Analiza internalizacji wirusa grypy z wykorzystaniem testu blokowania streptawidyną

Zacznij od probówek zawierających ludzkie komórki nabłonka płuc.

Dodaj biotynilowane wirusy grypy i inkubuj na lodzie. Wirusy wiążą się z powierzchnią komórek, nie ulegając internalizacji.

Odwirować, aby oddzielić komórki z przywiązanym wirusem, usunąć nadsącz i resuspenderować.

Do probówki z punktu czasowego zero dodać nieoznaczoną streptawidynę, która wiąże się z biotynylowanymi wirusami, tworząc kompleksy.

Dodaj znakowaną fluorophorem streptawidynę, która nie wiąże się z kompleksem wirusa streptawidyna-biotyna. Przemyj i utrwal komórki.

Inkubuj probówkę z późniejszym punktem czasowym w wyższej temperaturze, aby umożliwić internalizację wirusa, a następnie przenieś ją z powrotem na lód.

Dodać nieznakowaną streptawidynę oraz środek blokujący internalizację, który zapobiega dalszemu pobieraniu wirusa, a następnie inkubować. Streptawidyna wiąże biotynilowane wirusy związane z powierzchnią, po czym należy przeprowadzić etapy płukania.

Utrwal komórki i dodaj bufor zawierający detergent, aby je permeabilizować.

Przemyć i dodać znakowaną fluoroforem streptawidynę, która wnika do komórek i wiąże się z biotyną.

Przeanalizuj próbki metodą cytometrii przepłyewej.

Wyższa fluorescencja w późniejszym punkcie czasowym potwierdza pomyślną internalizację wirusa.

Po powtórzeniu płukania jeszcze raz, schłodź probówki na lodzie przez 10 minut. Po schłodzeniu probówek ponownie odwiruj je i użyj 10 µL biotynilowanego wirusa rozcieńczonego w PBS do infekcji, aby resuspenderać osady po inkubacji na lodzie przez jedną godzinę; powtórz wirowanie i dwa razy wypłucz PBS, przetwarzając kolejne próbki w możliwie największym stopniu równolegle w przypadku próbek z punktu zero minut.

Aby opracować próbki z czasu zero minut z dodatkiem STV, odwiruj probówki, usuń nadsącz i użyj 15 µL STV w 2% BSA i 0,1% azotku sodu w PBS, aby resuspender osad komórkowy. Inkubuj na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj i użyj PBS do dwukrotnego przemycia komórek po utrwaleniu PFA w sposób przedstawiony powyżej, a następnie przechowuj próbki w temperaturze 4 °C.

W przypadku próbek inkubowanych przez 30 minut plus STV: po odwirowaniu osadu, zawiesić ponownie próbki w 20 µL PBS z 2% BSA, po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Odwirować i resuspenderaj komórki w 50 µL STV 2% BSA 0,1% Sodium azide w PBS, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut przed przemyciem i utrwaleniem. Następnie, po permeabilizacji i barwieniu wszystkich próbek STV-Cy3 zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Na koniec przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej.