Name: Izolacja komórek macierzystych mysich gruczołów ślinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z mysich gruczołów ślinowych przy użyciu trawienia enzymatycznego i mechanicznego. Technika umożliwia hodowlę salisfer z właściwościami komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
<li>Bufor: 1 % (w/v) albuminy surowicy bydlęcej w zrównoważonym roztworze soli Hanksa</li>
<li>Rekonstytucja enzymów. Hialuronidaza: 40mg / mL, rozpuszczona w buforze. Kolagenaza II: 23mg / mL, rozpuszczona w buforze. Do każdej izolacji należy używać świeżo przygotowanych roztworów enzymów. Po rozpuszczeniu przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu trawienia.</li>
<li>50 mM chlorku wapnia w wodzie destylowanej. Sterylizować przez filtr o rozmiarze porów 0.2 uM.</li>
<li>Pożywka do hodowli gruczołów ślinowych myszy (MSG): DMEM:F12 z penicyliną (100 I.U. / mL), streptomycyną (100 μg / mL), glutamaxem (2 mM), epidermalnym czynnikiem wzrostu-2 (20 ng / mL), fibroblastycznym czynnikiem wzrostu-2 (20 ng / mL), suplementem N2 (1 %), insuliną (10 μg / mL) i deksametazonem (1 μM).</li>
</ol>
2. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie tkanki
<ol>
<li>Zważyć wypreparowane gruczoły ślinowe.</li>
<li>Posiekać gruczoły na jednorodną masę w małej szalce Petriego, używając sterylnych zakrzywionych nożyczek preparacyjnych.</li>
<li>Przenieść posiekaną tkankę do probówek o pojemności 14 mL, stosując 1 mL buforu na każde 80 mg tkanki podżuchwowej. Przepłukać szalki Petriego pozostałościami buforu, aby usunąć resztki tkanki.</li>
<li>Dodać kolejne 1 mL buforu na każde 80 mg tkanki, a następnie 25 μL roztworu kolagenazy II, 25 μL roztworu hialuronidazy oraz 250 μL roztworu chlorku wapnia na każde 80 mg tkanki. W przypadku pracy z dużymi ilościami tkanki, kroki 2.4 – 2.9 można dla wygody przeprowadzić w kolbach do hodowli tkankowej T25.</li>
<li>Inkubować w wytrząsanej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Wyjąć probówki i utrzeć zawartość za pomocą pipety, aby ponownie dokładnie wymieszać enzymy z tkanką.</li>
<li>Umieścić ponownie w łaźni wodnej na kolejne 20 minut.</li>
<li>Zebrać tkankę poprzez wirowanie przy 400 x g przez 8 minut. Odpiłować nadsącz.</li>
<li>Resuspendować w 2 mL buforu na każde 80 mg tkanki i powtórzyć dodawanie enzymów oraz chlorku wapnia jak opisano powyżej. Inkubować przez 20 minut w wytrząsanej łaźni wodnej. Wyjąć probówki i utrzeć zawartość za pomocą pipety w celu dokładnego wymieszania enzymów.</li>
<li>Inkubować przez ostatnie 20 minut w wytrząsanej łaźni wodnej. Zebrać komórki poprzez wirowanie jak opisano powyżej, a następnie odpiłować nadsącz.</li>
</ol>
3. Etapy płukania
<ol>
<li>Resuspender każde 80 mg tkanki w 2 mL buforu i pipetować, aby wypłukać enzymy z tkanki.</li>
<li>Wirować jak wcześniej w celu zebrania osadu. Odpiłować nadsącz.</li>
<li>Powtórzyć płukanie, używając 1 mL buforu na 80 mg tkanki. Wirować w celu zebrania osadu, a następnie odpiłować nadsącz.</li>
</ol>
4.	Filtrowanie
<ol>
<li>Resuspender roztwór tkankowy w 1 mL buforu na 80 mg tkanki.</li>
<li>Przenieść roztwór na filtr o rozmiarze porów 100 μm umieszczony nad probówką Falcon 50 mL. Nie nakładać więcej niż 3 mL roztworu rozdrobnionej tkanki na kolumnę, ponieważ filtry mogą się zapchać. Pozostawić do przefiltrowania. Materiał odfiltrowany zawieszony pod filtrem usunąć za pomocą pipety i dodać do filtratu.</li>
<li>Za pomocą strzykawki z igłą 26G pobrać filtrat z probówek 50 mL i nanieść go na filtry o rozmiarze porów 50 μm na probówkach 5 mL. Pozostawić do przefiltrowania, w razie potrzeby pomagając poprzez poluzowanie zakrętek.</li>
<li>Odwirować probówki w sposób opisany wcześniej w celu zebrania osadu. Odrzucić nadsącz.</li>
</ol>
5.	Wysiewanie i podłoże
<ol>
<li>Połączyć wszystkie osady w jednej probówce. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
<li>Wysiać komórki z gęstością 0,4 x 106 komórek na dołek w płytce 12-dołkowej lub 2,67 x 106 komórek na kolbę do hodowli tkankowej T25. Do każdego dołka dodać 1 mL pożywki MSG lub 6 mL do każdej kolby T25.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37 °C. Sfery powinny być wyraźnie widoczne do 2. dnia.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Po dwóch do trzech dniach hodowli w kulturach pojawią się małe agregaty komórek (salisfery). Salisfery będą nadal zwiększać swoje rozmiary przez okres dziesięciu dni hodowli. Reprezentatywne obrazy salisfer wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej w fazie przedstawiono na Rysunku 1. Z tych sfer można wyizolować proliferujące komórki wykazujące ekspresję białek markerowych związanych z komórkami macierzystymi, optymalnie między 3. a 5. dniem po izolacji; komórki te są zdolne do różnicowania się w funkcjonalne, produkujące ślinę komórki acinarne.
