C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej w zakresie wyuczonej pozytywnej asocjacji między pożywieniem a atraktantem w postaci butanu, z wykorzystaniem *C. elegans* jako modelu. Osiąga się to poprzez uprzednie głodzenie przez jedną godzinę zsynchronizowanych, dobrze odżywionych młodych dorosłych nicieni.

Następnie nicienie są trenowane w obecności pokarmu i butiranolu za pomocą warunkowania krótkoterminowego w celu wywołania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej oraz warunkowania rozłożonego w czasie dla długotrwałej pamięci asocjacyjnej. Po warunkowaniu mierzy się chemotaksję w stronę butiranolu i porównuje ją z chemotaksją osobników naiwnych. W celu zbadania retencji pamięci uzyskuje się wyniki pokazujące czas trwania krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej dla wyuczonej relacji między pokarmem a butiranolem na podstawie zmian w indeksie uczenia się.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu starzenia się poznawczego i chorób, takie jak to, jakie szlaki genetyczne są niezbędne do funkcjonowania neuronów podczas normalnego starzenia się oraz w stanach chorób neurodegeneracyjnych, a także w jaki sposób można poprawić uczenie się i pamięć. W warunkach upośledzenia funkcji poznawczych nicienie przygotowuje się standardowymi metodami na płytkach z pożywką o wysokości 100 mm, wysianych jednym mililitrem OP 50 e coli. Należy użyć młodych osobników dorosłych w zagęszczeniu około 5 000 nicieni lub mniej na płytkę.

Zbierz nicienie, ostrożnie wlewając bufor M9 na płytkę i delikatnie nim potrząsając, aby odczepić organizmy. Staraj się ograniczyć gwałtowne ruchy, które mogłyby spowodować oderwanie niepożądanych bakterii. Następnie przechyl płytkę i pobierz mieszaninę buforu z nicieniami z narożnika.

Za pomocą pipety P 1000 przenieść nicienie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Należy uważać, aby nie wypipetować nicieni o ścianki probówki, jeśli na płytce pozostaną jeszcze osobniki.

Powtórz ten krok jeden lub dwa razy. Pozostaw nicienie, aby opadły na dno probówki pod wpływem grawitacji. Dla uzyskania najlepszych wyników nie zaleca się wirowania.

Po osadzeniu usunąć supernatant za pomocą odessania i przemyć co najmniej trzema do czterech mililitrów buforu M nine. Należy działać szybko, aby zapobiec głodzeniu komórek. Powtórzyć tę procedurę dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.

Na tym etapie można odłożyć grupę nicieni, która będzie służyć jako grupa naiwna w testach chemotaksji, które zostaną zaprezentowane później; aby przygotować nicienie do treningu, należy dodać 3-4 mL buforu M9 do probówki i pozostawić nicienie do zagłodzenia w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przygotuj płytki kondycjonujące, nakładając 2 µL 10% butanolu w 95% etanolu na wewnętrzną stronę pokrywek płytek NGM o średnicy 60 mm, na które naniesiono 500 µL E. coli szczepu OP50. Wyjmij probówkę z zagłodzonymi nicnieniami i za pomocą pipety P1000 przenieś 100-200 µL zawiesiny nicieni na każdą z płytek kondycjonujących. Po kondycjonowaniu inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Zmyj nicienie z płytek, używając około 1 ml buforu M9, i przenieś je do 15 ml probówki stożkowej. Powtarzaj wcześniej zaprezentowaną metodę delikatnego płukania, aż bufor stanie się przejrzysty. Po wypłukaniu można odseparować część nicieni i poddać je testowi chemotaksji, aby służyły jako grupa czasu zero dla jednokrotnego uczenia asocjacyjnego (1x mast associative learning) w celu przygotowania płytek reprezentujących kolejne punkty czasowe.

Przenieś od 100 do 200 µL nicieni na zaszczepione płytki NGM o średnicy 60 mm. Inkubuj te płytki po kondycjonowaniu przez 0,5, 1 lub 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po każdym punkcie czasowym delikatnie zmyj nicienie z płytek do probówki stożkowej o pojemności 15 mL i powtórz tę czynność jeszcze jeden lub dwa razy.

Po zastosowaniu buforu M9 zgodnie z tymi samymi procedurami delikatnego płukania, pamięć asocjacyjna krótkotrwała jest testowana przy użyciu testu chemotaksji, który zostanie zaprezentowany w dalszej części. Przygotuj płytki warunkujące oraz nicienie w sposób zaprezentowany dla treningu krótkotrwałego, jednak inkubuj nicienie w temperaturze pokojowej tylko przez 30 minut. Po inkubacji zbierz nicienie zgodnie z wcześniej zaprezentowaną procedurą.

Przenieś je na niezasiane płyty NGM o średnicy 60 mm. Głodź nicienie na niezasianych płytach w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu głodówki przemyj nicienie buforem M9 i umieść je ponownie w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml. Powtarzaj te kroki, aż do momentu ukończenia łącznie siedmiu bloków kondycjonujących i sześciu bloków głodówkowych.

Po zakończeniu kondycjonowania zmyć nicienie z płytek kondycjonujących z powrotem do probówki stożkowej. Jak pokazano wcześniej, grupę nicieni można wykorzystać do testowania uczenia się asocjacyjnego z siedmioma odstępami czasu bezpośrednio po kondycjonowaniu. Przenieś pozostałą populację nicieni na płytki HGM o średnicy 100 milimetrów z naniesionym jednym mililitrem OP 50.

Ponownie nanieś od 100 do 200 µL zawiesiny nicieni na płytkę, aby zapewnić odpowiednią ilość bakterii do podtrzymania populacji. Inkubuj płytki po kondycjonowaniu w temperaturze 20 °C przez 16, 24 lub 40 godzin, co odpowiada punktom czasowym pamięci asocjacyjnej długotrwałej, w celu przetestowania długotrwałej pamięci asocjacyjnej dotyczącej powiązania pokarmu z butanonem. Delikatnie zmyj nicienie z płytek do probówki stożkowej o pojemności 15 mL, a następnie przemyj je jeden lub dwa razy buforem M9 po każdym punkcie czasowym i poddaj nicienie analizie w teście chemotaksji.

Aby przygotować płytki do testu chemotaksji, zaznacz dno nieułożonych płytek NGM o średnicy 100 milimetrów w trzech miejscach w pobliżu krawędzi, tak jak pokazano tutaj. Nanieś 1 µL 1 M azotku sodu w punktach dla substancji zapachowej oraz kontrolnych. Czynność tę wykonaj nie wcześniej niż 15 minut przed rozpoczęciem testu, aby zminimalizować dyfuzję środków paraliżujących.

W kolejnym kroku nanieś po jednym mikrolitrze 95% ethanol i 10% butone na odpowiednie miejsca na oznakowanej płytce testowej. Nanieś je na wcześniej naniesiony azydowek sodu. Usuń z probówki z osadzonymi nicieniami jak największą ilość buforu M nine.

Używając pipety P 20 z końcówką o ściętym wierzchołku, nanieś 15 µL zawiesiny nicieni w trzech interwałach po 5 µL na punkt startowy płytki testowej. Następnie skręć róg chusteczki Kimwipe w ostry punkt i użyj go do odsączenia nadmiaru buforu M9, uważając, aby nie przebić agaru.

Usunięcie nadmiaru buforu uwalnia nicienie na płytkę testową. W przypadku zastosowania obrazowania do liczenia zwierząt, zdjęcie miejsca startu wykonane bezpośrednio po tym uwolnieniu pozwoli określić całkowitą liczbę osobników na płytce testowej. Inkubuj płytkę do testu chemotaksji przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji, a następnie policz liczbę nicieni w miejscach aplikacji etanolu i butanonu w punkcie startowym, a także całkowitą liczbę nicieni na płytce testowej.

Zazwyczaj nicienie sparaliżowane azotkiem sodu znajdują się w promieniu jednego centymetra od plam i pozostają wyprostowane. Przy dużej liczbie zwierząt ułożonych warstwowo można je przeliczyć ręcznie lub określić ich liczbę za pomocą oprogramowania do obrazowania i analizy. Preferujemy tę drugą metodę ze względu na łatwość i niezawodność wyników.

Po oszacowaniu liczby nicieni w punktach początkowych z etanolem i butononem, oblicz indeks KeyAx zgodnie z przedstawionym schematem. Typowy naiwny indeks chemotaksji dla nicieni typu dzikiego reagujących na 10% Butone wynosi około 0,2. Trening typu „mass” lub „spaced” zazwyczaj zwiększa indeks CHEMOTAXIS do poziomu 0,7–0,8 w czasie zero, co daje indeks uczenia się na poziomie około 0,6.

Naiwna chemotaksja jest bardzo wrażliwa na odpowiednią pielęgnację nicieni. Rysunek ten demonstruje wyraźną różnicę w CI pomiędzy dobrze odżywionymi a głodnymi naiwnymi nicieniami i podkreśla znaczenie prawidłowej techniki. Retencja pamięci odzwierciedlona jest w czasie, po którym indeks chemotaksji powraca do poziomów naiwnych, gdy indeks uczenia się u zwierząt typu dzikiego wynosi zero.

Krótkotrwała pamięć asocjacyjna zaczyna zanikać po upływie jednej godziny od treningu masowego trwającego około dwóch godzin i w porównaniu z nią jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego kreb. Długotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj nie zaczyna znacząco zanikać aż do 16 godzin po treningu rozprzestrzonym trwającym do 40 godzin i jest zależna od Creb. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że testy chemotaksji mogą być pod wpływem głodzenia lub nadmiernych zapachów w środowisku, a także że pamięć i nicienie mogą zostać zaburzone przez zbyt silne wstrząsanie mechaniczne.