JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:27 min. • September 30th, 2026
Zacznij od zawiesin zmutowanych cząsteczek wirusopodobnych (VLP) oczyszczonych z zainfekowanych liści tytoniu.
Mutanty VLP zawierają reszty cysteiny wstawione genetycznie w określonych pozycjach białka kapsydu wirusa.
Dodaj barwnik fluorescencyjny sprzężony z maleimidem, a następnie inkubuj mieszaninę w ciemności.
Maleimid wiąże się wyłącznie z resztami cysteiny wyeksponowanymi na powierzchni VLP, podczas gdy cysteiny ukryte w strukturze białka pozostają niedostępne i nie zostają znakowane.
Dodaj czynnik redukujący, aby zablokować nieprzereagowany barwnik i zapobiec nieswoistemu znakowaniu.
Nanieś próbki na kolumny odsalające wypełnione porowatą żywicą, a następnie odwiruj je w celu oczyszczenia znakowanych VLP.
Niereagujące barwniki i środki redukujące dyfundują do porowatych kulek żywicy i zostają w nich zatrzymane, podczas gdy większe VLP są wykluczane z porów i eluują jako pierwsze.
Oznakowane fluorescencyjnie VLP można teraz poddać analizie za pomocą elektroforezy w żelu.
Fluorescencyjne prążki na żelu wskazują mutanty z etykietami i wystającymi na powierzchnię resztami cysteiny.
Po otrzymaniu cappingowanych transkryptów T7-RNA z plazmidów wektorowych opartych na wirusie ziemniaka X (P
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych