaj
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych