Wydrukowane w 3D urządzenie pokryte silikonem do modelowania infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem

Weź wielodołkową płytkę zawierającą sterylny ludzki mocz.

Zaszczepić studzienki testowe bakteriami. Studzienki kontrolne zawierają sam mocz.

Weźmy wydrukowane w 3D, pokryte silikonem urządzenie naśladujące wewnętrzną powierzchnię cewnika, gdzie podczas infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem rozwijają się biofilmy.

Umieść go w studzienkach, uszczelnij płytkę i inkubuj.

Bakterie przyczepiają się do powierzchni urządzenia, wykorzystują składniki odżywcze z moczu i tworzą biofilmy.

Wypłucz urządzenie buforem, aby usunąć luźno związane bakterie.

Umieść urządzenie na wielodołkowej płytce zawierającej fiolet krystaliczny, który oddziałuje z biofilmem, aby go zabarwić.

Spłucz wodą i wysusz.

Zanurz urządzenie w wielodołkowej płytce zawierającej roztwór kwasu, aby przerwać interakcje barwnik-biofilm i uwolnić barwnik do roztworu.

Zmierzyć absorbancję roztworów w każdym studzience za pomocą spektrofotometru.

Wyższa absorbancja w studzienkach testowych w porównaniu do studzienek kontrolnych potwierdza tworzenie się biofilmu na urządzeniu, wskazując na jego przydatność do modelowania infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem.

Na początek pobierz zbiorczą próbkę moczu ludzkiego. Podaniec 135 mikrolitrów zebranego moczu ludzkiego do każdej studzienki testowej na 96-dołkowej płytce zgodnie z wyznaczonym układem.

Zaszczepić każdą studzienkę testową 15 mikrolitrami znormalizowanej nocnej kultury bakteryjnej, aby uzyskać końcową objętość 150 mikrolitrów na studzienkę. Zarezerwować co najmniej 100 mikrolitrów tej kultury do kolejnych etapów walidacji rozcieńczania szeregowego.

Przygotuj studzienki kontroli ujemnej, dodając 150 mikrolitrów sterylnego skutera moczu ludzkiego do wyznaczonych studzienek.

Teraz włóż kołki do odpowiednich dołków. Dociśnij pokrywkę kołka, aż przylega równo do płytki i zabezpiecz ją pokrywką mikropłytki, w razie potrzeby przyklejając ją taśmą.

Następnie umieść modele kołków w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku lub torbie zawierającej wilgotną niebieską rolkę, aby zapobiec parowaniu. Inkubować statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W celu walidacji inokulum, podwielokrotność 180 mikrolitrów PBS należy umieścić w rzędach od 2 do 6 pierwszej kolumny 96-dołkowej płytki przed dodaniem zarezerwowanej kultury.

Teraz przenieś 20 mikrolitrów z pierwszego dołka do drugiego dołka, delikatnie mieszając, pipetując w górę iw dół. Kontynuować seryjne rozcieńczenia, aż początkowe inokulum zostanie rozcieńczone do ostatniego dołka.

Następnie rozsiać plamki o pojemności 10 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia na odpowiednich podłożach stałych w trzech egzemplarzach. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza policz kolonie z każdego miejsca.

W celu ilościowego określenia biofilmu należy wyjąć model kołka z mikropłytki i odwrócić go pod płomieniem lub w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego, z kołkami skierowanymi do góry. Wyrzuć zużyte mikropłytki.

Przenieść pokrywkę kołka na świeżą mikropłytkę zawierającą 180 mikrolitrów podwielokrotności sterylnego PBS w celu spłukania nieprzylegających komórek.

Następnie, pracując w aseptyce, umieść sterylny szklany stojak na probówki na stole i przymocuj zamontowany blat stojaka, który przytrzymuje pokrywę kołka.

Za pomocą mikropipety wlej 600 mikrolitrów sterylnego PBS do każdej probówki. Teraz włóż pokrywkę kołka do stojaka, upewniając się, że kołki są wyrównane z probówkami. Usuń taśmę autoklawu z pokrywy.

Użyj sterylnych kleszczyków, aby wepchnąć każdy kołek przez pokrywkę do probówek bezpośrednio poniżej. Następnie załóż nasadki probówek i wiruj każdą probówkę przez 60 sekund, aby usunąć komórki związane z biofilmem.

Usuń 100 mikrolitrów z każdej wirowanej probówki i wykonaj seryjne rozcieńczenia w sterylnym PBS, tak jak poprzednio.

Aby zabarwić komórki fioletem krystalicznym, należy odpipetować 180 mikrolitrów po 0,1 procent wagowych na objętość fioletu krystalicznego w sterylnej wodzie destylowanej do 24 dołków testowych na 96-dołkowej płytce. Włóż wypłukany model kołka do odpowiednich dołków i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Po zabarwieniu usuń model kołka z płyty i wyrzuć zużytą płytkę. W czystej wannie opłucz cały model kołków pod bieżącą wodą z kranu, delikatnie mieszając.

Po 2 kolejnych praniach odwróć model kołka i pozostaw do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 180 mikrolitrów 30% kwasu octowego do nowej 96-dołkowej płytki. Włóż wysuszony model kołka do odpowiednich dołków.

Po zakończeniu inkubacji wyjmij model kołka z mikropłytki. Zmierz gęstość optyczną barwionych studzienek przy 540 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek lub spektrofotometru.