Unieśmiertelnianie komórek śródbłonka poprzez transdukcję retrowirusową onkogenów wirusowych

Należy pobrać pożywkę zawierającą cząsteczki retrowirusowe kodujące onkogeny wirusowe oraz gen oporności na antybiotyk.

Odwiruj pożywkę, aby usunąć szczątki komórkowe.

Zebrać nadsącz zawierający cząsteczki wirusa i nanieść go na hodowlę komórek śródbłonka.

Inkubować w celu umożliwienia wnikania wirusów.

Wirusowe RNA jest odwrotnie przepisywane na DNA, które integruje się z genomem gospodarza.

Gen oporności na antybiotyki produkuje białko oporności. Onkogeny produkują białka, które wiążą się z białkami supresorowymi nowotworów kontrolującymi podziały komórkowe i dezaktywują je, co przedłuża czas życia komórki.

Wymień pożywkę na świeżą pożywkę.

Inkubuj ponownie, aby zapewnić stabilną integrację viralnego DNA.

Usunąć pożywkę i wypłukać komórki.

Dodaj roztwór do dysocjacji enzymatycznej, aby odczepić komórki.

Przenieś zawiesinę komórkową, odwiruj i usuń nadsącz.

Resuspend pellet i przenieś go do kolby.

Dodać antybiotyk do pożywki.

Przeżywają jedynie komórki wykazujące ekspresję białka oporności na antybiotyk, co pozwala na selekcję komórek unieśmiertelnionych przez białka wirusowych onkogenów.

Po inkubacji przez noc zebrać pożywkę z hodowli komórek PA317 i oczyścić ją poprzez wirowanie przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pożywkę EGM z 50% konfluentnej hodowli komórek śródbłonka zastąpić 12 mililitrami oczyszczonej pożywki PA317. Inkubować komórki przez cztery godziny.

Następnie zastąp 6 mL pożywki PA317 ilością 6 mL świeżej pożywki EGM i inkubuj komórki przez noc. Po tym czasie usuń pożywkę z hodowli komórek śródbłonka i dostarcz komórkom 12 mL świeżej pożywki EGM. Kontynuuj inkubację komórek przez kolejne 48 h.

Aby przeprowadzić pasaż komórek śródbłonka, należy usunąć pożywkę i wypłukać komórki 12 mL PBS bez kationów. Następnie należy dodać 3 mL komercyjnego roztworu do dysocjacji enzymatycznej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 min. Zawiesinę komórkową należy przenieść do 15 mL probówki stożkowej i odwirować komórki przy 300 ×g przez 5 min w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu resuspenduj komórki w świeżym medium EGM i podziel zawiesinę równomiernie pomiędzy trzy kolby T75. Dostosuj objętość kultur do 12 ml EGM na kolbę. Następnie dodaj G418 do stężenia końcowego 200 µg/ml, aby wyselekcjonować transdukowane komórki śródbłonka.