JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:36 min. • August 31st, 2026
Rozpocznij od ludzkich limfocytów zainfekowanych HIV-1 na szkiełku podstawowym z przytwierdzonym szkiełkiem nakrywkowym.
Komórki te zostały poddane hybrydyzacji z sondami, które fluorescencyjnie znakują wirusowe RNA oraz prowirusowe DNA.
Inkubuj komórki w roztworze blokującym, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał.
Należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko białku kapsydu HIV-1.
Inkubować, aby umożliwić związanie przeciwciał pierwszorzędowych z białkiem kapsydu.
Przemyj komórki buforem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
Dodaj przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie, które wiążą się z przeciwciałami pierwotnymi.
Wypłucz niezwiązane przeciwciała.
Dodaj barwnik specyficzny dla DNA w celu zabarwienia jąder komórkowych, a następnie wypłucz, aby usunąć nadmiar barwnika.
Zastosuj multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne, aby jednocześnie wykryć wirusowe DNA, RNA, białka oraz jądra komórkowe gospodarza w różnych kolorach.
Ta wizualizacja pojedynczych komórek umożliwia badanie różnych etapów cyklu życiowego wirusa poprzez jednoczesną wizualizację wirusowego DNA, RNA i białek w zakażonych komórkach.
W celu immunostainingu białek zainteresowania, po ostatnim przemyciu, należy potraktować każde szkiełko nakrywkowe 200 µL buforu blokującego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu inkubacji odlej bufor blokujący i dodaj 200 µL odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBS plus Tween 20 z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej. Po jednej godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej przemyj preparaty dwukrotnie przez 10 min w świeżym roztworze PBS plus Tween 20, wstrząsając podczas każdego mycia, a następnie znakuj próbki odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przemyj preparaty dwukrotnie w świeżym roztworze PBS plus Tween 20 przez 10 min, wstrząsając podczas każdego mycia.
Po drugim przemyciu przeprowadź przeciwbarwienie jąder komórkowych za pomocą odpowiedniego barwnika jądrowego przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj preparat dwukrotnie w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy potrząsaniu.