<img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Wzrost komórek w ciągu 10 dni hodowli; obrazy mikroskopowe z dnia 0, 4, 7, 10; tworzenie się klastrów komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Tworzenie się salisfer in vitro. Po trawieniu mechanicznym i enzymatycznym zgodnie z niniejszym protokołem, w hodowlach pływających można zaobserwować sfery o zwiększającej się wielkości. Panele przedstawiają reprezentatywne obrazy mikroskopii w kontraście fazowym sfer z dni 0 (A), 4 (B), 7 (C) i 10 (D). Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda hodowli tkankowej stanowi powtarzalny protokół izolacji salisfer zawierających komórki macierzyste z gruczołów ślinowych myszy. Badania z wykorzystaniem komórek izolowanych w ten sposób podkreśliły zdolność regeneracyjną komórek macierzystych gruczołów ślinowych 9. Transplantacja stu komórek c-Kit+ pochodzących z salisfer wywołała funkcjonalną regenerację napromieniowanych gruczołów ślinowych myszy. Dane te są obiecujące i stanowią punkt wyjścia do badania terapii kserostomii opartej na komórkach macierzystych. Pozostaje jednak do zbadania wiele kwestii, w tym pełny profil ekspresji białek markerowych komórek macierzystych, zdolność gruczołów podżuchwowych do przywrócenia funkcji napromieniowanych gruczołów ślinowych ślinowych i odwrotnie, a także charakterystyka domniemanej niszy komórek macierzystych in vivo. Ostatecznie, przeniesienie tego protokołu na ludzkie próbki tkanek i wynikający z tego potencjał terapii kserostomii u pacjentów z wykorzystaniem izolowanych komórek jest najbardziej ekscytującym zastosowaniem opisanej metody.

<table><tbody><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Przechowywać w &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Przechowywać w 4 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Epidermalny czynnik wzrostu-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 &amp;#x03BC;g / mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Przechowywać w &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C w alikwotach jednorazowych.</td></tr><tr><td>Fibroblastyczny czynnik wzrostu-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 25 &amp;#x03BC;g / mL w PBS. Przechowywać w &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C w alikwotach jednorazowych.</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Zgodnie z instrukcją producenta.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 2 mg / mL w wodzie z kranu. Przed rozpuszczeniem dostosować pH wody do wartości 2-3 za pomocą lodowatego kwasu octowego.</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sita do komórek o rozmiarze porów 100 &amp;mu;M</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem i nakrętkami z sitami do komórek (rozmiar porów 50 &amp;mu;M)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Dojrzałe gruczoły ślinowe pochodzenia ludzkiego i mysiego składają się z co najmniej pięciu typów komórek, z których każdy wspomaga produkcję i wydalanie śliny do jamy ustnej. Komórki acinarne surowicze i śluzowe stanowią odpowiednio fabryki białek i śluzu w gruczole i są miejscem powstawania śliny. Po syntezie różne komponenty enzymatyczne i białkowe śliny są wydzielane poprzez szereg komórek przewodowych o morfologii nabłonkowej, aż do ostatecznego wyrzutu śliny przez główny przewód do jamy ustnej. Podczas tego procesu skład śliny jest również modyfikowany przez komórki przewodowe.
