Oczyszczanie wirusa z płynu alantoicznego zarodkowych jaj kurzych

Zacznij od zbiornika zawierającego płyn alantoidalny pobrany z zarażonych wirusem jaj kurzych.

Płyn ten zawiera cząstki wirusa oraz zanieczyszczenia pochodzące od gospodarza.

Przepuść płyn przez filtr głębinowy, aby wychwycić duże zanieczyszczenia, umożliwiając jednocześnie przejście mniejszych zanieczyszczeń oraz wirusów.

Następnie przelej przefiltrowany płyn do systemu filtracyjnego, w którym przepływa on tangencjalnie przez powierzchnię membrany.

Mniejsze zanieczyszczenia przenikają przez membranę, podczas gdy wirus jest zatrzymywany i zagęszczany.

Nałóż skoncentrowany wirus na gradient gęstości i poddaj go wirowaniu. Wirus tworzy wyraźny prążek w miejscu, w którym jego gęstość odpowiada gęstości gradientu.

Zebrać pas bogaty w wirusy do kasety dializacyjnej i umieścić go w buforze. Składniki gradientu dyfundują na zewnątrz, podczas gdy woda z buforu dyfunduje do wewnątrz poprzez błonę półprzepuszczalną.

Następnie umieść kasetę w roztworze hipertonicznym, aby odciągnąć wodę i skoncentrować oczyszczony wirus.

W celu oczyszczania wirusa choroby Nowego Zamku (NDV) należy najpierw przygotować wcześniej skonfigurowany układ eksperymentalny, przepuszczając przez niego 50 mililitrów PBS.

Zatrzymaj pompę, gdy w probówce pozostanie około pięciu mililitrów PBS. Następnie do rurki podłącz filtr głębinowy o stopniu zatrzymania od jednego do trzech mikromolarni. Aby odpowietrzyć filtr, zdejmij drugą zatyczkę ze strony szczytowej filtra głębinowego, a następnie przepuść przez układ dodatkowe 50 mililitrów PBS.

Gdy PBS zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający na górze filtra, zamknij port i kontynuuj przepływ PBS przez linie. Następnie zastąp naczynie na odpady nowym sterylnym naczyniem zbiorczym i rozpocznij przepuszczanie płynu alantoicznego przez filtr głębinowy. W kolejnym kroku skonfiguruj system filtracji stycznej (TFF) w konfiguracji otwartej i przeprowadź proces zgodnie z opisem zawartym w manuskrypcie.

Gdy w zbiorniku pozostanie około pięciu mililitrów płynu, zatrzymaj pompę i dolej do zbiornika płynu allantoicznego poddanego filtracji wgłębnej. Następnie wznów przepływ pompy. Aby zapobiec ścinaniu wirusa, ważne jest, aby ciśnienie w systemie nie przekroczyło 10 pound force per square inch.

Aby zwiększyć eluowanie, należy zastosować kombinację prędkości pompy perystaltycznej i zacisków śrubowych. Gdy w zbiorniku pozostanie od 150 do 100 ml płynu alantoisowego, należy zatrzymać pompę i wymienić bufor, dodając od 150 do 200 ml buforu ML. Ponownie zatrzymaj pompę, gdy w zbiorniku zostanie od pięciu do 10 ml płynu, a następnie za pomocą dwóch zacisków śrubowych zamknij linie odpływowe.

Odłącz linię retentatu zasilającą zbiornik i umieść ją w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie wznowij przepływ i zatrzymaj go, gdy w zbiorniku pozostanie tylko kilka kropel cieczy. Następnie zdejmij zaciski C z linii odpływowych i ponownie podłącz linię zasilającą retentatu do zbiornika.

W międzyczasie, aby przygotować się do ultracentryfugacji w gradiencie gęstości iodixanolu, należy najpierw dodać 0.5 milliliters 40% iodixanolu do cienkościennej probówki do ultracentryfugacji o otwartej górze o pojemności 13.2 milliliter. Następnie przygotowuje się kolumnę poprzez sukcesywne dodawanie 2.5 milliliters 20% iodixanolu oraz 2.5 milliliters 10% iodixanolu. Przed ultracentryfugacją, ostrożnie dodaje się od sześciu do 6.5 milliliters roztworu wirusa eluowanego z systemu TFF do kolumny z iodixanolem, tak aby nie zaburzyć gradientu.

Po ultrawirowaniu wyjmij probówki za pomocą sterylnej pęsety. Docelowy prążek powinien być wyraźnym pasmem pomiędzy gradientami 10 i 20%. Następnie zawieś probówkę nad zlewką, używając statywu laboratoryjnego.

Następnie do strzykawki o pojemności pięciu mililitrów przymocuj igłę o długości 1,5 cala i rozmiarze 18 G, a następnie przebij igłą ściankę probówki do ultrawirówki i pobierz docelowy prążek, powoli wysuwając tłok. Po usunięciu jodiksanolu z roztworu wirusa zgodnie z opisem w manuskrypcie, użyj strzykawki, aby ostrożnie wstrzyknąć wirusa do kasety dializacyjnej. Aby zagęścić roztwór wirusa, wyjmij kasetę dializacyjną z buforu dializacyjnego i umieść ją w małej, szczelnie zamykanej plastikowej torebce.

Następnie należy dodać do worka od 15 do 25 mililitrów 40% polyethyleneglycol, tak aby kaseta do dializy była całkowicie zanurzona.