JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:33 min. • August 31st, 2026
Przygotować ludzką kulturę komórkową.
Dodaj lentiwirusy kodujące warunkowe shRNA celujące w mRNA gospodarza pod promotorem responsywnym na tetracyklinę połączonym z operatorem.
Lentiwirus przenosi również geny represora tetracykliny oraz białka oporności na antybiotyki, które znajdują się pod kontrolą promotora konstytutywnego.
Inkubować, aby umożliwić dostarczenie wirusowego RNA do komórek gospodarza.
RNA ulega konwersji do cDNA i integruje się z genomem gospodarza.
Przemyć, dodać pożywkę i inkubować, aby umożliwić ekspresję represora tetracykliny oraz białka oporności na antybiotyki, generując komórki przetransdukowane. Represor tetracykliny wiąże się z operatorem i hamuje ekspresję shRNA.
Przemyć, dodać pożywkę z dodatkiem antybiotyku i inkubować.
Przetransdukowane komórki wykazują ekspresję białka oporności na antybiotyk, co umożliwia ich selektywne przeżycie w obecności tego antybiotyku.
Do hodowli dodać doksycyklinę, analog tetracykliny.
Doksycyklina wiąże się z represorem tetracykliny, zapobiegając jego wiązaniu z operatorem i umożliwiając ekspresję shRNA.
shRNA jest przetwarzane do siRNA, które ładuje się do kompleksu RISC i degraduje docelowy mRNA.
W ten sposób uzyskuje się komórki z
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych