Name: C. elegans (C. elegans) Pozytywne uczenie się butanonu, krótkotrwałe i długoterminowe testy pamięci asocjacyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metody oceny pamięci asocjacyjnej u C. elegans poprzez chemotaksję wobec butanonu. Technika ta umożliwia badanie krótko- i długotrwałej pamięci w kontekście procesów poznawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy W. Ryu za porady dotyczące początkowej konfiguracji obrazowania, Z. Gitai za sugestię użycia programu ImageJ13 do liczenia nicieni oraz J. Ashraf za pomoc przy korzystaniu z Google SketchUp. CTM jest stypendystą Pew Scholar w dziedzinie nauk biomedycznych, stypendystą McKnight Scholar oraz stypendystą Keck Scholar.

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-515 (1993).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).</li>
<li>Bono, M. de, Maricq, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+substrates+of+complex+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans.</a> Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).</li>
<li>Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+chemotaxis+and+thermotaxis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+induce+aversive+olfactory+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 438, 179-179 (2005).</li>
<li>Kauffman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+dietary+restriction+differentially+influence+the+decline+of+learning+and+memory+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age.</a> PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).</li>
<li>Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+integrates+the+signals+of+butanone+and+food+to+enhance+chemotaxis+to+butanone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone.</a> J Neurosci. 27, 741-741 (2007).</li>
<li>Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CREB+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CREB and memory.</a> Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+image+transformations+for+an+automatic+screening+of+cervical+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears.</a> J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-71 (1974).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensionality+and+dynamics+in+the+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans.</a> PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tutaj testy uczenia asocjacyjnego i pamięci węchowej u C. elegans pozwalają rozróżnić procesy uczenia skumulowanego, uczenia rozproszonego, pamięci krótkotrwałej oraz pamięci długotrwałej. Testy te opierają się na zdolności nicieni do wykrywania pożywienia i zapachów chemicznych w ich środowisku1,2 oraz tworzenia pozytywnych skojarzeń między nimi.6 W związku z tym testy są bardzo wrażliwe na głodowanie w początkowej populacji zwierząt, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zapewnić odpowiednie odżywienie nicieni przed i po treningu. Pojedynczy trening skumulowany prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej. Zwiększona liczba okresów warunkowania oraz paradygmat uczenia rozproszonego są kluczowe dla osiągnięcia długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans, podobnie jak u innych organizmów.6,8 Być może test ten można zmodyfikować w celu wywołania długotrwałych wspomnień asocjacji między różnymi bodźcami warunkowanymi i bezwarunkowymi.
Nasze testy uczenia się asocjacyjnego i pamięci mogą być wykorzystane do porównania zdolności uczenia się i pamięci zwierząt typu dzikiego z osobnikami starzejącymi się lub mutantami genetycznymi. Na przykład, podczas gdy zarówno zdolność uczenia się asocjacyjnego, jak i długotrwała pamięć asocjacyjna spadają wraz z wiekiem u nicieni typu dzikiego, uczenie się jest zachowane dłużej u zwierząt z osłabionym sygnalizowaniem insulinowym, a uczenie się i pamięć są zachowane dłużej u zwierząt poddanych restrykcji kalorycznej.6 Testy te są również odpowiednie do stosowania RNAi lub manipulacji farmakologicznych u C. elegans. Przykładowo, traktowanie nicieni RNAi przeciwko daf-2 poprawia krótkotrwałą i długotrwałą pamięć asocjacyjną; przeciwnie, blokowanie transkrypcji genów i syntezy białek za pomocą leków (odpowiednio aktynomycyny D i cykloheksymidu) podczas treningu z odstępami czasowymi zaburza formowanie pamięci długotrwałej.6
Pamięć długotrwała jest procesem kluczowym dla przetrwania wszystkich zwierząt i wydaje się, że znaczna część mechanizmów molekularnych zaangażowanych w pamięć asocjacji pawłowowskiej jest zachowana od nicieni po ssaki.6 Zdolność do rozróżniania i testowania uczenia się asocjacyjnego oraz pamięci krótkoterminowej i długoterminowej przy użyciu tych testów olfaktorycznych sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do dalszych badań nad pamięcią i może dostarczyć wiedzy na temat procesów neurodegeneracyjnych prowadzących do utraty zdolności uczenia się i pamięci u ludzi.

