Oczyszczanie wektorów adenowirusowych zawierających genom z wykorzystaniem chlorku cezu

Rozpocznij od komórek ssaków zainfekowanych adenowirusem.

Przeprowadź wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować komórki i uwolnić wiriony.

Odwiruj lizat w celu osadzenia resztek komórkowych. Zbierz nadsącz zawierający cząstki wirusowe.

Nanieś supernatant wirusowy na skokowy gradient chlorku cezu w celu rozdziału opartego na gęstości.

Ultrawirówka umożliwiająca migrację cząstek wirusowych zgodnie z ich gęstością wypornościową.

Nienaruszone wiriony zawierające pełny genom adenowirusowy są gęstsze ze względu na zapakowane DNA i osadzają się w dolnym pasmie, natomiast lżejsze, puste kapsydy i zanieczyszczenia pozostają w górnych warstwach.

Usuń górne warstwy. Zbierz dolny prążek wirionów zawierających genom.

Resuspender wiriony w chlorku cezu o jednorodnej gęstości i ponownie poddać ultrawirowaniu, aby doprecyzować rozdział i skoncentrować pełne cząstki.

Odrzuć górne warstwy i odzyskaj dolny prążek.

Przediałyzuj próbkę, aby usunąć chlorek cezu.

Wektory adenowirusowe o wysokiej czystości zawierające genom są teraz gotowe do dalszych zastosowań.

Aby przygotować lizat wirusowy do oczyszczania w gradiencie chlorku cezu, poddaj zawiesinę komórkową z wirusem czterokrotnemu zamrażaniu i rozmrażaniu. Następnie odwiruj lizat wirusowy przy 500 ×g przez osiem minut w temperaturze pokojowej.

Następnie należy zebrać nadsącz zawierający wysokopojemne adenowirusy. Ostrożnie i powoli pipetować roztwory chlorku cezu do probówek w następującej kolejności: 0,5 ml roztworu o stężeniu 1,5 g/cm³, 3 ml roztworu o stężeniu 1,35 g/cm³ oraz 3,5 ml roztworu o stężeniu 1,25 g/cm³. Na wierzch warstwy 1,25 g/cm³ nanieść około 4,5 ml oczyszczonego nadsączu wektora.

Wirowanie gradientów należy przeprowadzić w ultrawirowarce z użyciem rotora z kątem nachylenia w temperaturze 12 stopni Celsius przez co najmniej dwie godziny przy 226,000 ×g, aby oddzielić cząstki wirusowe zawierające genom wysokiej pojemności adenowirusa od cząstek pustych i szczątków komórkowych. Po wirowaniu na górze probówek tworzy się rozproszony prążek szczątków komórkowych. Poniżej niego można zaobserwować dwa białe prążki.

Górny prążek zawiera puste cząsteczki, natomiast dolny prążek to adenowirus o wysokiej pojemności. Ostrożnie usuń warstwy szczątków komórkowych i pustych cząsteczek. Następnie pobierz jeden mililitr z dolnych prążków z każdej probówki.

Przenieś wirusa do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Do zebranych cząsteczek wirusa dodaj do 24 ml roztworu chlorku cezu o stężeniu 1,35 g/cm³ i dokładnie wymieszaj. Napełnij probówki wirówkowe do pełna roztworem wirusa w chlorku cezu o stężeniu 1,35 g/cm³.

Następnie wiruj przez noc w ultrawirówce przy 226 000 ×g w temperaturze 12 °C, używając rotora z kątem nachylenia (swing-out) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Usuń górne warstwy z wierzchu za pomocą pipety. Następnie, używając nowej końcówki do pipety, pobierz wysokowydajny adenowirus znajdujący się w wyraźnym dolnym prążku.

Na koniec przeprowadź dializę zebranych cząstek wirusa w celu wymiany buforu. Następnie wyznacz miano końcowego preparatu zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym.