Ocena hamowania wzrostu bakterii przez bakteriofagi za pomocą pomiarów gęstości optycznej

Zacznij od płytki wielodobkowej zawierającej seryjne rozcieńczenia zawiesiny fagów w bogatym pożywce jako grupę badawczą oraz pożywkę bez fagów jako grupę kontrolną.

Dodaj E. coli do każdej studzienki. Za pomocą spektrofotometru zmierz bazową gęstość optyczną (OD), aby odnotować początkowe stężenie bakterii.

Następnie inkubuj płytkę, aby umożliwić wzrost bakterii i infekcję fagową.

W próbce kontrolnej bakterie wykorzystują składniki odżywcze i namnażają się, co powoduje wzrost OD.

W trakcie działania fagi wiążą się z receptorami powierzchniowymi bakterii i wstrzykują swoje genomy do cytoplazmy.

Wykorzystując mechanizmy komórki gospodarza, genom wirusa replikuje się i produkuje białka wirusowe, które łączą się w nowe cząstki wirusowe. Cząstki te lizuja komórkę, uwalniając potomstwo.

Pomiar OD w określonych odstępach czasu w celu porównania wzrostu bakterii.

Studzienki kontrolne wykazują stopniowy wzrost OD, podczas gdy studzienki traktowane fagami wykazują niższe wartości OD, przy czym większe spadki obserwuje się przy wyższych stężeniach fagów.

Pomaga to określić stężenie fagów wymagane do maksymalnego zahamowania wzrostu bakterii.

W pierwszej kolejności przygotuj test na mikropłytce, używając końcówek z filtrem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Najpierw wlej 180 µL mTSB do studzienek w kolumnach od 1 do 12 na mikropłytce 96-dołkowej. Następnie w kolumnach od 1 do 8 sterylnej mikropłytki 96-dołkowej przygotuj seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne każdego faga w celu przeprowadzenia analizy. Dodaj 20 µL poszczególnych fagów lub koktajli fagowych do studzienek od 1 do 8 w górnym rzędzie A mikropłytki.

W przypadku kontroli bez bakteriofagów i kontroli pustej, dodaj 20 µL mTSB do górnej studni kolumn od dziewiątej do dwunastej. Podczas pipetowania wymieszaj zawartość studni poprzez delikatne i wielokrotne zasysanie co najmniej pięć razy, zmieniając końcówki między rozcieńczeniami. Pobierz 20 µL z ostatniego rzędu H, a następnie przygotuj rezerwuar dla badanego szczepu bakteryjnego, przenosząc od dwóch do trzech ml rozcieńczonej kultury do rezerwuaru za pomocą pipety o objętości jednego ml.

Używając pipety wielokanałowej, dodaj 20 µL rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdej studni w kolumnach od pierwszej do dziesiątej, zmieniając końcówki po każdym dodaniu. Przykryj i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 °C. W odstępach dwugodzinnych wyjmuj mikropłytkę z inkubatora i odczytaj ją za pomocą czytnika mikropłytek.

Alternatywnie można inkubować płytkę w czytniku mikropłytek i odczytywać wyniki w czasie.