Pozyskiwanie cząsteczek wirusa zapalenia wątroby E z ludzkich komórek raka wątroby

Rozpocznij od hodowli ludzkich komórek raka wątroby przetransfekowanych RNA wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) w celu produkcji cząsteczek wirusowych.

Niektóre cząsteczki HEV nabywają pochodzącą od gospodarza błonę endosomalną i opuszczają komórkę, podczas gdy inne pozostają wewnątrz niej jako nieotoczkowane cząsteczki HEV.

Aby zebrać zewnątrzkomórkowe HEV, należy zebrać i przefiltrować nadsącz z hodowli w celu usunięcia resztek komórkowych.

Przechowywać w ultra-niskiej temperaturze, aby zachować zakaźność.

Aby zebrać wewnątrzkomórkowe cząstki HEV, należy przemyć komórki buforem.

Dodaj trypsynę-EDTA, aby odkleić komórki, a następnie dodaj pożywkę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.

Przenieś zawiesinę do probówki i odwiruj.

Odlać nadsącz zawierający pozostałości trypsyny. Resuspendować osad i przenieść go do probówki.

Zamrozić komórki w ciekłym azocie, a następnie rozmrozić je na lodzie.

Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować komórki i uwolnić wirusy.

Odwiruj próbkę, zbierz supernatant zawierający wirusy i przechowuj w ultra niskiej temperaturze.

Szóstego dnia przefiltruj nadsącz przez membranę o wielkości oczek 0,45 µm w celu usunięcia resztek komórkowych, a zebrany z hodowli komórkowej zewnątrzkomórkowy wirus zapalenia wątroby E przechowuj w temperaturze 4 °C. Aby zebrać wewnątrzkomórkowe cząstki wirusa zapalenia wątroby E z hodowli komórkowej, przemyj komórki PBS i odseparuj je za pomocą 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C. Po odseparowaniu komórek przerwij reakcję, dodając 8,5 ml DMEM, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml w celu wirowania.

Do poszczególnych probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml dodać 1,6 ml kompletnej pożywki DMEM na każdą elektroporację i wykorzystać 800 µl pożywki do resuspensji komórek, przenosząc je w ten sposób do probówek. Komórki zamrozić w ciekłym azocie, a następnie trzykrotnie rozmrozić na lodzie, po czym powstałe lizaty wirować z dużą prędkością przez 10 minut przy 10 000 ×g. Następnie przenieść nadsączniki do nowych probówek, nie naruszając osadów z debris komórkowym, i przechowywać w temperaturze -80 °C.