W przebiegu schorzeń takich jak zespół Sjögrena, a także w niektórych sytuacjach klinicznych, np. podczas radioterapii nowotworów głowy i szyi, produkcja śliny przez gruczoły jest drastycznie zmniejszona 1,2. Wynikająca z tego kserostomia, czyli subiektywne odczucie suchości w jamie ustnej, wpływa nie tylko na zdolność pacjenta do połykania i mówienia, ale także sprzyja rozwojowi próchnicy zębów i może prowadzić do wykluczenia społecznego osoby cierpiącej.
Przywrócenie produkcji śliny w wyżej wymienionych stanach klinicznych stanowi zatem niezaspokojoną potrzebę medyczną, w związku z czym w kilku badaniach wykazano zdolności regeneracyjne gruczołów ślinowych 3-5. Po wyizolowaniu populacji komórek o charakterze macierzystym z różnych tkanek organizmu myszy i człowieka 6-8, za pomocą opisanego метода wykazaliśmy, że komórki macierzyste wyizolowane z gruczołów ślinowych myszy mogą zostać wykorzystane do przywrócenia produkcji śliny w napromieniowanych gruczołach ślinowych 9,10. Odkrycie to otwiera drogę do opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu kserostomii u ludzi, a także do badania gruczołów ślinowych jako mikrośrodowiska zawierającego komórki o multipotencjalnych zdolnościach do samoodnawiania.

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Dojrzałe gruczoły ślinowe pochodzenia ludzkiego i mysiego składają się z co najmniej pięciu typów komórek, z których każdy wspomaga produkcję i wydzielanie...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie izolacji domniemanych komórek macierzystych z gruczołów ślinowych myszy. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie gruczołów ślinowych podżuchwowych od dorosłych myszy. Drugim krokiem procedury jest wykorzystanie zakrzywionych nożyczek w celu przetworzenia tkanki w jednorodną masę.Trzecim krokiem procedury jest dalsze trawienie tkanki przy użyciu kolagenazy i enzymów lizezy o wyższej aktywności. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego strawienia tkanki. Ponieważ całkowita zawiesina komórkowa nie daje wielu sfer, optymalne są skupiska od dwóch do trzech komórek.Ostatnim etapem procedury jest filtrowanie homogenatu przez filtry o rozmiarze 100 micron i 50 micron. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące hodowlę i izolację komórek macierzystych gruczołów ślinowych poprzez połączone zastosowanie mechanicznego i enzymatycznego trawienia całych gruczołów ślinowych. Znaczenie tej techniki wykracza w stronę terapii kserostomii, znanej również jako suchość w jamie ustnej, która może być następstwem radioterapii.Komórki macierzyste gruczołów ślinianych mogą być wykorzystane do leczenia kserostomii u pacjentów cierpiących na nowotwory głowy i szyi. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować bufory, myszy, hodowlę gruczołów ślinianych, pożywki oraz roztwory enzymatyczne. Zgodnie z towarzyszącym protokołem pisanym, wszystkie etapy sekcji i hodowli tkankowej powinny być przeprowadzane w sterylnym komorze do hodowli tkanek.Po wyizolowaniu i wypreparowaniu ślinianek myszy, zważ tkankę ślinianek na wadze i zapisz ich masę. Za pomocą szpatułki przenieś ślinianki do małej szalki Petriego i używając zakrzywionych nożyczek do sekcji, rozdrobnij ślinianki do postaci jednorodnej papki. Odetnij końcówkę tipa do pipety P 1000, aby uzyskać szerszy otwór.Użyć tego do pipetowania jednego mililitra buforu na 80 miligramów tkanki do szalki Petriego, a następnie przenieść homogenat do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów. Dodać kolejny jeden mililitr buforu na 80 miligramów tkanki do szalki Petriego. Aby zebrać pozostałe małe fragmenty tkanki, dodać ten roztwór do probówki do wirowania.Następnie szybko dodaj 250 µL roztworu chlorku wapnia, 25 µL roztworu hialuronidazy oraz 25 µL kolagenazy. Stosuj dwa roztwory enzymów na 80 mg tkanki. Umieść probówkę zawierającą mieszaninę tkanki i enzymów w wstrząsowej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubuj przez 20 minut.Po inkubacji wyjmij probówki. Używając końcówki do pipety P 1000 z odciętym końcem, tak jak wcześniej, dokładnie wymieszaj tkankę z roztworem enzymu, powtarzając czynność około 10 razy. Umieść probówkę z powrotem w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na kolejne 20 minut.Po drugim okresie inkubacji odwiruj próbkę przy 400 ×g przez osiem minut; po wirowaniu odrzuć nadsącz i ostrożnie resuspenduj osad w 2 mL buforu na 80 mg