Izolacja białek z kompleksów DNA wirusowego z białkami

Należy pobrać jądra komórkowe zawierające genomy wirusowe, znakowane nukleotydami zmodyfikowanymi alkinią.

Zawiesić jądra w mieszaninie biotyny-azydku i jonów miedzi, a następnie inkubować.

Jon miedzi wspomaga tworzenie wiązania kowalencyjnego między grupą azydkową a alkinową.

Odwiruj i odlej nadsącz.

Resuspendować w buforze, przenieść i odwirować w celu utworzenia osadu.

Szybko zamrozić, a następnie rozmrozić osad, aby ułatwić lizę.

Resuspenduj i poddaj sonikacji w celu lizy jąder komórkowych.

Odwirować i zebrać nadsącz zawierający kompleksy białko-viralne DNA.

Przefiltruj nadsącz, aby usunąć zanieczyszczenia.

Rozcieńczyć filtrat.

Dodać magnetyczne kulki pokryte streptawidyną i inkubować w celu ułatwienia wiązania z biotynilowanymi kompleksami białko-DNA.

Zastosuj pole magnetyczne, aby zebrać kuleczki, a następnie wypłucz je w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Powtórz płukanie.

Dodaj bufor eluujący i podgrzej w celu oddzielenia i denaturacji białek.

Oddziel koraliki i zbierz eluat.

Szybko zamroź wyizolowane białka. Przechowuj w ultra-niskich temperaturach do dalszych analiz.

Po całkowitym usunięciu PBS, ponownie zawiesić pellet jąder komórkowych w 10 ml mieszaniny do reakcji click, delikatnie pipetując w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety 10 ml. Próbkę rotować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zcentryfugować jądra komórkowe w opisany wcześniej sposób.

Całkowicie usuń mieszaninę z reakcji click, a następnie przemyj osad, delikatnie resuspendując go w 10 ml PBS i ponownie wirując. Teraz ostrożnie resuspenduj osad jądrowy w 1 ml PBS i przenieś roztwór do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Po wirowaniu całkowicie usuń PBS i zamroź osad błyskawicznie w ciekłym azocie.

Na tym etapie osad można przechowywać w temperaturze 80 °C lub kontynuować procedurę. Aby zlizować jądra komórkowe i pofragmentować DNA, zawiesić rozmrożone jądra w 500 µL Buforu B1, pipetując w górę i w dół. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 45 minut.

Następnie poddaj próbki sonikacji sześć razy po 30 sekund każda przy amplitudzie 40%, używając sondy z mikrokońcówką o średnicy trzech milimetrów. Między impulsami umieszczaj próbki na lodzie przez co najmniej 30 sekund. Po sonikacji próbki powinny być przejrzyste, a nie mętne.

Odwirować szczątki komórkowe, wirując z prędkością 14 000 x G przez 10 minut w temperaturze four degrees celsius. Wielkość osadu powinna ulec znacznemu zmniejszeniu; przefiltrować nadsącz przez sitko komórkowe o rozmiarze 100 micron i zebrać filtrat. Następnie do przefiltrowanego nadsączu dodać 500 microliters Buforu B2.

Aby związać biotynilowane DNA z kuleczkami pokrytymi streptawidyną, przygotuj magnetyczne kuleczki streptawidynowe, przenosząc 300 µL zawiesiny kuleczek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj jedną probówkę z kuleczkami na każdą próbkę. Przemyj kuleczki trzykrotnie 1 ml Buforu B2, mieszając w wirówce w celu ponownego zawieszenia, przykładając magnes w celu oddzielenia kuleczek i odsysając bufor do mycia.

Następnie dodać 900 µL próbki do wypłukanych kuleczek. Pozostała część próbki zostanie wykorzystana do izolacji DNA i białek wejściowych. Zawiesinę rotować przez noc w temperaturze 4 °C.

Następnego dnia umieść próbki w statywie magnetycznym do probówek do mikrowirówki i usuń nadsącz. Ostrożnie resuspenduj kuleczki w 1 mL Buforu B2, a następnie inkubuj w rotacji w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ponownie usuń nadsącz, korzystając ze statywu magnetycznego do probówek do mikrowirówki.

Tym razem delikatnie resuspenduj kuleczki w 1 ml Buforu B3 i inkubuj w rotacji w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po usunięciu nadsączu z mieszaniny kuleczek przy użyciu magnesu, resuspenduj kuleczki w 50 µl 2x buforu do próbek Laemmli, aby eluować kompleksy białkowo-DNA. Następnie gotuj próbki w temperaturze 95 °C przez 15 minut.

Wymieszaj zawiesinę za pomocą vortexa, a następnie szybko odwiruj próbki w mikrowirówce. Umieść próbki na magnesie i przenieś eluat do nowej probówki. Na koniec zamroź szybko próbki i przechowuj je w temperaturze 80 degrees celsius.

Przeprowadź analizę białek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.