Name: Neuroanatomiczne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego u wielu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego fenotypowania myszy metodą MRI, obejmującą obrazowanie in vivo i ex vivo. Technika ta umożliwia uzyskanie trójwymiarowych obrazów mózgu z zachowaniem całkowitej anatomii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest częścią Mouse Imaging Centre (MICe) w Hospital for Sick Children oraz na Uniwersytecie w Toronto.

1. Wielomyszowe obrazowanie mózgu in vivo:
Podczas obrazowania żywych zwierząt, w trakcie całej sesji muszą być zapewnione następujące kluczowe elementy: 1) bezpieczna metoda znieczulenia, 2) kontrola środowiskowa oraz 3) monitorowanie fizjologiczne. Ponadto, przy jednoczesnym obrazowaniu wielu osobników pojawiają się dodatkowe trudności związane z łatwością i szybkością przygotowania oraz z powtarzalnością ułożenia zwierząt w celu ułatwienia rejestracji obrazów. W związku z tym zaprojektowano i wykonano trzy główne niestandardowe komponenty: system wprowadzający do umieszczania myszy w cewkach RF wewnątrz MRI, komorę indukcyjną ułatwiającą przygotowanie oraz platformę z wbudowanymi przewodami monitorującymi w celu standaryzacji pozycji.
System ładowania:
System wprowadzania myszy składa się z dwóch głównych części: „ula dla myszy” (mouse hive) oraz „matrycy ładunkowej” (loading array). Główną funkcją ula dla myszy jest rozmieszczenie siedmiu cewek RF Millipede (Varian NMR Systems, Palo Alto, CA) w układzie sześciokątnym wewnątrz otworu magnesu. Matryca ładunkowa służy do utrzymywania i transportu wielu myszy umieszczonych w 50 mililitrowych probówkach wirówkowych, w których końcówkach wykonano otwory umożliwiające dopływ gazu anestetycznego. Po znieczuleniu myszy i podłączeniu ich do sprzętu monitorującego w strefie przygotowawczej w pobliżu magnesu, są one umieszczane w zmodyfikowanych probówkach wirówkowych i montowane na matrycy ładunkowej. Po zamontowaniu wszystkich myszy matryca ładunkowa jest transportowana, wprowadzana do magnesu i ustawiana na systemie szynowym. System szynowy umożliwia sprzężenie matrycy z ulem dla myszy podczas wsuwania jej w głąb otworu magnesu. Po pełnym wprowadzeniu do magnesu probówki wirówkowe łączą się z systemem podawania anestetyku wewnątrz cewek RF. Izofluran zmieszany z tlenem jest dostarczany z końca ula dla myszy do próbki za pomocą rurki przebiegającej wzdłuż osi każdej poszczególnej cewki. Ta mieszanina gazów anestetycznych przepływa do probówek, mija myszy i jest zbierana przez aktywną jednostkę odprowadzającą gaz, przymocowaną do tyłu matrycy ładunkowej (Rycina 1).
Komora indukcyjna:
Ponieważ czas obrazowania może trwać do trzech godzin, zminimalizowanie czasu przygotowania zwierząt jest kluczowe w celu ograniczenia ekspozycji myszy na anestetyki. W związku z tym opracowaliśmy specjalną komorę indukcyjną, aby usprawnić proces przygotowania (Rysunek 2). Specjalna komora indukcyjna tworzy jednolite środowisko zarówno do indukcji, jak i obsługi wielu myszy. Komora indukcyjna, wykonana z przezroczystego akrylu, posiada samozamykające się silikonowe porty przysłonowe, aby zminimalizować wyciek środka anestetycznego i umożliwić użytkownikowi dostęp do wnętrza bez konieczności używania specjalnych rękawiczek. W porównaniu do konwencjonalnych masek i obwodów dla pojedynczej myszy, komora indukcyjna jest wystarczająco duża, aby pomieścić do dwudziestu myszy i pozwala na swobodną manipulację zwierzętami bez konieczności mocowania uciążliwych rurek i masek. Urządzenie jest zaopatrywane w stały przepływ gazu anestetycznego, który jest zbierany za pomocą pasywnego systemu odprowadzającego. Do podgrzewania dna komory w celu utrzymania temperatury ciała zwierząt podczas przygotowania zastosowano rezystancyjne elementy grzejne.
Sanie:
Jednym z najbardziej uciążliwych i czasochłonnych etapów przygotowania myszy do badania MRI jest zakładanie elektrod elektrokardiograficznych (ECG) oraz sondy temperatury rektalnej. Ponadto stwierdzono, że wiele konwencjonalnych elektrod, takich jak elektrody mankietowe i igłowe, zniekształca postawę zwierzęcia, co utrudnia standaryzację pozycjonowania. W związku z tym opracowaliśmy specjalnie dopasowaną platformę pozycjonującą z wbudowanymi sondami ECG, oddechowymi i temperaturowymi, zwaną „sankami” (U.S. Patent 7,146,936) (Rysunek 3). Do ograniczenia ruchów głowy zastosowano mocowania wykonane z rzepów.
Kroki obrazowania mózgu in vivo u wielu myszy:
<ol>
<li>Wszystkie badania na myszach wymagają lokalnej zgody ACC (Animal Care Committee), IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) lub równoważnego organu w zakresie procedur postępowania z myszami.</li>
<li>Wszystkie procedury, takie jak identyfikacja i ważenie zwierząt, powinny być wykonywane w szafce bezpieczeństwa biologicznego (BSC) oraz w jednostce MRI. Zwierzęta są przenoszone do autoklawowalnego plastikowego pojemnika i transportowane do komory indukcyjnej MRI.</li>