<table><tbody><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>Przygotować stężenie 1 M w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>DSP-CT-18</td><td>&amp;gt;95% etanolu może zawierać zanieczyszczenia zakłócające testy chemotaksji</td></tr><tr><td>2-butanony 99+%</td><td>Acros Organics</td><td>14967-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CMOS do skanowania obszarów Basler IEEE-1394/FireWire</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-683</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw wideo InfiniMite &amp;#8211; Alpha Industrial</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-202</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy Dolan-Jenner MI-150</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT55-718</td><td></td></tr><tr><td>Podświetlenie 8&amp;#8221; x 8&amp;#8221;</td><td>Schott AG</td><td>A08927</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy statyw wysięgnikowy</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-120</td><td></td></tr><tr><td>Adapter słupa 3/4&amp;#8221; do statywów wysięgnikowych</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-124</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa stała płyta montażowa 1/4-20</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-122</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Pamięć doświadczeń i nabytych informacji jest kluczowa dla organizmów w podejmowaniu decyzji sprzyjających ich przetrwaniu. C. elegans porusza się w swoim środowisku dzięki specyficznej dla neuronów detekcji pożywienia i zapachów chemicznych1, 2, a także potrafi powiązać stany odżywcze z zapachami chemicznymi3, temperaturą4 oraz patogennością źródła pożywienia5.
W niniejszej pracy opisujemy testy uczenia się asocjacyjnego oraz krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Zmodyfikowaliśmy paradygmat uczenia się zapachowego o charakterze awersyjnym6, aby zamiast tego wywołać reakcję pozytywną; test polega na zagłodzeniu około 400 nicieni, a następnie karmieniu ich w obecności lotnego chemoatraktanta, butanonu, wykrywanego przez neurony AWC, w stężeniu wywołującym niski indeks chemotaktyczny (podobnie jak u Toroyamy et al.7). Standardowy test chemotaksji populacyjnej1 służy do oceny atrakcyjności substancji zapachowej dla nicieni bezpośrednio lub od kilku minut do kilku godzin po warunkowaniu.
Po uwarunkowaniu chemotaksja zwierząt typu dzikiego w stronę butanonu wzrasta o około 0,6 jednostki indeksu chemotaksji, co stanowi ich „indeks uczenia się”. Uczenie asocjacyjne jest zależne od obecności zarówno pokarmu, jak i butanonu podczas treningu. Parowanie pokarmu z butanonem w jednym okresie uwarunkowania („trening skumulowany”) prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej, która utrzymuje się przez około 2 godziny. Wielokrotne okresy uwarunkowania z przerwami odpoczynkowymi pomiędzy nimi („trening rozłożony w czasie”) skutkują powstaniem długotrwałej pamięci asocjacyjnej (&lt;40 godzin) i jest procesem zależnym od białka CREB (cAMP Response Element Binding protein),6 czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do tworzenia pamięci długotrwałej u wielu gatunków.8
Nasz protokół obejmuje również metody analizy obrazu w celu szybkiego i dokładnego wyznaczenia indeksów chemotaksji. Obrazy zwierząt na płytkach do testów chemotaksji o wysokim kontraście są rejestrowane i analizowane przez oprogramowanie do liczenia nicieni w środowisku MatLab. Oprogramowanie koryguje nierównomierne tło, stosując morfologiczną transformację top-hat.9 Następnie wykorzystuje się metodę Otsu do wyznaczenia progu oddzielającego nicienie od tła.10 Bardzo małe cząsteczki są usuwane automatycznie, a większe obszary niebędące nicieniami (krawędzie płytki lub otwory w agarze) są usuwane poprzez ręczny wybór. Oprogramowanie szacuje następnie rozmiar pojedynczego nicienia, pomijając obszary przekraczające określoną maksymalną wielkość i przyjmując medianę rozmiaru pozostałych obszarów. Liczbę nicieni szacuje się następnie poprzez podzielenie całkowitego obszaru zidentyfikowanego jako zajęty przez nicienie przez szacowany rozmiar pojedynczego nicienia.
Stwierdziliśmy, że uczenie się oraz pamięć krótkotrwała i długotrwała mogą być odróżnione i że procesy te dzielą podobne kluczowe cząsteczki z organizmami wyższymi.6,8 Nasze testy pozwalają na szybką weryfikację nowych genów kandydatów lub cząsteczek wpływających na uczenie się oraz pamięć krótkotrwałą lub długotrwałą u C. elegans, które są istotne w obrębie wielu gatunków.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.

