Znakowanie replikujących się genomów HSV-1 analogiem nukleozydowym

Należy pobrać hodowlę komórek ssaków w fazie stacjonarnej z minimalną replikacją DNA i zebrać medium warunkujące.

Dodaj wirusa opryszczki (HSV) i inkubuj, okresowo wstrząsając, aby umożliwić przyleganie wirusa. Przemyj, aby usunąć niezwiązany wirus i przywróć pożywkę warunkującą.

Po inkubacji wirus łączy się z błoną gospodarza, uwalniając nukleokapsyd do cytoplazmy.

Wirusowe dsDNA wnika do jądra komórkowego, ulega cyrkularyzacji i wykazuje ekspresję białek wirusowych niezbędnych do replikacji wirusowego DNA.

Białka wirusowe i gospodarza rozplatają wirusowe DNA i syntetyzują starter RNA. Następnie kompleks wirusowej polimerazy DNA wiąże się ze starterem i wydłuża go w celu syntezy DNA.

W miarę postępu replikacji do hodowli należy dodać analog nukleozydowy. Przedostaje się on do komórek i zostaje przekształcony w formę trifosforanową.

Z uwagi na minimalną replikację DNA gospodarza, analog jest preferencyjnie wbudowywany w replikujące się wirusowe DNA, co prowadzi do znakowania genomów wirusowych.

Znakowane genomy wirusowe są gotowe do dalszej analizy proteomicznej powiązanych z nimi białek.

Należy rozpocząć tę procedurę od hodowli komórek MRC-5 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć HSV-1 w zimnym roztworze soli buforowanej trissolo-TBS. W kolejnych krokach ważne jest wyłączenie nawiewu i dygestorium do hodowli tkanek, aby zapobiec wysychaniu komórek.

Za pomocą pipety przenieś pożywkę wzrostową z komórek MRC-5 do sterylnej butelki, aby dodać ją ponownie do komórek po infekcji. Zainfekuj komórki, dodając do nich siedem mililitrów rozcieńczonego wirusa. Kołysz komórki co 10 minut przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po adsorpcji odessać inokulum, przemyć komórki 50 ml TBS o temperaturze pokojowej i przywrócić pierwotną pożywkę wzrostową. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% dwutlenku węgla. Po rozpoczęciu replikacji wirusowego DNA, około czterech godzin po infekcji, przeprowadzić znakowanie replikującego się wirusowego DNA.

Aby to zrobić, należy rozcieńczyć EdC w jednym mililitrze medium wzrostowego i dodać je do medium hodowlanego zainfekowanych komórek na dwie do czterech godzin.