<li>Myszy są znieczulane w podgrzanej komorze indukcyjnej przy użyciu 4% izofluranu i 4 L/min tlenu. Zwierzęta uznaje się za w pełni znieczulone, gdy przestają reagować na uciśnięcie łapy. W razie potrzeby usuwa się sierść z klatki piersiowej za pomocą depilatora (NAIR), aby zapewnić lepszy kontakt z urządzeniami do monitorowania EKG i temperatury, które zostały wbudowane w specjalną prowadnicę. Do oczu aplikuje się maść (Tears Naturale P.M.), aby zapobiec ich wysychaniu, a podskórnie podaje się około 0,3 mL soli fizjologicznej w celu utrzymania nawodnienia.</li>
<li>Jeśli wymagane jest wzmocnienie kontrastowe, można zastosować Gd-DTPA-BMA (Omniscan). W przypadku użycia Gd-DTPA, należy go rozcieńczyć w soli fizjologicznej (objętość końcowa 300uL) i podać jednorazowo w dawce 1 mmol/kg drogą IP przed sesją MR.</li>
<li>Następnie myszy umieszcza się w indywidualnych prowadnicach, unieruchamia pasami na głowie i wsuwa do otwartych probówek stożkowych o pojemności 50mL (Rysunek 3). Jednorazowo można przeskanować do 7 żywych myszy. Po umieszczeniu wszystkich zwierząt i podłączeniu monitoringu fizjologicznego, ustawia się poziom izofluranu w szybie magnesu na 2%, a poziom tlenu na 8 L/min.</li>
<li>Probówki stożkowe są montowane w systemie dokującym (Rysunek 1), zaprojektowanym w celu jednolitego pozycjonowania myszy w każdej cewce RF umieszczonej w centrum szybu magnesu. Po zamontowaniu poziom izofluranu można zredukować do 0,9-2%. Przez cały czas trwania skanowania monitorowane jest EKG i temperatura każdego zwierzęcia. Podczas skanowania zwierzęta są ogrzewane za pomocą ciepłego powietrza.</li>
<li>Czas trwania każdego skanu trójwymiarowego wynosi około 3 godzin. Parametry są następujące: szybkie echo spinowe z TR 2300 ms i TEeff 36 ms. Długość pociągu ech wynosi 8 przy 1 średniej. Uzyskana rozdzielczość obrazu to 125 μm (Rysunek 4).</li>
<li>Po zakończeniu skanowania zwierzęta są wyjmowane z magnesu i przekładane do ciepłej komory indukcyjnej wypełnionej 100% tlenem. Zwierzęta są przenoszone do szczelnych plastikowych pojemników i transportowane w szafce BSC. Są one umieszczane w ciepłej klatce bez przeciągów i pozostawione do wybudzenia z narkozy.</li>
</ol>
2. Obrazowanie mózgu wielu myszy ex vivo:
Obrazowanie MR tkanek utrwalonych, które nie jest podatne na artefakty ruchowe, pozwala na uzyskanie wyższej rozdzielczości niż obrazowanie in vivo. Trójwymiarowe zbiory danych o wysokiej rozdzielczości zapewniają maksymalną elastyczność w pozyskiwaniu informacji ilościowych i umożliwiają zautomatyzowaną analizę obrazu. Opracowano specjalistyczną macierz cewek RF do równoległego pozyskiwania 16 wysokorozdzielczych zbiorów danych MR utrwalonych mózgów myszy w czaszce podczas całonocnych sesji skanowania.
16-kanałowa cewka do obrazowania mózgu ex vivo:
Aby umożliwić jednoczesne obrazowanie 16 próbek, zbudowano niestandardową macierz 16 cewek solenoidowych. Konstrukcja ta stanowi udoskonalenie wcześniejszego prototypu, który służył do jednoczesnego obrazowania trzech próbek w zestawie gradientowym z wkładką 60 mm. Cewki solenoidowe z 8 zwojami są nadwijane na końcach, aby zapewnić jednorodną czułość z dokładnością do 10% na długości 26 mm, i są indywidualnie ekranowane w modułowych przedziałach (Idziak and Haeberlen, 1982). 16 przedziałów cewek jest zamocowanych do ramy (Rysunek 5), która pozycjonuje cewki wewnątrz gradientu i unieruchamia je za pomocą pneumatycznego pęcherza w celu zminimalizowania ruchu.
Etapy obrazowania mózgu ex vivo wielu myszy:
<ol>
<li>Otwórz jamę klatki piersiowej i wprowadź igłę (lub zestaw infuzyjny ze skrzydełkami Safety, 25G X 3⁄4) do lewej komory serca znieczuczonej myszy (znieczulenie wykonane poprzez wtrysk dootrzewnowy ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg)). Przetnij prawy przedsionek.</li>
<li>Przeprowadź płukanie perfuzyjne przezsercowe przy użyciu 30 mL 1X PBS w temperaturze pokojowej + 1 μL/mL heparyny (1000 jednostek USP/mL) + 2 mM ProHance z prędkością przepływu około 100 mL/hr.</li>
<li>Wykonaj etap utrwalania przy użyciu 30 mL 4% PFA (temperatura pokojowa) + 2 mM ProHance z prędkością 100 mL/hr.</li>
<li>Wykonaj dekapitację i usuń skórę, dolną szczękę, uszy oraz chrzęstną część nosa.</li>
<li>Umieść pozostałą strukturę czaszki w 4% PFA + 2 mM ProHance na noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przenieś do 1X PBS + 0,02% azotku sodu + 2 mM ProHance.</li>
<li>Wysokorozdzielcze trójwymiarowe skanowanie MRI przy 7 Tesla odbywa się w odstępie od 4 dni do maksymalnie 2,5 miesiąca po perfuzji. Mózgi są umieszczane w 16-kanałowej matrycy cewek solenoidowych (Rycina 5).</li>
<li>Parametry obrazowania są następujące: szybkie echo spinowe z TR 325 ms i TEeff 30 ms, długość pociągu ech równa 6 przy 4 uśrednieniach. Obrazy końcowe mają rozdzielczość izotropową 32 μm (Rycina 6), a czas skanowania wynosi około 12 godzin.</li>
<li>Po skanowaniu umieść czaszkę w 10% formalinie + 2 mM ProHance w celu konserwacji.</li>
</ol>

3. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig1.jpg" alt="Schemat ustawienia wirówki z probówkami do separacji eksperymentalnej w badaniach laboratoryjnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. System załadunkowy dla myszy. „Układ załadunkowy” i „ul dla myszy” połączone wspólnym systemem szyn z włókna szklanego.
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig2.jpg" alt="Układ komory anestetycznej; port przysłonowy, zestaw do załadunku; konfiguracja procedury do kontrolowanego podawania gazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Komora indukcyjna.
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig3.jpg" alt="Układy eksperymentalne dla gryzoni: A. system unieruchamiający z elektrodami EKG, B. strzykawka do manipulacji zwierzętami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. a) Sanki, z widocznymi wbudowanymi czujnikami monitorującymi oraz stabilizatorem głowy. b) Znieczulona mysz na sankach z przymocowanym stabilizatorem głowy. Zespół sankowy łatwo wsuwa się do probówki wirówki.
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig4.jpg" alt="Seria skanów MRI przedstawiająca przekroje mózgu, analiza obrazowania medycznego, metoda diagnostyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywny in vivo wielokrotne obrazy mózgu z jednego trójgodzinnego skanowania trójwymiarowego.
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig5.jpg" alt="Układ spektroskopii wielokanałowej z macierzą czujników, wykorzystywany do badań wzbudzeń optycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. 16-kanałowa macierz cewek solenoidowych do skanowania 16 utrwalonych preparatów mózgu.
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig6.jpg" alt="Skan MRI mózgu przedstawiający przekroje czołowe, strzałkowe i osiowe; schemat anatomiczny badania neuroobrazowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Reprezentatywny obraz mózgu ex-vivo.

<ol><li>Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-mouse+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple-mouse MRI.</a> Magn. Reson. Med. 49, 158-167 (2003).</li>
<li>Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mouse+biological+loading+and+monitoring+system+for+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI.</a> Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).</li>
<li>Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+revealed+in+the+structure+of+the+mouse+brain+using+three-dimensional+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging.</a> NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).</li>
<li>Idziak, S., Haeberlen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+high+homogeneity+rf+coil+for+solid-state+multiple-pulse+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR.</a> J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Zarówno systemy obrazowania myszy in vivo, jak i ex vivo pozwalają na obrazowanie wielu osobników jednocześnie, co znacząco zwiększa przepustowość badań obrazowych bez wydłużania czasu ich trwania. Obrazy mózgu uzyskane obiema technikami obrazowania wielu myszy, zarówno in vivo, jak i ex vivo, charakteryzują się wysoką jakością i są odpowiednie odpowiednio do fenotypowania głównych i mniejszych struktur w mózgu myszy.
Aby zminimalizować czas przygotowania wielu okazów zwierzęcych, kluczowe znaczenie ma równoległe prowadzenie procesów. Na przykład opracowanie komory indukcyjnej umożliwiło jednoczesną indukcję wielu okazów, a sani synchronizują aplikację sond EKG i temperatury, standaryzując jednocześnie ułożenie ciała. Ponadto nasz system obrazowania ex vivo pozwala na jednoczesne uzyskanie trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości 16 utrwalonych całych mózgów, co jest idealnym rozwiązaniem dla wysokoprzepustowych badań fenotypowych.
Do możliwych ograniczeń naszego systemu obrazowania in vivo należy brak możliwości indywidualnej kontroli znieczulenia i temperatury dla każdej myszy. W razie potrzeby indywidualną kontrolę znieczulenia można wprowadzić poprzez dodanie oddzielnych parowników anestetycznych dla każdej myszy. Kolejnym ograniczeniem systemu obrazowania in vivo jest fakt, że skanowanie jest ograniczone do myszy o masie mniejszej niż około 32 g. Obecnie istnieją jednak plany zwiększenia rozmiaru cewki, aby umożliwić badanie większych zwierząt.

<table><tbody><tr><td>Izofluran, USP (AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>CA2L9108</td><td></td></tr><tr><td>NAIR</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Omniscan (gadodiamid w zastrzykach USP)</td><td>GE Healthcare</td><td>J-110A</td><td></td></tr><tr><td>Dedykowane sanki (Custom Sleds)</td><td>Dazai Research Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca i Mg</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna 10000USP/10ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>ProHance (gadoteridol w zastrzykach USP)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>11181</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (proszek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr></tbody></table>

neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Dziedzina fenotypowania myszy za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) rozwija się gwałtownie, co jest podyktowane potrzebą udoskonalenia narzędzi do charakteryzowania i oceny modeli mysich chorób ludzkich. MRI stanowi doskonałą metodę badania zwierząt z modyfikacjami genetycznymi. Umożliwia ono objęcie obrazowaniem całego mózgu, może być stosowane in vivo i zapewnia wiele mechanizmów kontrastowania do badania różnych aspektów neuroanatomii oraz fizjologii. Pojawienie się skanerów wysokopolowych wraz z możliwością jednoczesnego skanowania wielu myszy pozwala na szybkie fenotypowanie nowych mutacji.
Skuteczne badania MRI u myszy wymagają uwagi wielu aspektów projektu eksperymentu. W niniejszym artykule opiszemy ogólne metody pozyskiwania wysokiej jakości obrazów do fenotypowania myszy z wykorzystaniem systemu, który obrazuje myszy jednocześnie w ekranowanych cewkach nadawczo-odbiorczych częstotliwości radiowej (RF) w wspólnym magnesie (Bock et al., 2003). Skupiamy się szczególnie na fenotypowaniu anatomicznym, ważnym i dostępnym zastosowaniu, które wykazało duży potencjał wpływu w wielu modelach mysich w naszym centrum obrazowania. Zanim przejdziemy do szczegółowych kroków pozyskiwania takich obrazów, należy zwrócić uwagę na istotne kwestie praktyczne dotyczące zarówno obrazowania mózgu in vivo (Dazai et al., 2004), jak i obrazowania mózgu ex vivo (Spring et al., 2007). Są one omówione poniżej.

