Oznaczanie rozmieszczenia wirusowego RNA w komórkach gospodarza za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Zacznij od preparatu na szkiełku zawierającego permeabilizowane, zainfekowane wirusem komórki gospodarza, w których wirusowe RNA są rozmieszczone pomiędzy przedziałami jądrowymi a cytoplazmatycznymi.

Należy dodać bufor przedhybrydyzacyjny i inkubować w warunkach wilgotnych.

W buforze odczynniki blokujące blokują nieswoiste miejsca wiązania, natomiast inhibitory RNazy dezaktywują RNazy i zachowują integralność RNA.

Usunąć bufor i dodać zdenaturowane, znakowane digoksygeniną sondy oligonukleotydowe komplementarne do viral RNA.

Inkubować w ciemności, aby umożliwić hybrydyzację sondy z RNA, a następnie wielokrotnie przemyć.

Dodaj utrwalacz, aby ustabilizować hybrydy sonda-RNA, a następnie wielokrotnie przemyj próbkę. Dodaj bufor z dodatkiem detergentu, aby utrzymać przepuszczalność komórek.

Dodaj przeciwciało anty-digoksygeniniowe sprzężone z zielonym fluoroforem, które oddziałuje z digoksygeniną, a następnie kilkakrotnie przemyj.

Utrwal komórki, aby zachować kompleksy, a następnie ponownie je przemyj.

Dodaj barwnik wiążący się z DNA w celu zabarwienia jąder komórkowych. Wielokrotnie wypłucz nadmiar barwnika.

Przykryć szkiełkiem podstawowym i uszczelnić.

Pod mikroskopem konfokalnym zwizualizuj zieloną fluorescencję, odzwierciedlającą rozkład wirusowego RNA pomiędzy jądrem a cytoplazmą komórki gospodarza.

Po trzech przemyciach w roztworze PBS, zgodnie z instrukcją, ponownie utrwal próbki w 4% formaldehydzie w PBS przez 10-15 minut, a następnie przeprowadź drugą permeabilizację, zgodnie z instrukcją. Następnie przykryj preparat folią aluminiową, aby zachować sygnał fluorescencyjny i zapobiec fotoblaknięciu.

Następnie komórki należy przemyć 2x roztworem soli i cytrynianu sodu (saline sodium citrate), a potem nanieść 45 µL roztworu hybrydyzacyjnego. Po jednej godzinie w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej należy dodać wodę destylowaną do wybranych oligosonukleotydów antysensownych, aby objętość do denaturacji wyniosła 10 µL. Oligonukleotydy należy denaturować w temperaturze 95 °C przez pięć minut, a następnie dodać 35 µL świeżego roztworu hybrydyzacyjnego na każdy preparat.

Następnie inkubować próbki przez 10-24 h w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C, zabezpieczając je folią. Następnego dnia przemyć komórki dwukrotnie przez 10 min roztworem 2X saline sodium citrate w temperaturze pokojowej, a następnie raz przez 10 min roztworem 1X saline sodium citrate w temperaturze 25 °C.

Po ostatnim przemyciu utrwal komórki za pomocą schłodzonego 4% formaldehydu w PBS przez 10-15 minut na lodzie, a następnie przemyj trzykrotnie świeżym PBS. Następnie przeprowadź permeabilizację próbek zgodnie z instrukcją, a potem inkubuj je z przeciwciałami anty-digoksygenina-FITC oraz schłodzonym 0,1% BSA w PBS przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji przemyj preparaty trzykrotnie świeżym PBS i utrwal próbki za pomocą schłodzonego 4% paraformaldehydu w PBS przez 10-15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po trzech przemyciach w PBS, należy barwić jądra komórkowe za pomocą DAPI w stężeniu 0,4 µg/mL oraz schłodzonego 0,5% Triton-X w PBS przez 15 minut na lodzie, a następnie przeprowadzić trzy końcowe przemycia w PBS. Preparaty należy zamontować z użyciem kulek fluorescencyjnych, zgodnie z wymaganiami eksperymentu, w odpowiednim medium montażowym. Po usunięciu nadmiaru medium montażowego sterylnymi chusteczkami, każde szkiełko z zakrytym preparatem należy uszczelnić kilkoma warstwami bezbarwnego lakieru do paznokci, a następnie użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić prawidłowy przebieg eksperymentu.

Następnie można wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zebrać obrazy próbek w czasie od godziny do tygodnia od ich zamontowania, przy powiększeniu 630x.