Znakowanie replikujących się genomów HSV-1 analogiem nukleozydowym

Należy pobrać hodowlę komórek ssaków w fazie stacjonarnej z minimalną replikacją DNA i zebrać medium warunkujące.

Dodaj wirusa opryszczki (HSV) i inkubuj, okresowo wstrząsając, aby umożliwić przyleganie wirusa. Przemyj, aby usunąć niezwiązany wirus i przywróć pożywkę warunkującą.

Po inkubacji wirus łączy się z błoną gospodarza, uwalniając nukleokapsyd do cytoplazmy.

Wirusowe dsDNA wnika do jądra komórkowego, ulega cyrkularyzacji i wykazuje ekspresję białek wirusowych niezbędnych do replikacji wirusowego DNA.

Białka wirusowe i gospodarza rozplatają wirusowe DNA i syntetyzują starter RNA. Następnie kompleks wirusowej polimerazy DNA wiąże się ze starterem i wydłuża go w celu syntezy DNA.

W miarę postępu replikacji do hodowli należy dodać analog nukleozydowy. Przedostaje się on do komórek i zostaje przekształcony w formę trifosforanową.

Z uwagi na minimalną replikację DNA gospodarza, analog jest preferencyjnie wbudowywany w replikujące się wirusowe DNA, co prowadzi do znakowania genomów wirusowych.

Znakowane genomy wirusowe są gotowe do dalszej analizy proteomicznej powiązanych z nimi białek.

Należy rozpocząć tę procedurę od hodowli komórek MRC-5 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następn