Oczyszczanie integrazu wirusowego za pomocą chromatografii powinowactwa

Zacznij od zawiesiny komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję integraz wirusowej z tagiem polihistydynowym.

Poddaj zawiesinę sonikacji, aby rozbić błony bakteryjne i uwolnić integrazę.

Przenieś lizat do probówki do ultrawirówki.

Wiruj z wysoką prędkością, aby zsedymentować szczątki komórkowe i zebrać supernatant.

Następnie należy wziąć kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą z naładowanym niklem i przeprowadzić równoważenie buforem.

Nałóż oczyszczony lizat na kolumnę.

Białka zawierające histydyny wiążą się słabo z niklem, natomiast integrazą z tagiem polihistydynowym wiąże się silnie.

Przemyć buforem w celu usunięcia nie związanych białek, a następnie dodać bufor elucyjny z liniowo zwiększającym się stężeniem imidazolu.

Imidazol konkuruje z histydyną o wiązanie z niklem, co uwalnia integrazę.

Zabierz frakcje i przenieś alikwoty do probówek zawierających bufor do nakładania próbek.

Podgrzać w celu denaturacji białek, a następnie nałożyć na żel poliakrylamidowy.

Przeprowadź elektroforezę i przeanalizuj prążki białkowe.

Zidentyfikuj frakcje zawierające czystą integrazę, bez żadnych zanieczyszczających białek, i połącz je, aby uzyskać oczyszczoną integrazę wirusową.

Należy rozpocząć od rozmrożenia na lodzie jednego osadu bakterii E. coli wykazujących ekspresję integrazy prototypowego wirusa piankowatego. Używając sonikatora wyposażonego w bio-różek o średnicy 0,5 cala z mikrokońcówką stożkową o średnicy 0,125 cala, należy przeprowadzić sonikację przez 30 sekund przy amplitudzie 30%, trzymając probówkę na lodzie. Po sonikacji próbkę komórkową należy przenieść do zimnej probówki do ultrawirowania i wirować z prędkością 120 0 ×g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu powinien powstać wyraźny osad, a nadsącz może mieć żółty kolor. Przenieś nadsącz do schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie przygotuj kolumnę FPLC o długości 10 mm i średnicy 5 mm z 1,5 ml żywicy naładowanej niklem.

Najpierw podłączyć kolumnę do urządzenia FPLC i wprowadzić bufor. Urządzenie powinno rejestrować w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności oraz absorbancji UV przy 280 nanometrach. Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować.

W razie potrzeby kontynuuj przepuszczanie buforów przez kolumnę, aż odczyty staną się stabilne. Używając pętli superloop, nałóż próbkę białka na kolumnę przy szybkości przepływu 0,15 milliliters per minute i maksymalnym limicie ciśnienia 0,5 megapascal. Przymocuj superloop do systemu AKTA FPLC.

Po przemyciu kolumny i elucji białek, pobierz 15-mikrolitrowe aliquoty początkowego przepływu, frakcje z przemywania oraz frakcje z piku absorbancji przy 280 nm, a do każdej próbki dodaj 15 mikrolitrów 2X buforu do próbek SDS-PAGE. Gotuj próbki przez trzy minuty. Nanieś 10 mikrolitrów każdej próbki na żele 10% SDS-PAGE, wraz z czterema mikrolitrami wstępnie zabarwionych standardów białkowych.

Wizualnie oceń żel, aby zidentyfikować frakcje, które wydają się zawierać niemal czystą integrazę prototypowego wirusa pienistego. Połącz te frakcje i zanotuj objętość podczas pipetowania. Zazwyczaj wynosi ona od 8 do 10 ml.