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Dziedzina fenotypowania myszy z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) rozwija się w szybkim tempie, co jest podyktowane potrzebą opracowania lepszych narzędzi do charakteryzowania i ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego fenotypowania żywych lub utrwalonych myszy z wykorzystaniem wielokrotnego obrazowania MRI mózgu myszy. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie znieczulenie każdej myszy. Następnie, w przypadku skanowania in vivo, każdą mysz należy umieścić na sance o odpowiednim rozmiarze przed zamontowaniem w matrycy ładunkowej i wprowadzeniem do otworu magnesu.W przypadku obrazowania ex vivo należy przeprowadzić perfuzję przezsercową, wyizolować strukturę czaszki i umieścić ją w probówkach do obrazowania, które następnie wprowadza się do 16-kanałowej matrycy cewek solenoidowych umieszczonej w otworze magnesu. W efekcie można uzyskać trójwymiarowe wolumeny obrazowania rezonansem magnetycznym, które ukazują wysokiej jakości obrazy mózgu odpowiednie do fenotypowania głównych i pobocznych struktur mózgu myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histologia, jest zachowanie anatomii makroskopowej preparatów wewnątrz czaszek oraz możliwość objęcia obrazowaniem całego mózgu i przeprowadzenia analizy trójwymiarowej.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biomedycznych, takie jak związek między genami a różnicami anatomicznymi reprezentującymi fenotypy w mysim modelu choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką zauważą, że do obrazowania mózgu o wysokiej przepustowości niezbędne jest opracowanie niestandardowych zestawów do pozycjonowania myszy oraz cewek częstotliwości radiowej. Najbardziej wymagające są procedury takie jak identyfikacja i ważenie. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy uzyskać zgodę na wszystkie procedury obchodzenia się z zwierzętami od lokalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami, instytucjonalnego komitetu ds. opieki i wykorzystania zwierząt (IACUC) lub równoważnego organu w Twojej instytucji.Nagrania zwierząt należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie należy przenieść zwierzęta do autoklawowalnego pojemnika plastikowego w celu transportu do komory indukcyjnej MRI. Zwierzęta przeznaczone do skanowania należy zanestetyzować w wstępnie ogrzanej komorze indukcyjnej, stosując 4% izofluranu i cztery litry na minutę tlenu.Zwierzęta uznaje się za w pełni znieczulone, gdy przestają reagować na uciśnięcie łapy. W razie potrzeby futro z klatki piersiowej można usunąć za pomocą depilatora, np. nare, aby zapewnić lepszy kontakt z urządzeniami do monitorowania EKG i temperatury wbudowanymi w specjalistyczną sanię. Należy również zastosować zamiennik łez, np. natural PMM, do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu, oraz podać około 0,3 milliliters soli fizjologicznej poprzez wstrzyknięcie podskórne.Aby nawodnić zwierzęta. Teraz umieść myszy na indywidualnych saniach z wbudowanymi sondami do EKG, pomiaru oddechu i temperatury. Należy uważać, aby przednie i tylne kończyny znalazły się w zagłębieniach znajdujących się na saniach.W przypadkach, gdy wymagane jest monitorowanie EKG, należy upewnić się, że obszary pozbawione owłosienia na brzusznej stronie myszy pokrywają się z elektrodami EKG, unieruchomić każde zwierzę za pomocą paska na głowę i paska na nos, a następnie wsunąć każdą sanię do otwartej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. W jednej sesji obrazowania do skanowania można przygotować do siedmiu żywych myszy. Następnie należy zamocować probówki stożkowe w matrycy ładującej.Upewnij się, że wszystkie linie monitorowania fizjologicznego zostały podłączone po załadowaniu wszystkich zwierząt. Ustaw poziom izofluranu w otworze magnesu na 2% oraz poziom tlenu na osiem litrów na minutę. Następnie przetransportuj układ załadowczy do magnesu i umieść go na systemie szynowym.Należy użyć systemu szynowego, aby połączyć zestaw ładujący z ulem dla myszy, który został zaprojektowany w celu równomiernego rozmieszczenia myszy w każdej cewce wysokiej częstotliwości umieszczonej w centrum otworu magnesu. Po pełnym wsunięciu do magnesu probówki wirówkowe łączą się z systemem podawania znieczulenia wewnątrz cewek RF, jak pokazano tutaj; mieszanina fluorku ISOF z tlenem jest dostarczana z ula dla myszy do preparatu za pomocą rurki biegnącej wzdłuż osi każdej poszczególnej cewki. Ta mieszanina gazów znieczulających przepływa przez probówki obok myszy i jest zbierana przez aktywną jednostkę odprowadzającą przymocowaną do tylnej części zestawu ładującego.W zależności od odczytów fizjologicznych zwierząt, takich jak oddychanie i temperatura, poziom izofluranu należy ustawić w przedziale od 0,9 do 2%. Następnie należy przeprowadzić skanowanie zwierząt przy użyciu szybkiej sekwencji echo bin. Czas trwania każdego skanowania trójwymiarowego wynosi około trzech godzin, a wynikowa rozdzielczość obrazu to 125 micrometers. Należy stale monitorować odczyty EKG, oddychanie oraz temperaturę każdego zwierzęcia przez cały czas trwania skanowania.Podczas sesji skanowania zwierzęta należy również utrzymywać w cieple za pomocą strumienia ogrzanego powietrza. Po zakończeniu skanowania należy wyjąć zestaw ładunkowy z magnesu i umieścić go w ciepłej komorze indukcyjnej wypełnionej 100% tlenem. Należy wyjąć zwierzęta z probówek i przenieść je do szczelnych plastikowych pojemników w celu transportu do komory bezpiecznej biologicznie.Na koniec umieść zwierzęta w ciepłej klatce, w której nie ma przeciągów, i pozwól im dojść do siebie po znieczuleniu przed obrazowaniem exvivo. Najpierw w pełni znieczul zwierzęta, stosując dożylne wstrzyknięcie kombinacji ketaminy i ksylazyny. Przed rozpoczęciem perfuzji oceń głębokość znieczulenia chirurgicznego za pomocą ucisku palca lub łapy.Otwórz jamę klatki piersiowej i wprowadź igłę lub bezpieczny zestaw do infuzji z prowadnicą do lewej komory serca. Następnie przetnij prawy przedsionek, aby rozpocząć perfuzję przezsercową. W pierwszej kolejności przepłucz układ 30 ml soli fizjologicznej PBS w temperaturze pokojowej, zmieszanej z 1 µL/ml heparyny i 2 mM pronase, stosując szybkość przepływu wynoszącą około 100 ml/h.Powinno to zająć około 20 minut. Następnie przeprowadź kolejną utrwalanie, stosując 30 mililitrów 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej, zmieszanego z 2 milimolarnym roztworem probenzołu, przy przepływie 100 mililitrów na godzinę. Teraz zdekapituj zwierzę i usuń skórę, dolną szczękę, uszy oraz chrzęstną część czubka nosa.Następnie pozostałą strukturę czaszki należy umieścić w 4% paraformaldehydzie wymieszanym z 2 mM probenzoilu i pozostawić przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia preparat należy przenieść do roztworu 1x fosforanu buforu soli (PBS) z dodatkiem 0,02% azotku sodu oraz 2 mM probenzoilu w celu konserwacji. Skanowanie MRI 3D o wysokiej rozdzielczości przy 7 Tesla powinno odbyć się w odstępie co najmniej czterech dni, ale nie później niż po dwóch i pół miesiąca.Po perfuzji. Umieść mózgi przeznaczone do obrazowania w 16-kanałowej macierzy cewek solenoidowych, a następnie wprowadź ją do skanera. Następnie przeprowadź skanowanie preparatów przy użyciu sekwencji fast spin echo.Czas trwania tego skanowania wynosi około 12 godzin, a końcowe obrazy będą miały rozdzielczość izotropową 32 micrometers. Po zakończeniu skanowania należy wyjąć preparaty z cewki obrazującej i umieścić każdą czaszkę w 10% roztworze formaliny z 2 millimolar pro hands w celu konserwacji reprezentatywnej in vivo. Przedstawiono tutaj liczne obrazy mózgów myszy z jednego trzymiesięcznego skanowania.Rysunek ten przedstawia trzy osie widoku dla każdej z siedmiu przeskanowanych myszy. Tutaj zaprezentowano reprezentatywny obraz mózgu ex vivo o izotropowej rozdzielczości 32 mikronów. A tutaj możemy zobaczyć renderowanie 3D wolumenu obrazu ex vivo po przetworzeniu.Tę technikę in vivo można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Metoda ta może być stosowana przez badaczy w wielu dziedzinach biomedycznych do badania chorób takich jak toczeń, choroba Huntingtona i choroba Alzheimera w modelu mysim. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak obrazować zarówno żywe, jak i utrwalone obiekty, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy mózgu za pomocą MRI.Dziękujemy za oglądanie.

multiple-mouse-neuroanatomical-magnetic-resonance-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wielomyszy obrazowanie magnetycznego rezonansu anatomicznego

Niniejsza praca opisuje podstawowe procedury nieinwazyjnego obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS) małych zwierząt in vivo.

Nieinwazyjne in vivo MRI i MRS małych zwierząt: Podstawowe procedury eksperymentalne

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Ten protokół opisuje kwantyfikację wolumetrycznych zmian hemodynamicznych mózgu w mózgu myszy za pomocą funkcjonalnych ultradźwięków (fUS). Procedury dla mapy aktywacji funkcjonalnej 3D po stymulacji sensorycznej, a także łączności funkcjonalnej w stanie spoczynku są przedstawione jako przykłady ilustracyjne u myszy znieczulonych i obudzonych.

Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Protokół ten wykorzystuje wielokomorowe łóżko do równoległego rezonansu magnetycznego (MRI) do czterech zwierząt do wykrywania guzów gruczolakoraka trzustki w genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Ten protokół MRI wielozwierzęcy jest szybki i opłacalny w wykrywaniu i pomiarze guzów, ułatwiając selekcję zwierząt do badań przedklinicznych oraz podłużne monitorowanie wzrostu guzów.

Wielozwierzęce obrazowanie rezonansu magnetycznego do pomiarów guza w myszych modelach raka trzustki

Poznaj metodę wysokoprzepustowego fenotypowania myszy metodą MRI, obejmującą obrazowanie in vivo i ex vivo. Technika ta umożliwia uzyskanie trójwymiarowych obrazów mózgu z zachowaniem całkowitej anatomii.

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Przeglądaj więcej filmów