Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza struktury i funkcji czystych rybosomów zawierających unikalny peptyd tRNA. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie testów translacji in vitro z wykorzystaniem bezkomórkowych ekstraktów pozbawionych czynnika uwalniającego oraz mRNA znakowanych biotyną, w celu wygenerowania zatrzymanych kompleksów rybosom-peptyd tRNA przyłączonych do znakowanych biotyną cząsteczek mRNA. W drugim kroku kule paramagnetyczne związane ze streptawidyną są mieszane z układami testowymi translacji in vitro, aby umożliwić ich oddziaływanie z cząsteczkami biotyny znajdującymi się w mRNA.

Następnie kuleczki wyodrębnia się przy użyciu pól magnetycznych, które usuwają zatrzymane kompleksy peptyd-tRNA-rybosom przyłączone do mRNA z całkowitej mieszaniny reakcyjnej. W dalszej kolejności oczyszczone kompleksy peptyd-tRNA-rybosom można mieszać z czynnikami translacyjnymi, takimi jak czynniki uwalniające (RF), antybiotyki hamujące translację lub chemiczne środki modyfikujące, w celu analizy ich funkcji. Wyniki dotyczące inhibicji i struktury rybosomu wykazują hamowanie hydrolizy peptyd-tRNA oraz jego korelację ze zmianami strukturalnymi w rybosomach na podstawie aktywności peptydylotransferazy lub testów terminacji translacji z wykorzystaniem żeli SDS-PAGE lub Tris-RapiPAGE oraz testów ochrony przed modyfikacją z wykorzystaniem żeli urea-PAGE.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie różnicowe, jest fakt, że wyizolowane próbki zawierają głównie rybosomy z tylko jedną populacją pep tRNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny ekspresji genów, takie jak natura nowo powstających polipeptydów oraz wpływ antybiotyków na funkcję rybosomów, na przykład poprzez modulację procesu translacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać dwa gramy suchego osadu bakterii e coli z kultur w fazie logarytmicznej.

Przemyj osad, resuspendując go w jednym litrze buforu, a następnie odwiruj przy 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu dwóch przemyć, resuspenduj otrzymany osad bakteryjny w 40 mililitrach buforu i rozbij komórki bakteryjne za pomocą prasy Frencha, stosując ciśnienie 6 000 PSI. Ciśnienie to odpowiada 600 jednostkom przy użyciu tłoka o średnicy jednego cala.

Zebrać zawiesinę po rozbiciu do czystej szklanej probówki o pojemności 50 mililitrów. Poddać zawiesinę działaniu 1 milimolowego DIO triolu lub DTT, a następnie odwirować próbkę przy 30 000 G przez 30 minut. Usunąć otrzymany nadsącz i powtórzyć procedurę wirowania.

Należy zachować nadfiltr uzyskany po drugim wirowaniu, a następnie rozdzielić końcowy nadfiltr do mikroprobówek. Na koniec należy szybko zamrozić alikwoty, używając mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, a próbki przechowywać w temperaturze -60 lub -80 stopni Celsjusza.

Rozpocznij przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych pozbawionych RF two, mieszając 4,5 milliliters zawiesiny kulek protein A spheros four B z pięcioma milliliters antyserum anty-RF two. Obracaj mieszaninę na rotatorze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj mieszaninę przy 2 500 Gs, aby oddzielić kulki od antyserum.

Odlać supernatant. Kuleczki zawierają teraz przeciwciała anty-RF dwa i będą selanjutnya określane jako kuleczki anty-RF dwa. Przemyć kuleczki, resuspending je w 1 mL buforu bee.

Następnie odwiruj kuleczki w ten sam sposób co poprzednio, aby oddzielić kuleczki anti RF two od buforu B. Powtórz tę procedurę płukania dwukrotnie. Po wypłukaniu kuleczek zmieszaj 1 ml ekstraktu bezkomórkowego z 150 µL kuleczek anti RF two i inkubuj na rotatorze w temperaturze 4 °C przez dwie godziny. Odwiruj mieszaninę przy 10 000 ×g, aby oddzielić ekstrakt bezkomórkowy od kuleczek.

Usunąć supernatant i ponownie potraktować go kolejnymi 150 µL kulek anty-RF dwa przed ponownym powtórzeniem inkubacji i przeprowadzeniem kolejnego procesu wyprecypowania. Rozdzielić końcowy roztwór ekstraktu bezkomórkowego pozbawionego RF dwa do mikroprobówek w ilości 100 µL na probówkę. Alikwoty zamrozić, używając mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, i przechowywać w temperaturze -60 lub -80 °C.

Przygotuj reakcję PCR, łącząc matrycę plazmidową zawierającą sekwencje do przetłumaczenia, oligonukleotydy, dNTP, nienaruszoną polimerazę DNA oraz bufor do strategii PCR. Po przygotowaniu próbki do PCR przeprowadź reakcję amplifikacji, a następnie wytrącaj DNA w celu oczyszczenia produktów PCR, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5.2 oraz dwie objętości lodowatego etanolu. Po powtórzeniu procedury wytrącania, zawieś otrzymane DNA w 100 µL dietylopirokarbonianu lub wody traktowanej DEPC.

Zweryfikuj integralność produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelach agarozowych. Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać 100 µg produktu DNA o długości 600 par zasad. Przygotuj 100 µL reakcji transkrypcji in vitro w wodzie wolnej od nukleaz, mieszając 5 µg fragmentu DNA wygenerowanego w PCR z rybonukleotydami, znakowanym biotyną UTP oraz mieszaniną enzymu T7.

Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Aby określić ilość otrzymanego mRNA, usunąć matrycę DNA poprzez dodanie DNazy wolnej od RNA. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

Aby oczyścić produkty mRNA, wytrącić RNA dwukrotnie, dodając 1/10 objętości trzy molarnego octanu sodu o pH 5,2 oraz dwie objętości zimnego etanolu, a następnie zawiesić wytrącone mRNA w 100 µl wody traktowanej DEPC. Sprawdzić integralność znakowanych biotyną produktów mRNA za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych. Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać od jednego do dwóch miligramów produktu mRNA o długości 600 nukleotydów znakowanego biotyną. Aby rozpocząć izolację rybosomów translujących zawierających peptyd-tRNA, przygotować 500 µl mieszaniny do translacji in vitro w wodzie traktowanej DEPC.

W pierwszej kolejności należy przygotować buforową mieszaninę reakcyjną opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, a następnie dodać 75 M każdego z aminokwasów z wyjątkiem tego, który zostanie zastąpiony aminokwasem promieniotwórczym. Następnie do roztworu buforowego zawierającego aminokwasy należy dodać od 20 do 50 µL ekstraktu bezkomórkowego z komórek pozbawionych RF2. Mieszaninę inkubuje się przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację rybosomów.

Po aktywacji rybosomów należy dodać do próbki od 10 do 15 µg mRNA znakowanego biotyną. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

W międzyczasie przygotować 3 mL kulek paramagnetycznych z streptawidyną lub SMB w buforze C. Po inkubacji dodać zawiesinę SMP do mieszaniny reakcyjnej translacji. Inkubować nową zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Oddzielić SMB od mieszaniny, przykładając pole magnetyczne za pomocą statywów do separacji magnetycznej. Resusp.

Zawiesić SMB w buforze C i ponownie oddzielić kuleczki za pomocą statywu magnetycznego. Po dwukrotnym powtórzeniu tej procedury płukania, ponownie zawiesić kuleczki w 500 µL buforu C. Przechowywać zawiesinę w lodzie i niezwłocznie przystąpić do kolejnego etapu. Aby zwizualizować peptid TRNA, zmieszać 10 µL zawiesiny SMB w buforze C z 10 µL buforu do ładowania, a następnie rozdzielić komponenty przytwierdzone do kuleczek, przeprowadzając elektroforezę próbek w 10% żelach poliakrylamidowych Tris-Tric.

Osusz żele za pomocą próżniowej suszarki do żeli. Następnie zweryfikuj integralność i czystość peptydu TRNA, wystawiając wysuszony żel na film rentgenowski. W celu analizy rybosomalnego RNA połącz 190 µL 2 mM roztworu EDTA przygotowanego w wodzie traktowanej dpci, 200 µL fenolu nasyconego wodą oraz 10 µL zawiesiny kulek.

Wymieszać otrzymaną zawiesinę za pomocą intensywnego wirowania w vortexie. Oddzielić fazę nieorganiczną od fazy organicznej poprzez wirowanie z prędkością 10 000 Gs przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać górną warstwę wodną do nowej mikroprobówki. RNA z warstwy wodnej wytrącić, dodając 1/10 objętości octanu sodu 3 M o pH 5,2, 1 µL roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/mL oraz dwie objętości lodowatego etanolu. Wytrącone RNA zawiesić ponownie w 10 µL wody traktowanej DEPC.

Zweryfikuj integralność rybosomalnych RNA za pomocą elektroforezy na żelach niros. Zazwyczaj 50 µL zawiesiny uzyskuje jeden µg rybosomalnego RNA. Poniżej przedstawiono wyniki serii analiz oceniających jakość i funkcjonalność wyizolowanych rybosomów translacyjnych.

Obserwacja pojedynczego prążka rozdzielonego w żelach poliakrylamidowych wskazuje na obecność polipeptydów związanych z znakowanymi biotyną mRNA przytwierdzonymi do SMB. Oczyszczanie rybosomalnych RNA przy użyciu tej procedury potwierdza również obecność rybosomów związanych z tymi znakowanymi biotyną mRNA.

Dodanie puromycyny, antybiotyku indukującego aktywność peptydylotransferazy rybosomu, prowadzi do odszczepienia powstających peptydylo-tRNA. Jest to obserwowane jako zmiana wzoru migracji wyizolowanego polipeptydu w żelach poliakryloamidowych. Wspólnie dane te wskazują, że mRNA znakowane biotyną przyłączone do SMB zawierają funkcjonalne rybosomy z peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających specyficzne tRNA-peptydy pozwala na badanie wpływu antybiotyków wiążących tRNA-peptydy oraz innych cząsteczek na funkcję i strukturę rybosomów. W przedstawionych tutaj przykładach antybiotyk parsamyna oraz aminokwas tryptofan hamują hydrolityczne rozszczepienie powstającego tRNA-peptydy TNAC przez RF2 w izolowanych rybosomach.

Oddziaływanie tryptofanu lub sparsomycyny z rybosomem indukuje również zmiany strukturalne w niektórych nukleotydach tworzących 23 S-R-R-N-A rybosomu tłumaczącego. Po opanowaniu metody, główną część tej procedury można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego stosowania się do opisanych czynności. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące struktury rybosomu zawierającego unikalne Pepin, RNA, można zastosować inne metody, takie jak cryo em, do przeprowadzenia dodatkowej analizy strukturalnej.