Oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusa z transfekowanych ludzkich komórek nerkowych

Rozpocznij od lizatu komórkowego zawierającego DNA komórkowe zagregowane z białkami komórkowymi i cząsteczkami wirusowymi.

Dodać jony magnezu, a następnie nukleazę, aby aktywować enzymatyczną degradację komórkowego DNA i rozbić agregaty białkowo-DNA.

Odwiruj próbkę, aby oddzielić resztki komórkowe i zbierz nadsącz zawierający cząsteczki wirusowe.

Nanieś supernatant na nieciągły gradient jodiksanolu o stężeniach wzrastających od góry do dołu, a następnie dopełnij probówkę buforem.

Ultrawirówka do rozdzielania składników na podstawie gęstości. Cząsteczki wirusa gromadzą się na granicy między warstwą o wysokiej i średniej gęstości.

Wprowadź igłę na tym styku i zbierz cząstki wirusowe do probówki.

Należy dodać bufor zawierający składniki stabilizujące, co zapobiega agregacji cząsteczek wirusa.

Następnie przenieś roztwór do probówki z filtrem membranowym.

Wirować w celu skoncentrowania cząsteczek wirusa nad filtrem.

Dodać bufor uzupełniony o czynnik stabilizujący i ponownie odwirować, aby uzyskać oczyszczone cząsteczki wirusa.

Aby zebrać przetransfekowane komórki, należy je odczepić i zawiesić, pipetując w górę i w dół za pomocą pożywki hodowlanej. Następnie zawiesiny komórkowe należy przenieść do sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Komórki należy wirować z prędkością 500 ×g przez pięć minut.

Następnie należy dodać pięć mililitrów PBS do każdej probówki i resuspender osady komórkowe, a następnie połączyć wszystkie zawiesiny w jednej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po wirowaniu komórek przy 500 ×g przez pięć minut należy odlać nadsącz. Aby oczyścić AAV, należy resuspender osad w 10 mililitrach buforu do lizy.

Zamrozić lizat w temperaturze -80 °C lub w kąpieli z suchego lodu i etanolu. Następnie odmrozić go w temperaturze 37 °C. Mieszać lizat w wstrząsarce vortex przez jedną minutę, a następnie powtórzyć proces zamrażania i odmrażania jeszcze dwukrotnie.

Następnie do rozmrożonego lizatu należy dodać chlorek magnezu w stężeniu 1 mM. Potem dodać nukleazę do stężenia końcowego 250 jednostek na ml. Roztwór inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby rozpuścić agregaty białkowo-DNA.

Odwirować próbkę z prędkością 4 800 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Następnie zebrać nadsącz. W międzyczasie, aby przygotować 17% roztwór gradientu jodiksanolu, zmieszać 5 ml 10X PBS z 0,05 ml 1 M chlorku magnezu, 0,125 ml 1 M chlorku potasu, 10 ml 5 M chlorku sodu oraz 12,5 ml medium do gradientu gęstości.

Użyj wody, aby doprowadzić objętość całkowitą do 50 mililitrów. Po przygotowaniu roztworów gradientowych 25%, 40% i 60% zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą igły i strzykawki wprowadź pięć mililitrów 17% roztworu gradientowego do probówki polipropylenowej. Następnie dodaj po pięć mililitrów roztworów gradientowych 25%, 40% i 60%.

Nanieś lizat na wierzch gradientu. Następnie wypełnij probówkę buforem do lizy i zakorkuj ją. Wirowarkuj gradient przy 185 000 ×g i 16 °C przez 90 minut.

Po wirowaniu, używając strzykawki, pobierz 40% frakcję wirusową, wprowadzając igłę o rozmiarze 21G w miejsce styku frakcji 40% i 60%, całkowicie omijając warstwę 25%. Wymieszaj frakcję wirusową ze sterylnym roztworem polioxyetylenu polioxypropylenu w PBS, czyli kopolimerem blokowym PEG-PPG, aż do uzyskania całkowitej objętości 15 ml. Przenieś mieszaninę do probówki z filtrem o progu odcięcia masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów.

Następnie odwiruj próbkę z prędkością 2,000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Zlej roztwór z dna probówki. Następnie użyj PEG-PPG, aby dopełnić probówkę z filtrem do 15 mililitrów.

Wirować probówkę z prędkością 2,000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za pomocą wirówki przez 20 minut. Po powtórzeniu procesu ponownego napełniania i wirowania jeszcze dwukrotnie, zebrać oczyszczoną frakcję wirusa rAAV9 znajdującą się nad filtrem.