Unieśmiertelnianie komórek śródbłonka poprzez transdukcję retrowirusową onkogenów wirusowych

Należy pobrać pożywkę zawierającą cząsteczki retrowirusowe kodujące onkogeny wirusowe oraz gen oporności na antybiotyk.

Odwiruj pożywkę, aby usunąć szczątki komórkowe.

Zebrać nadsącz zawierający cząsteczki wirusa i nanieść go na hodowlę komórek śródbłonka.

Inkubować w celu umożliwienia wnikania wirusów.

Wirusowe RNA jest odwrotnie przepisywane na DNA, które integruje się z genomem gospodarza.

Gen oporności na antybiotyki produkuje białko oporności. Onkogeny produkują białka, które wiążą się z białkami supresorowymi nowotworów kontrolującymi podziały komórkowe i dezaktywują je, co przedłuża czas życia komórki.

Wymień pożywkę na świeżą pożywkę.

Inkubuj ponownie, aby zapewnić stabilną integrację viralnego DNA.

Usunąć pożywkę i wypłukać komórki.

Dodaj roztwór do dysocjacji enzymatycznej, aby odczepić komórki.

Przenieś zawiesinę komórkową, odwiruj i usuń nadsącz.

Resuspend pellet i przenieś go do kolby.

Dodać antybiotyk do pożywki.

Przeżywają jedynie komórki wykazujące ekspresję białka oporności na antybiotyk, co pozwala na selekcję komórek unieśmiertelnionych przez białka wirusowych onkogenów.

Po inkubacji przez noc zebrać pożywkę z hodowli komórek PA317 i oczyścić ją poprzez wirowanie przy 300 ×g p