JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:45 min. • August 31st, 2026
Zacznij od zawiesiny komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję integraz wirusowej z tagiem polihistydynowym.
Poddaj zawiesinę sonikacji, aby rozbić błony bakteryjne i uwolnić integrazę.
Przenieś lizat do probówki do ultrawirówki.
Wiruj z wysoką prędkością, aby zsedymentować szczątki komórkowe i zebrać supernatant.
Następnie należy wziąć kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą z naładowanym niklem i przeprowadzić równoważenie buforem.
Nałóż oczyszczony lizat na kolumnę.
Białka zawierające histydyny wiążą się słabo z niklem, natomiast integrazą z tagiem polihistydynowym wiąże się silnie.
Przemyć buforem w celu usunięcia nie związanych białek, a następnie dodać bufor elucyjny z liniowo zwiększającym się stężeniem imidazolu.
Imidazol konkuruje z histydyną o wiązanie z niklem, co uwalnia integrazę.
Zabierz frakcje i przenieś alikwoty do probówek zawierających bufor do nakładania próbek.
Podgrzać w celu denaturacji białek, a następnie nałożyć na żel poliakrylamidowy.
Przeprowadź elektroforezę i przeanalizuj prążki białkowe.
Zidentyfikuj frakcje zawierające czystą integrazę, bez żadnych zanieczyszczających białek, i połącz je, aby uzyskać oczyszczoną integrazę wirusową.
Należy rozpocząć od rozmr
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych