Przeprogramowanie ludzkich komórek krwi w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą wirusa Sendai

Pobrać kulturę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) człowieka.

Dodać wirusa Sendai kodującego czynniki transkrypcyjne reprogramujące. Przykryć i szczelnie zamknąć płytkę.

Wirówka w celu zwiększenia kontaktu wirusa z komórkami, a następnie inkubacja.

Po fuzji wirusa, wirusowe RNA wykazuje ekspresję czynników transkrypcyjnych, które aktywują komórkowe geny pluripotencji i represują geny specyficzne dla danej linii komórkowej, aby zainicjować reprogramowanie.

W tym czasie podgrupa transdukowanych PBMC przekształca się w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) i wykazuje ekspresję białek adhezyjnych.

Przenieś je do dołka pokrytego matrycą i odwiruj komórki. Zastąp nadsącz pożywką wzrostową.

Po inkubacji iPSC przylegają do macierzy, podczas gdy transdukowane nieprylegające PBMC pozostają w zawiesinie.

Przenieś zawiesinę do powleczonego dołka i odwiruj. Dodaj pożywkę do pierwotnego dołka i inkubuj obie próbki.

Pozostałe przetransdukowane PBMC rozpoczynają reprogramowanie, przekształcają się w iPSC i przylegają do podłoża. Krok ten maksymalizuje retencję reprogramowanych komórek.

Wymieniaj pożywkę codziennie, aby podtrzymać wzrost iPSC.

W tej procedurze należy przenieść komórki krwi do 15-mililitrowej probówki stożkowej i policzyć je za pomocą hemocytometru. Następnie przygotować 3 x 10⁵ komórek do transdukcji i odwirować je przy 515 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć nadosadziny za pomocą odsysacza i resuspendować komórki w 0,5 ml pożywki dla komórek krwi. Potem przenieść komórki do dołka niepowlekanej płytki 24-dołkowej. Odmrozić mieszaninę wirusa Sendai na lodzie i dodać ją do zawiesiny komórek.

Uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i wiruj ją przy 1 150 ×g przez 30 min w temperaturze 30 °C. Po wirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. Aby pokryć płytkę 24-dołkową witronektyną, następnego dnia rozcieńcz roztwór witronektyny w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 µg/ml.

Następnie dodaj jeden mililitr witronektyny do dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Po tym czasie usuń roztwór powlekający i przenieś całą pożywkę zawierającą komórki i wirusa do powleczonego dołka. Następnie zbierz pozostałe komórki, dodając 0,5 mililitra świeżej pożywki do komórek krwi, i przenieś je do dołka z komórkami.

Następnie wiruj płytkę przy 1 150 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 35 °C, a potem inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. Do drugiego przeniesienia komórek pokryj studzienkę witronektyną w stężeniu 5 µg/ml, zgodnie z wcześniejszym opisem. Użyj jednej studzienki płytki dla każdej transdukcji i przenieś zawiesinę komórkową z pierwszej płytki na nowo pokrytą witronektyną płytkę.

W międzyczasie, w celu utrzymania hodowli, dodaj 1 ml pożywki iPSC do dołka pierwszej płytki i inkubuj w temperaturze 37 °C w 5% CO2, wymieniając codziennie pożywkę na świeżą pożywkę iPSC. Kolonie pojawią się od 14. do 21. dnia po transdukcji. Nowo pokrytą płytkę zawierającą zawiesinę komórek wiruj przy 1 150 ×g w temperaturze 35 °C przez 10 min.

Po wirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc. Następnego dnia usunąć nadsącz i zastąpić go świeżą pożywką do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Hodować przytwierdzone komórki, codziennie wymieniając pożywkę, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.