C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Pamięć o doświadczeniach i nabytych informacjach jest kluczowa dla organizmów w podejmowaniu wyborów sprzyjających ich przetrwaniu. *C. elegans* porusza się w swoim środowisku...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej w zakresie wyuczonej pozytywnej asocjacji między pożywieniem a atraktantem w postaci butanu, z wykorzystaniem *C. elegans* jako modelu. Osiąga się to poprzez uprzednie głodzenie przez jedną godzinę zsynchronizowanych, dobrze odżywionych młodych dorosłych nicieni.Następnie nicienie są trenowane w obecności pokarmu i butiranolu za pomocą warunkowania krótkoterminowego w celu wywołania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej oraz warunkowania rozłożonego w czasie dla długotrwałej pamięci asocjacyjnej. Po warunkowaniu mierzy się chemotaksję w stronę butiranolu i porównuje ją z chemotaksją osobników naiwnych. W celu zbadania retencji pamięci uzyskuje się wyniki pokazujące czas trwania krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej dla wyuczonej relacji między pokarmem a butiranolem na podstawie zmian w indeksie uczenia się.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu starzenia się poznawczego i chorób, takie jak to, jakie szlaki genetyczne są niezbędne do funkcjonowania neuronów podczas normalnego starzenia się oraz w stanach chorób neurodegeneracyjnych, a także w jaki sposób można poprawić uczenie się i pamięć. W warunkach upośledzenia funkcji poznawczych nicienie przygotowuje się standardowymi metodami na płytkach z pożywką o wysokości 100 mm, wysianych jednym mililitrem OP 50 e coli. Należy użyć młodych osobników dorosłych w zagęszczeniu około 5 000 nicieni lub mniej na płytkę.Zbierz nicienie, ostrożnie wlewając bufor M9 na płytkę i delikatnie nim potrząsając, aby odczepić organizmy. Staraj się ograniczyć gwałtowne ruchy, które mogłyby spowodować oderwanie niepożądanych bakterii. Następnie przechyl płytkę i pobierz mieszaninę buforu z nicieniami z narożnika.Za pomocą pipety P 1000 przenieść nicienie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Należy uważać, aby nie wypipetować nicieni o ścianki probówki, jeśli na płytce pozostaną jeszcze osobniki.Powtórz ten krok jeden lub dwa razy. Pozostaw nicienie, aby opadły na dno probówki pod wpływem grawitacji. Dla uzyskania najlepszych wyników nie zaleca się wirowania.Po osadzeniu usunąć supernatant za pomocą odessania i przemyć co najmniej trzema do czterech mililitrów buforu M nine. Należy działać szybko, aby zapobiec głodzeniu komórek. Powtórzyć tę procedurę dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.Na tym etapie można odłożyć grupę nicieni, która będzie służyć jako grupa naiwna w testach chemotaksji, które zostaną zaprezentowane później; aby przygotować nicienie do treningu, należy dodać 3-4 mL buforu M9 do probówki i pozostawić nicienie do zagłodzenia w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przygotuj płytki kondycjonujące, nakładając 2 µL 10% butanolu w 95% etanolu na wewnętrzną stronę pokrywek płytek NGM o średnicy 60 mm, na które naniesiono 500 µL E. coli szczepu OP50. Wyjmij probówkę z zagłodzonymi nicnieniami i za pomocą pipety P1000 przenieś 100-200 µL zawiesiny nicieni na każdą z płytek kondycjonujących. Po kondycjonowaniu inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Zmyj nicienie z płytek, używając około 1 ml buforu M9, i przenieś je do 15 ml probówki stożkowej. Powtarzaj wcześniej zaprezentowaną metodę delikatnego płukania, aż bufor stanie się przejrzysty. Po wypłukaniu można odseparować część nicieni i poddać je testowi chemotaksji, aby służyły jako grupa czasu zero dla jednokrotnego uczenia asocjacyjnego (1x mast associative learning) w celu przygotowania płytek reprezentujących kolejne punkty czasowe.Przenieś od 100 do 200 µL nicieni na zaszczepione płytki NGM o średnicy 60 mm. Inkubuj te płytki po kondycjonowaniu przez 0,5, 1 lub 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po każdym punkcie czasowym delikatnie zmyj nicienie z płytek do probówki stożkowej o pojemności 15 mL i powtórz tę czynność jeszcze jeden lub dwa razy.Po zastosowaniu buforu M9 zgodnie z tymi samymi procedurami delikatnego płukania, pamięć asocjacyjna krótkotrwała jest testowana przy użyciu testu chemotaksji, który zostanie zaprezentowany w dalszej części. Przygotuj płytki warunkujące oraz nicienie w sposób zaprezentowany dla treningu krótkotrwałego, jednak inkubuj nicienie w temperaturze pokojowej tylko przez 30 minut. Po inkubacji zbierz nicienie zgodnie z wcześniej zaprezentowaną procedurą.Przenieś je na niezasiane płyty NGM o średnicy 60 mm. Głodź nicienie na niezasianych płytach w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu głodówki przemyj nicienie buforem M9 i umieść je ponownie w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml. Powtarzaj te kroki, aż do momentu ukończenia łącznie siedmiu bloków kondycjonujących i sześciu bloków głodówkowych.Po zakończeniu kondycjonowania zmyć nicienie z płytek kondycjonujących z powrotem do probówki stożkowej. Jak pokazano wcześniej, grupę nicieni można wykorzystać do testowania uczenia się asocjacyjnego z siedmioma odstępami czasu bezpośrednio po kondycjonowaniu. Przenieś pozostałą populację nicieni na płytki HGM o średnicy 100 milimetrów z naniesionym jednym mililitrem OP 50.Ponownie nanieś od 100 do 200 µL zawiesiny nicieni na płytkę, aby zapewnić odpowiednią ilość bakterii do podtrzymania populacji. Inkubuj płytki po kondycjonowaniu w temperaturze 20 °C przez 16, 24 lub 40 godzin, co odpowiada punktom czasowym pamięci asocjacyjnej długotrwałej, w celu przetestowania długotrwałej pamięci asocjacyjnej dotyczącej powiązania pokarmu z butanonem. Delikatnie zmyj nicienie z płytek do probówki stożkowej o pojemności 15 mL, a następnie przemyj je jeden lub dwa razy buforem M9 po każdym punkcie czasowym i poddaj nicienie analizie w teście chemotaksji.Aby przygotować płytki do testu chemotaksji, zaznacz dno nieułożonych płytek NGM o średnicy 100 milimetrów w trzech miejscach w pobliżu krawędzi, tak jak pokazano tutaj. Nanieś 1 µL 1 M azotku sodu w punktach dla substancji zapachowej oraz kontrolnych. Czynność tę wykonaj nie wcześniej niż 15 minut przed rozpoczęciem testu, aby zminimalizować dyfuzję środków paraliżujących.W kolejnym kroku nanieś po jednym mikrolitrze 95% ethanol i 10% butone na odpowiednie miejsca na oznakowanej płytce testowej. Nanieś je na wcześniej naniesiony azydowek sodu. Usuń z probówki z osadzonymi nicieniami jak największą ilość buforu M nine.Używając pipety P 20 z końcówką o ściętym wierzchołku, nanieś 15 µL zawiesiny nicieni w trzech interwałach po 5 µL na punkt startowy płytki testowej. Następnie skręć róg chusteczki Kimwipe w ostry punkt i użyj go do odsączenia nadmiaru buforu M9, uważając, aby nie przebić agaru.Usunięcie nadmiaru buforu uwalnia nicienie na płytkę testową. W przypadku zastosowania obrazowania do liczenia zwierząt, zdjęcie miejsca startu wykonane bezpośrednio po tym uwolnieniu pozwoli określić całkowitą liczbę osobników na płytce testowej. Inkubuj płytkę do testu chemotaksji przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji, a następnie policz liczbę nicieni w miejscach aplikacji etanolu i butanonu w punkcie startowym, a także całkowitą liczbę nicieni na płytce testowej.Zazwyczaj nicienie sparaliżowane azotkiem sodu znajdują się w promieniu jednego centymetra od plam i pozostają wyprostowane. Przy dużej liczbie zwierząt ułożonych warstwowo można je przeliczyć ręcznie lub określić ich liczbę za pomocą oprogramowania do obrazowania i analizy. Preferujemy tę drugą metodę ze względu na łatwość i niezawodność wyników.Po oszacowaniu liczby nicieni w punktach początkowych z etanolem i butononem, oblicz indeks KeyAx zgodnie z przedstawionym schematem. Typowy naiwny indeks chemotaksji dla nicieni typu dzikiego reagujących na 10% Butone wynosi około 0,2. Trening typu „mass” lub „spaced” zazwyczaj zwiększa indeks CHEMOTAXIS do poziomu 0,7–0,8 w czasie zero, co daje indeks uczenia się na poziomie około 0,6.Naiwna chemotaksja jest bardzo wrażliwa na odpowiednią pielęgnację nicieni. Rysunek ten demonstruje wyraźną różnicę w CI pomiędzy dobrze odżywionymi a głodnymi naiwnymi nicieniami i podkreśla znaczenie prawidłowej techniki. Retencja pamięci odzwierciedlona jest w czasie, po którym indeks chemotaksji powraca do poziomów naiwnych, gdy indeks uczenia się u zwierząt typu dzikiego wynosi zero.Krótkotrwała pamięć asocjacyjna zaczyna zanikać po upływie jednej godziny od treningu masowego trwającego około dwóch godzin i w porównaniu z nią jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego kreb. Długotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj nie zaczyna znacząco zanikać aż do 16 godzin po treningu rozprzestrzonym trwającym do 40 godzin i jest zależna od Creb. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że testy chemotaksji mogą być pod wpływem głodzenia lub nadmiernych zapachów w środowisku, a także że pamięć i nicienie mogą zostać zaburzone przez zbyt silne wstrząsanie mechaniczne.

c-elegans-positive-butanone-learning-short-term-long-term-associative

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

C. elegans Testy uczenia się dotyczące butanonu, krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej

W niniejszym materiale opisujemy molekularny odczyt długotrwałej adaptacji węchowej u Caenorhabditis elegans. Kinaza białkowa G, EGL-4, jest niezbędna do stabilnych odpowiedzi adaptacyjnych w parze pierwotnych neuronów sensorycznych zwanych AWC. Podczas długotrwałej ekspozycji na zapach EGL-4 przemieszcza się z cytozolu do jądra komórkowego neuronu AWC.

Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans

Ten film przedstawia test krótkoterminowego przeżycia, który testuje leczenie ostrej toksyczności lub testuje szczep genetyczny pod kątem odporności na stan toksyczny. Przykładowy protokół pokazuje przykładowy test przeżycia, w którym robaki są testowane pod kątem ich odporności na stres oksydacyjny wywołany przez parakmet (PQ).

C. elegans (C. elegans) Test przeżycia: test toksyczności krótkoterminowej

Ten film przedstawia test habituacji dotyku, behawioralną metodę C. elegans służącą do oceny mechanosensacji i ilościowego określania czasu do przyzwyczajenia.

Test habituacji dotyku: metoda badania uczenia się bez skojarzeń u C. elegans

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Ten protokół opisuje test uczenia się i zapamiętywania u Drosophila zwany warunkowaniem zalotów. Ten klasyczny test opiera się na zmniejszeniu zachowań związanych z zalotami samców po odrzuceniu seksualnym przez niepodatną samicę z premfetem. Ta naturalna forma plastyczności behawioralnej może być wykorzystana do testowania uczenia się, pamięci krótkotrwałej i pamięci długotrwałej.

Drosophila Warunkowanie zalotów jako miara uczenia się i pamięci

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Opisujemy konfigurację systemu, unieruchamianie nicieni oraz przecinanie znakowanych neuronów. Zalety obejmują relatywnie niski koszt systemu oraz możliwość przecinania wypustek neuronalnych lub ablacji komórek in vivo.

In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans

Poznaj metody oceny pamięci asocjacyjnej u C. elegans poprzez chemotaksję wobec butanonu. Technika ta umożliwia badanie krótko- i długotrwałej pamięci w kontekście procesów poznawczych.

C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Przeglądaj więcej filmów