Oczyszczanie wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa

Należy rozpocząć od przefiltrowanego lizatu komórkowego zawierającego wektory wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) oraz zanieczyszczenia pochodzące od gospodarza.

Przepuść lizat przez kolumnę powinowactwa opartą na heparynie.

Białka kapsydu wirusa wiążą się elektrostatycznie z ujemnie naładowanymi grupami heparyny.

Przepłucz kolumnę buforem w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń.

Nanieś bufor zawierający detergent, aby rozpuścić szczątki błonowe.

Ponownie przepłucz buforem bez detergentu.

Wprowadź bufor uzupełniony kationami w celu stworzenia środowiska jonowego, a następnie przemyj kolumnę buforem o umiarkowanym stężeniu soli, aby usunąć słabo związane zanieczyszczenia.

Dodaj bufor o wysokim stężeniu soli, aby przerwać oddziaływania kapsydu z heparyną i eluować cząstki wirusowe.

Zebrać frakcje elucji wzbogacone w nienaruszone cząsteczki wirusowe i przenieść je do probówek do koncentracji odśrodkowej wyposażonych w membrany filtrujące.

Wirowarkę wykorzystać do odwirowania zawartości probówek w celu usunięcia nadmiaru buforu, a następnie zebrać skoncentrowane frakcje wirusowe do probówki.

Przepłucz membranę buforem, aby odzyskać pozostałe cząstki wirusowe i zmaksymalizować wydajność.

Rozmrozić surowy lizat w temperaturze 4 °C przez noc.

Po rozmrożeniu przefiltruj go za pomocą filtra 0,22 micron. Bezpośrednio przed etapami oczyszczania pasywuj koncentrator odśrodkowy, dodając cztery mililitry buforu do wstępnego przygotowania filtra na każdą używaną kolumnę heparin-Sepharose. Umieść dren w pompie perystaltycznej.

Sekwencyjnie przepuść roztwory i pożywki. Przygotuj układ do chromatografii, podłączając do przewodów kolumnę z hepariną-Sepharose o pojemności 5 ml i przepuszczając przez nią 25 ml pożywki Bazell DMEM. Następnie nałóż na kolumnę 0,2 µM przefiltrowanego surowego lizatu przy szybkości przepływu od jednej do dwóch kropli na sekundę.

Przemywaj kolumnę sekwencyjnie, eluiąc pięć mililitrów pięć razy za pomocą 300 millimolarnego NaCl w HBSS z dodatkiem magnezu i wapnia, a następnie oznacz pięć frakcji elucji jako E1 do E5. Po przygotowaniu wirowarką odwiruj koncentrator odśrodkowy zawierający bufor do wstępnego przygotowania przy 900 ×g przez dwie minuty. Odrzuć filtrat. Przemyj filtr koncentratora odśrodkowego czterema mililitrami HBSS z dodatkiem magnezu i wapnia, wirując przy 1000 ×g przez dwie minuty.

Następnie dodaj eluat E2 do koncentratora odśrodkowego i wiruj przy 1000 ×g przez pięć minut. Odrzuć przelew. W podobny sposób wiruj eluat E3 w koncentratorze odśrodkowym, aż objętość stężonego wirusa wyniesie około 1 ml.

Przenieś skoncentrowany wirus z koncentratora odwirującego za pomocą filtrowanego tipsa P200 i zbierz go do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Po zebraniu wirusa przepłucz koncentrator odwirujący 200 mikrolitrami HBSS z dodatkiem magnezu i wapnia. Energicznie pipetuj w górę i w dół przez 30 sekund, aby oderwać wirusy przylegające do membrany, a następnie zbierz skoncentrowany wirus do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Dokładnie wymieszaj zawartość probówki.