JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:55 min. • September 30th, 2026
Pobrać hodowlę ludzkich komórek nowotworowych wykazujących ekspresję endogennego białka docelowego i usunąć medium.
Przygotować zawiesinę rekombinowanego adenowirusa niosącego gen kodujący białko docelowe znakowane fluoroforem.
Dodaj niewielką objętość zawiesiny wirusa do komórek, aby zapewnić bliski kontakt między wirusem a powierzchnią komórki.
Inkubować, okresowo wstrząsając próbkę, aby umożliwić przyłączenie wirusa.
Dodać dodatkową pożywkę do hodowli.
Następnie wprowadź kompleks siRNA–fosforan wapnia w celu ukierunkowania na mRNA endogennego białka docelowego i inkubuj.
Fosforan wapnia zwiększa pobór siRNA, a siRNA zostaje wbudowane do kompleksu RISC.
Kompleks siRNA–RISC wiąże się następnie z docelowym mRNA i rozcina go, hamując ekspresję białka.
Jednocześnie adenowirus wnika do komórki i uwalnia swoje DNA, które kieruje ekspresją białka docelowego znakowanego fluorophorem.
Umożliwia to usunięcie endogennego białka docelowego i jednoczesne zastąpienie go białkiem znakowanym fluorophorem.
Przemyj komórki buforem i przeprowadź obrazowanie fluorescencyjne w celu analizy białka docelowego.
Oznakuj probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla każdego z wariantów doświadczalnych i dodaj
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych