Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego fenotypowania żywych lub utrwalonych myszy z wykorzystaniem wielokrotnego obrazowania MRI mózgu myszy. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie znieczulenie każdej myszy. Następnie, w przypadku skanowania in vivo, każdą mysz należy umieścić na sance o odpowiednim rozmiarze przed zamontowaniem w matrycy ładunkowej i wprowadzeniem do otworu magnesu.

W przypadku obrazowania ex vivo należy przeprowadzić perfuzję przezsercową, wyizolować strukturę czaszki i umieścić ją w probówkach do obrazowania, które następnie wprowadza się do 16-kanałowej matrycy cewek solenoidowych umieszczonej w otworze magnesu. W efekcie można uzyskać trójwymiarowe wolumeny obrazowania rezonansem magnetycznym, które ukazują wysokiej jakości obrazy mózgu odpowiednie do fenotypowania głównych i pobocznych struktur mózgu myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histologia, jest zachowanie anatomii makroskopowej preparatów wewnątrz czaszek oraz możliwość objęcia obrazowaniem całego mózgu i przeprowadzenia analizy trójwymiarowej.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biomedycznych, takie jak związek między genami a różnicami anatomicznymi reprezentującymi fenotypy w mysim modelu choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką zauważą, że do obrazowania mózgu o wysokiej przepustowości niezbędne jest opracowanie niestandardowych zestawów do pozycjonowania myszy oraz cewek częstotliwości radiowej. Najbardziej wymagające są procedury takie jak identyfikacja i ważenie. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy uzyskać zgodę na wszystkie procedury obchodzenia się z zwierzętami od lokalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami, instytucjonalnego komitetu ds. opieki i wykorzystania zwierząt (IACUC) lub równoważnego organu w Twojej instytucji.

Nagrania zwierząt należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie należy przenieść zwierzęta do autoklawowalnego pojemnika plastikowego w celu transportu do komory indukcyjnej MRI. Zwierzęta przeznaczone do skanowania należy zanestetyzować w wstępnie ogrzanej komorze indukcyjnej, stosując 4% izofluranu i cztery litry na minutę tlenu.

Zwierzęta uznaje się za w pełni znieczulone, gdy przestają reagować na uciśnięcie łapy. W razie potrzeby futro z klatki piersiowej można usunąć za pomocą depilatora, np. nare, aby zapewnić lepszy kontakt z urządzeniami do monitorowania EKG i temperatury wbudowanymi w specjalistyczną sanię. Należy również zastosować zamiennik łez, np. natural PMM, do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu, oraz podać około 0,3 milliliters soli fizjologicznej poprzez wstrzyknięcie podskórne.

Aby nawodnić zwierzęta. Teraz umieść myszy na indywidualnych saniach z wbudowanymi sondami do EKG, pomiaru oddechu i temperatury. Należy uważać, aby przednie i tylne kończyny znalazły się w zagłębieniach znajdujących się na saniach.

W przypadkach, gdy wymagane jest monitorowanie EKG, należy upewnić się, że obszary pozbawione owłosienia na brzusznej stronie myszy pokrywają się z elektrodami EKG, unieruchomić każde zwierzę za pomocą paska na głowę i paska na nos, a następnie wsunąć każdą sanię do otwartej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. W jednej sesji obrazowania do skanowania można przygotować do siedmiu żywych myszy. Następnie należy zamocować probówki stożkowe w matrycy ładującej.

Upewnij się, że wszystkie linie monitorowania fizjologicznego zostały podłączone po załadowaniu wszystkich zwierząt. Ustaw poziom izofluranu w otworze magnesu na 2% oraz poziom tlenu na osiem litrów na minutę. Następnie przetransportuj układ załadowczy do magnesu i umieść go na systemie szynowym.

Należy użyć systemu szynowego, aby połączyć zestaw ładujący z ulem dla myszy, który został zaprojektowany w celu równomiernego rozmieszczenia myszy w każdej cewce wysokiej częstotliwości umieszczonej w centrum otworu magnesu. Po pełnym wsunięciu do magnesu probówki wirówkowe łączą się z systemem podawania znieczulenia wewnątrz cewek RF, jak pokazano tutaj; mieszanina fluorku ISOF z tlenem jest dostarczana z ula dla myszy do preparatu za pomocą rurki biegnącej wzdłuż osi każdej poszczególnej cewki. Ta mieszanina gazów znieczulających przepływa przez probówki obok myszy i jest zbierana przez aktywną jednostkę odprowadzającą przymocowaną do tylnej części zestawu ładującego.

W zależności od odczytów fizjologicznych zwierząt, takich jak oddychanie i temperatura, poziom izofluranu należy ustawić w przedziale od 0,9 do 2%. Następnie należy przeprowadzić skanowanie zwierząt przy użyciu szybkiej sekwencji echo bin. Czas trwania każdego skanowania trójwymiarowego wynosi około trzech godzin, a wynikowa rozdzielczość obrazu to 125 micrometers. Należy stale monitorować odczyty EKG, oddychanie oraz temperaturę każdego zwierzęcia przez cały czas trwania skanowania.

Podczas sesji skanowania zwierzęta należy również utrzymywać w cieple za pomocą strumienia ogrzanego powietrza. Po zakończeniu skanowania należy wyjąć zestaw ładunkowy z magnesu i umieścić go w ciepłej komorze indukcyjnej wypełnionej 100% tlenem. Należy wyjąć zwierzęta z probówek i przenieść je do szczelnych plastikowych pojemników w celu transportu do komory bezpiecznej biologicznie.

Na koniec umieść zwierzęta w ciepłej klatce, w której nie ma przeciągów, i pozwól im dojść do siebie po znieczuleniu przed obrazowaniem exvivo. Najpierw w pełni znieczul zwierzęta, stosując dożylne wstrzyknięcie kombinacji ketaminy i ksylazyny. Przed rozpoczęciem perfuzji oceń głębokość znieczulenia chirurgicznego za pomocą ucisku palca lub łapy.

Otwórz jamę klatki piersiowej i wprowadź igłę lub bezpieczny zestaw do infuzji z prowadnicą do lewej komory serca. Następnie przetnij prawy przedsionek, aby rozpocząć perfuzję przezsercową. W pierwszej kolejności przepłucz układ 30 ml soli fizjologicznej PBS w temperaturze pokojowej, zmieszanej z 1 µL/ml heparyny i 2 mM pronase, stosując szybkość przepływu wynoszącą około 100 ml/h.

Powinno to zająć około 20 minut. Następnie przeprowadź kolejną utrwalanie, stosując 30 mililitrów 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej, zmieszanego z 2 milimolarnym roztworem probenzołu, przy przepływie 100 mililitrów na godzinę. Teraz zdekapituj zwierzę i usuń skórę, dolną szczękę, uszy oraz chrzęstną część czubka nosa.

Następnie pozostałą strukturę czaszki należy umieścić w 4% paraformaldehydzie wymieszanym z 2 mM probenzoilu i pozostawić przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia preparat należy przenieść do roztworu 1x fosforanu buforu soli (PBS) z dodatkiem 0,02% azotku sodu oraz 2 mM probenzoilu w celu konserwacji. Skanowanie MRI 3D o wysokiej rozdzielczości przy 7 Tesla powinno odbyć się w odstępie co najmniej czterech dni, ale nie później niż po dwóch i pół miesiąca.

Po perfuzji. Umieść mózgi przeznaczone do obrazowania w 16-kanałowej macierzy cewek solenoidowych, a następnie wprowadź ją do skanera. Następnie przeprowadź skanowanie preparatów przy użyciu sekwencji fast spin echo.

Czas trwania tego skanowania wynosi około 12 godzin, a końcowe obrazy będą miały rozdzielczość izotropową 32 micrometers. Po zakończeniu skanowania należy wyjąć preparaty z cewki obrazującej i umieścić każdą czaszkę w 10% roztworze formaliny z 2 millimolar pro hands w celu konserwacji reprezentatywnej in vivo. Przedstawiono tutaj liczne obrazy mózgów myszy z jednego trzymiesięcznego skanowania.

Rysunek ten przedstawia trzy osie widoku dla każdej z siedmiu przeskanowanych myszy. Tutaj zaprezentowano reprezentatywny obraz mózgu ex vivo o izotropowej rozdzielczości 32 mikronów. A tutaj możemy zobaczyć renderowanie 3D wolumenu obrazu ex vivo po przetworzeniu.

Tę technikę in vivo można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Metoda ta może być stosowana przez badaczy w wielu dziedzinach biomedycznych do badania chorób takich jak toczeń, choroba Huntingtona i choroba Alzheimera w modelu mysim. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak obrazować zarówno żywe, jak i utrwalone obiekty, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy mózgu za pomocą MRI.

Dziękujemy za oglądanie.