tkanki wyjściowej. Następnie dodaj kolejne 250 µL roztworu chlorku wapnia, 25 µL roztworu hialuronidazy i 25 µL kolagenazy. Dwa roztwory enzymów na 80 mg tkanki.Następnie należy umieścić probówkę z powrotem w wytrząsającej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut. Wyjąć tkanki z kąpieli wodnej i powtórzyć czynności analogicznie do poprzednich inkubacji. Odwirować próbkę przy 400 ×g przez osiem minut.Powtórz czynność jeszcze raz, a następnie odrzuć nadsącz. Tkanka jest teraz gotowa do przemycia w ramach przygotowania do filtrowania po poprzednim wirowaniu. Pipetuj dwa mililitry buforu do probówki i homogenizuj ją.Resuspend pellet po przeprowadzeniu zawieszenia. Odwiruj próbkę przy 400 ×g przez osiem minut. Następnie odlej nadsącz za pomocą pipety.Do probówki dodać jeden mililitr buforu na każde 80 miligramów tkanki, a następnie ponownie utrzeć. Ma to na celu resuspensję osadu. Powtórzyć wirowanie.Wiruj przy 400 ×g przez osiem minut. W czasie wirowania przygotuj etap filtracji, umieszczając filtr o rozmiarze oczek 100 µm na probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Po wirowaniu odlej supernatant i pipetuj do probówki końcowy 1 mL buforu na każde 80 mg tkanki. Używając końcówki P 1000 z obcinaczem końcówek, pipetuj próbkę w górę i w dół, aby zapewnić całkowite resuspensowanie osadu.Następnie przenieś homogenat do filtra o rozmiarze porów 100 micron i pozwól mu przesiąknąć przez filtr do probówki wirówkowej o pojemności 50 milliliter. Ważne jest, aby nie nakładać więcej niż 3 milliliter homogenatu, ponieważ filtr może się zapchać. Jeśli objętość ta zostanie przekroczona, użyj pipety P 1000, aby usunąć tkankę, która zebrała się na spodniej stronie filtra, i przenieś ją do probówki wirówkowej o pojemności 50 milliliter zawierającej filtrat.Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G należy pobrać homogenizat z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i nanieść go na nakrętkę z filtrem o rozmiarze oczek 50 µm, założoną na probówkę o pojemności 5 ml. Należy pozwolić homogenizatowi przesiąknąć przez filtr. Jeśli filtracja przebiega powoli, należy poluzować nakrętkę filtra, jeśli jest zbyt mocno dokręcona.Uszczelka może zapobiegać filtrowaniu, gdy cały homogenat przejdzie przez filtr do probówki. Wiruj próbkę z prędkością 400 ×g przez osiem minut. Po wirowaniu osad z komórek jest gotowy do wysiania na płytkę.Proces rozpoczyna się od resuspensji komórek gruczołów ślinowych w 1 mL pożywki MSG na 80 mg tkanki. Komórki należy policzyć zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym przypadku do określenia liczby komórek zastosowano automatyczny licznik komórek.Oblicz objętość zawiesiny komórkowej wymaganą do uzyskania 0,4 × 10⁶ komórek, a na tej podstawie określ liczbę studni, które można zasiać. Do płytki hodowlanej z 12 studniami dodaj jeden mililitr pożywki MSG do każdej studni. Upewnij się, że zawiesina komórkowa jest dobrze wymieszana, a następnie do każdej studni dodaj wymaganą objętość zawiesiny komórkowej odpowiadającą 0,4 × 10⁶ komórek.Przenieś płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide. Po dwóch dniach inkubacji sprawdź hodowle pod kątem obecności sfer SLO oraz braku komórek ace. Jest to przykład tkanki gruczołu ślinowego myszy przetworzonej zgodnie z opisem i wizualizowanej za pomocą mikroskopii kontrastowej od 0 do 10 dni hodowli; małe agregaty komórek to sfery SLO, których rozmiar zwiększa się w tym okresie.Przedstawiono tutaj barwienie immunologiczne reprezentatywnej hodowli sfer SLOs z okresu od trzech do pięciu dni pod kątem markera komórek macierzystych Protein C kit. Analiza przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej wykazała, że ekspresja sea kit potwierdza obecność domniemanych komórek macierzystych w hodowli sfer SLOs. Sfery SLOs w wieku od trzech do pięciu dni mogą również ulegać różnicowaniu, tworząc struktury przypominające przewody i zatoki o morfologii zbliżonej do struktur w natywnej śliniance.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować gruczoły ślinowe oraz komórki macierzyste z mysich gruczołów ślinowych.

isolation-of-mouse-salivary-gland-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z mysich gruczołów ślinowych przy użyciu trawienia enzymatycznego i mechanicznego. Technika umożliwia hodowlę salisfer z właściwościami komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Przeglądaj więcej filmów