Oczyszczanie intasomów prototypowego wirusa piankowatego (PFV) metodą chromatografii wykluczania cząsteczkowego

Zacznij od zawiesiny zawierającej osady intasomów prototypowego wirusa pienistego (PFV), monomerów integraz, oligomerów DNA oraz agregatów białkowych.

Intasomy PFV są tetramerami integraz wirusowych w kompleksie z syntetycznymi oligomerami naśladującymi wirusowe DNA genomowe.

Dodaj roztwór soli do zawiesiny i inkubuj na lodzie. Sól zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne między intasomami, umożliwiając rozpuszczenie osadów.

Pipetuj delikatnie w regularnych odstępach czasu, aby wspomóc solubilizację intasomu.

Odwiruj próbkę, abyt sformować pellet z pozostałego osadu, a następnie zbierz nadsącz zawierający rozpuszczalne intasomy.

Należy użyć uprzednio wyrównanej kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego wypełnionej kuleczkami sieciowanej agarozy i nałożyć supernatant na kolumnę.

Ze względu na swoje duże rozmiary, agregaty białkowe i intasomy omijają pory kulek i eluują wcześniej.

Mniejsze monomeryczne integrazu i oligomery wnikają w pory kulek i eluują później.

Zabierz wczesne frakcje elucyjne zawierające intasomy do dalszych analiz.

Przygotuj dwa końce do pipet o szerokim otworze, odcinając od 2 do 4 mm z końcówki tipa 20 µL za pomocą nowej żyletki lub ostrza skalpela na czystej powierzchni. Wyjmij membranę dializacyjną z buforu do dializy. Aby zapobiec rozcieńczeniu próbki intasomu buforem do dializy, który może pozostać na końcu membrany w pobliżu zacisku, użyj mikropipety z małym końcem do usunięcia nadmiaru buforu do dializy.

Zdejmij klips z tego końca membrany dializacyjnej. Podczas odzyskiwania kompleksu ważne jest zebranie jak największej ilości roztworu i osadu. Użyj końcówki do pipety o szerokim otworze, aby przenieść próbkę, wliczając w to osad, z wnętrza membrany dializacyjnej do probówki o pojemności 1,5 mililitra umieszczonej na lodzie.

Zanotuj całkowitą objętość odzyskanego materiału. Objętość całkowita wynosi zazwyczaj około 140 µL. Próbka z osadem zawiera 20 mM NaCl.

Zwiększ stężenie soli do końcowego stężenia 320 mM chlorku sodu, dodając odpowiednią objętość roztworu zapasowego 5 M NaCl. Przenieś wiadro z lodem wraz z próbką do chłodni o temperaturze 4 ˚C. Użyj końcówki do pipety o szerokim otworze, aby resuspender i rozpuścić osad poprzez pipetowanie.

Powtarzać co 20 minut przez co najmniej jedną godzinę. Większość osadu powinna przejść do roztworu. Aby oczyścić intasom, należy zrównoważyć kolumnę do chromatografii wykluczania żelowego (SEC) z sieciowanej agarozy za pomocą buforu do SEC przy szybkości przepływu 0,4 milliliters per minute.

Odwiruguj próbkę intasomu w mikrowirówce przy 14,0 ×g przez 10 min w temperaturze 4 ˚C, aby wytrącić resztki osadu. Po ostrożnym usunięciu naddatku nanieś go na pętlę wtryskową o pojemności 20 µL. Nałóż próbkę na kolumnę SEC.

Eluuj 25 mL buforu do SEC i zbierz 95 frakcji po 270 µL każda. Zauważ, że chromatogram SEC wykazuje trzy piki A280 i A260.