JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:51 min • August 31st, 2026
Należy pobrać wektory lentiwirusowe zawierające antygen HIV-1 p24, który jest markerem białkowym wykorzystywanym do detekcji.
Dodaj detergent, aby zlizować komórki i uwolnić p24, a następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne próbki.
Należy użyć mikropłytki pokrytej przeciwciałami monoklonalnymi anty-p24 oraz środkiem blokującym w celu zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu.
Nanieś rozcieńczenia próbek oraz standardy p24 w charakterze referencji.
Inkubować, aby umożliwić interakcję p24 z przeciwciałami poprzez specyficzny epitop, a następnie usunąć niezwiązane komponenty.
Inkubować z poliklonalnymi przeciwciałami anty-p24, które wiążą się z różnymi epitopami białka p24. Usunąć wszelkie niewiązane przeciwciała.
Dodaj przeciwciała sprzężone z peroksydazą, które wiążą się z przeciwciałami poliklonalnymi. Usuń niewiązane przeciwciała.
Dodaj substrat peroksydazy, który przekształca się w barwny produkt.
Dodaj kwas, aby dezaktywować peroksydazę i ustabilizować produkt.
Zmierz absorbancję odpowiadającą intensywności koloru, która jest proporcjonalna do stężenia p24.
Wygeneruj wykres wzorcowy i oszacuj stężenia próbek, aby określić miano wirusa.
Płytkę 96-dołkową o wysokim wiązaniu pokryć 100 µL przeciwciała monoklonalnego anty-p24 w rozcieńczeniu 1:1500 zgodnie z instrukcją NIH AIDS Vaccine Program dla zestawu HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przemyć płytkę trzykrotnie 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS.
Aby uniknąć nieswoistego wiązania, zablokuj płytkę, dodając 200 µL 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzy razy przemyj płytkę 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS. Następnie przygotuj stężone i niestężone próbki wektora do stężenia końcowego 10%, rozcieńczając wektor wodą dwukrotnie destylowaną oraz Triton X-100.
Następnie przygotować standardy HIV-1, stosując dwukrotne rozcieńczenia seryjne, zaczynając od stężenia 5 ng/mL. Po rozcieńczeniu skoncentrowanych i nieskoncentrowanych próbek wektora, nanieść je na płytkę w trzech powtórzeniach i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia wypłukać płytkę, a następnie dodać 100 µL poliklonalnego przeciwciała króliczego anty-p24 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h.
Po sześciokrotnym przemyciu inkubować płytkę z przeciwciałami kozimi anty-króliczymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po wielokrotnym przemyciu inkubować płytkę z substratem peroksydazy TMB w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać 1 N kwas solny, aby zatrzymać reakcję. Następnie zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą płytkowego czytnika absorbancji.