Generowanie komórek z warunkowym wyciszeniem genu z wykorzystaniem tetracyklinowo-responsywnego lentiwirusego systemu ekspresji shRNA

Przygotować ludzką kulturę komórkową.

Dodaj lentiwirusy kodujące warunkowe shRNA celujące w mRNA gospodarza pod promotorem responsywnym na tetracyklinę połączonym z operatorem.

Lentiwirus przenosi również geny represora tetracykliny oraz białka oporności na antybiotyki, które znajdują się pod kontrolą promotora konstytutywnego.

Inkubować, aby umożliwić dostarczenie wirusowego RNA do komórek gospodarza.

RNA ulega konwersji do cDNA i integruje się z genomem gospodarza.

Przemyć, dodać pożywkę i inkubować, aby umożliwić ekspresję represora tetracykliny oraz białka oporności na antybiotyki, generując komórki przetransdukowane. Represor tetracykliny wiąże się z operatorem i hamuje ekspresję shRNA.

Przemyć, dodać pożywkę z dodatkiem antybiotyku i inkubować.

Przetransdukowane komórki wykazują ekspresję białka oporności na antybiotyk, co umożliwia ich selektywne przeżycie w obecności tego antybiotyku.

Do hodowli dodać doksycyklinę, analog tetracykliny.

Doksycyklina wiąże się z represorem tetracykliny, zapobiegając jego wiązaniu z operatorem i umożliwiając ekspresję shRNA.

shRNA jest przetwarzane do siRNA, które ładuje się do kompleksu RISC i degraduje docelowy mRNA.

W ten sposób uzyskuje się komórki z warunkowym wyciszeniem genu zależnym od doksycykliny.

Aby wytworzyć stabilne linie komórkowe, należy rozpocząć od wysiania komórek raka jelita grubego HCT-116 oraz komórek raka piersi MDA-MB-231 do płytki 12-dołkowej w zagęszczeniu 50 000 komórek na dołek.

Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, przemyć je PBS i dodać 1 mL pożywki zawierającej wirusa do każdego dołka. Następnego dnia ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa za pomocą aspiratora.

Następnie, po przemyciu komórek PBS, należy dodać pożywkę zawierającą FBS wolne od tetracykliny. Po 72 godzinach komórki należy przemyć w ten sam sposób i dodać pożywkę uzupełnioną o 1 µg/mL puromycyny w celu selekcji komórek transdukowanych wirusem. Selekcję komórek transdukowanych wirusem przeprowadza się poprzez hodowlę komórek w obecności puromycyny przez okres od 3 do 14 dni.

Zaobserwuj częściowe zabicie komórek przez puromycynę w studzienkach z komórkami transdukowanymi wirusem. Komórki nietransdukowane nie będą rosły w obecności puromycyny.

Zweryfikuj wydajność warunkowego wyciszenia (knockdown) w opornych na puromycynę komórkach raka jelita grubego HCT-116 i raka piersi MDA-MB-231 poprzez dodanie pożywki z różnymi stężeniami doksycykliny i hodowlę komórek przez 72 godziny.