JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:27 min • August 31st, 2026
Zacznij od zamrożonej tkanki recelularyzowanej wątroby szczura zawierającej ludzkie hepatocyty, zatopionej w medium do kriokonserwacji.
W tej tkance transdukowane hepatocyty wykazują ekspresję szmaragdowego zielonego białka fluorescencyjnego (EmGFP), białka reporterowego kodowanego przez wektor wirusowy.
Użyj kriostatu do wykonania cienkich przekrojów zachowujących architekturę komórkową i tkankową. Przenieś przekroje na szkiełko.
Przetraktuj skrawki łagodnym detergentem, aby spermabilizować błonę komórkową.
Nanieś przeciwciało pierwszorzędowe anty-EmGFP, które specyficznie wiąże się z fluorescencyjnym białkiem reporterowym ekspresowanym w transdukowanych komórkach.
Przemyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
Należy wprowadzić przeciwciało wtórne sprzężone z czerwonym fluoroforem, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym, a następnie przeprowadzić przemywanie.
Dodaj niebieski barwnik fluorescencyjny specyficzny dla DNA, który wiąże się z komórkowym DNA.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym kolokalizacja czerwonej fluorescencji z jądrami barwionymi na niebiesko potwierdza, że transdukowane hepatocyty w tkance wątroby skutecznie wykazują ekspresję wirusowego białka reporterowego.
Za pomocą skalpela pobierz z każdego płata wątroby wycinki o grubości około 0,5 cm i długości od 1,5 do 2 cm. Inkubuj wycinki w 4% paraformaldehydzie z 4% sacharozą przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
Następnie przemyj próbki trzy razy PBS przez jedną minutę na każdy etap płukania. Po przemyciu inkubuj próbki przez noc w 8% sacharozie w temperaturze 4 °C. Następnego dnia umieść próbki w kriofomach zawierających niewielką ilość medium utrwalającego.
Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Po załadowaniu próbki należy całkowicie przykryć je medium utrwalającym i umieścić w temperaturze -80 °C. Po zamrożeniu, przy użyciu kriostatu, należy przygotować z próbek krioprzekroje o grubości 10 µm.
Barwić próbki zgodnie z potrzebami, aby potwierdzić recelularyzację.