Name: Izolacja translujących rybosomów zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę izolacji rybosomów zawierających peptydylo-tRNA do analizy struktury i funkcji translacji. Technika wykorzystuje biotynowane mRNA i magnetyczne kule streptawidynowe, umożliwiając badanie wpływu peptydów i antybiotyków na aktywność rybosomalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.R.C.-V. pragnie dedykować niniejszą pracę pamięci dr. Adriel D. Johnsona, wspaniałego profesora, dla którego edukacja studentów była zawsze priorytetem. Brakuje nam Ciebie, Adriel. Jesteśmy wdzięczni Jacqueline Moreno za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów opisanych w niniejszym badaniu. Badanie to zostało sfinansowane z grantu przyznanego C.Y. przez National Science Foundation, MCB-0615390, oraz z funduszy startowych przyznanych L.R.C.-V. przez University of Alabama at Huntsville.

1. Przygotowanie ekstraktu bezkomórkowego.
<ol>
<li>Dwa gramy suchego osadu bakteryjnego Escherichia coli, otrzymanego z kultur w środkowej fazie logarytmicznej, przemywa się dwukrotnie 0,5 l buforu A zawierającego 10 mM octanu Trisu, pH 8.0, 14 mM octanu magnezu, 60 mM octanu potasu i 50 μg/ mL fenylometanosulfonylofluorku (PMSF) poprzez wirowanie przy 5000 X g przez 5 min w 4°C. Po przemyciu osad bakteryjny resuspendsuje się w 40 mL buforu A.</li>
<li>Komórki bakteryjne poddaje się rozpadowi za pomocą prasy francuskiej (French Press), stosując ciśnienie 6000 psi. Ciśnienie to odpowiada 600 jednostkom przy zastosowaniu tłoka o średnicy jednej uncji. Rozbitą zawiesinę zbiera się do czystej probówki szklanej (50 mL).</li>
<li>Rozbitą zawiesinę traktuje się 1 mM ditiotreitolem (DTT) i wiruje przy 30 000 x g przez 30 min. Procedurę wirowania powtarza się, wykorzystując otrzymany nadosad. Końcowy nadosad rozlewa się (1 mL) do mikroprobówek. Na koniec alikwoty zamraża się w mieszaninie suchego lodu z etanolem lub w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych pozbawionych RF2.
<ol>
<li>4,5 mL zawiesiny kulek sepharose 4B z białkiem A miesza się z 5 mL antyserum przeciwko RF2, używając rotatora w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Mieszaninę odwiruje się przy 2500 x g, aby oddzielić kulki od antyserum. Po odlaniu supernatantu, kulki zawierające przeciwciała przeciwko RF2 (kulki anti-RF2) przepłukuje się poprzez resuspensję w 1 mL buforu B zawierającego 35 mM octanu Tris o pH 7,8, 10 mM octanu magnezu, 30 mM octanu amonu, 60 mM glutaminianu potasu oraz 5 μg/mL leupeptyny jako inhibitora proteinazy. Następnie kulki anti-RF2 oddziela się od buforu B poprzez wirowanie w tych samych warunkach, które wskazano powyżej. Procedurę płukania powtarza się dwukrotnie.</li>
<li>Jeden mL ekstraktu wolnego od komórek miesza się ze 150 μL kulek anti-RF2, używając rotatora w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Mieszaninę odwiruje się przy 10 000 x g, aby oddzielić ekstrakt wolny od komórek od kulek. Supernatant usuwa się i poddaje ponownej obróbce z kolejnymi 150 μL kulek anti-RF2. Procedurę tę powtarza się jeszcze raz z otrzymanym roztworem ekstraktu wolnego od komórek. Końcowy roztwór ekstraktu wolnego od komórek rozdziela się (po 100 μL) do mikroprobówek. Alikwoty zamraża się za pomocą mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, a następnie przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie matrycy DNA.
<ol>
<li>Przygotuj 1 mL mieszaniny do reakcji PCR, łącząc 600 femtomoli matrycy plazmidowej zawierającej sekwencje do translacji (Rys. 1), z 0,4 nanomolami każdego z oligodeoksynukleotydów wskazanych na Rys. 1, 0,2 mikromolami każdego dNTP oraz 50 U polimerazy Taq-DNA w buforze dostarczonym przez Stratagene Co. Przeprowadź reakcję amplifikacji zgodnie z następującymi warunkami: 94°C przez 2 min, (94°C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72°C przez 1 min; przez 30 cykli) oraz 72°C przez 12 min.</li>
<li>Oczyść produkty PCR poprzez wytrącenie DNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 5.2, oraz 2 objętości lodowatego etanolu. Powtórz procedurę wytrącania jeszcze raz. Resuspenduj DNA w 100 μL wody traktowanej węglanem diethylopirocarbonianu (DEPC). 
Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać 100 μg produktu DNA o długości 600 bp.</li>
<li>Zweryfikuj integralność produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mRNA znakowanego biotyną.
<ol>
<li>Przygotować 100 μL reakcji transkrypcji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 5 μg fragmentu DNA otrzymanego w drodze PCR z 0,5 mikromola ATP, CTP, GTP, 0,3 mikromola UTP, 50 nanomolami biotyny-16-UTP oraz 10 μL mieszanki enzymów T7 w buforze dostarczonym przez firmę Promega Co. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 3 godziny. 
Aby określić ilość otrzymanego mRNA, matrycę DNA należy usunąć poprzez dodanie DNazy wolnej od RNaz. Inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 10 min.</li>
<li>Oczyścić produkty mRNA, wytrącając RNA poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 2 objętości zimnego etanolu. Powtórzyć procedurę wytrącania jeszcze raz. Resuspendować mRNA w 100 μL wody traktowanej DEPC. 
Zazwyczaj procedura ta pozwala na uzyskanie od 1-2 mg produktu mRNA o długości 600 nt znakowanego biotyną.</li>
<li>Zweryfikować integralność produktów mRNA znakowanych biotyną za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.</li>
</ol>
5. Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA.
<ol>
<li>Przygotować 500 μL mieszaniny do reakcji translacji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 10-15 μg mRNA znakowanego biotyną z 75 nanomolami każdego z dziewiętnastu aminokwasów – wszystkich z wyjątkiem aminokwasu, który zostanie zastąpiony aminokwasem promieniotwórczym, 50 μCi aminokwasu promieniotwórczego (37MBq) oraz 20-50 μL ekstraktu bezkomórkowego pozbawionego RF2, w buforowanej mieszaninie reakcyjnej zawierającej 40 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, 30 mM fosfoenolopirogronianu (PEP), 0.3 U/ mL kinazy pirogronianowej (PK), 3.5% glikolu polietylenowego 8000, 1 mM spermidyny, 20 μg/ mL kwasu folinowego oraz 250 μg/ mL tRNA z E. coli. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 10 minut. 
Kolejność dodawania składników reakcji jest bardzo ważna. Ekstrakt bezkomórkowy należy najpierw wymieszać z roztworem buforowym zawierającym aminokwasy, a końcową mieszaninę inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację rybosomów. Następnie dodaje się mRNA znakowane biotyną. W przypadku analiz strukturalnych z wykorzystaniem procedur modyfikacji chemicznej dodanie aminokwasu promieniotwórczego nie jest wymagane.</li>
<li>Do mieszaniny reakcji translacji dodać 3 μL paramagnetycznych kulek streptawidyny (SMB) zawieszonych w buforze C zawierającym 35 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu i 1 mM DTT. Inkubować nową zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Oddzielić SMB od mieszaniny, przykładając pole magnetyczne (MF) za pomocą statywów do separacji magnetycznej.</li>
<li>Resuspendować SMB w buforze C i ponownie oddzielić kulki za pomocą MF. Powtórzyć tę procedurę płukania dwukrotnie. Resuspendować kulki w 500 μL buforu C, przechowywać zawiesinę na lodzie i niezwłocznie przystąpić do kolejnego etapu procedury.</li>
</ol>
6. Analiza wyizolowanych rybosomów zawierających peptydylo-tRNA.

Dla peptydylo-tRNA
<ol>
<li>Wymieszać 10 μL SMB (zawieszonego w buforze C) z 10 μL buforu do ładowania zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2,5% (v/v) glicerolu, 4% dodecylosiarczanu sodu, 2 mM DTT oraz 0,2 mg/mL błękitu bromofenolowego. Rozdzielić komponenty przyłączone do kulek, przeprowadzając elektroforezę próbek w 10% żelach poliakrylamidowych Tris-tricine.</li>
<li>Wysuszyć żele za pomocą próżniowej suszarki do żeli.</li>
<li>Zweryfikować integralność i czystość peptydylo-tRNA poprzez naświetlanie wysuszonego żelu na filmie rentgenowskim.</li>
</ol>
Dla rybosomalnego RNA
<ol start="4">
<li>Do 10 μL zawiesiny kulek dodać 190 μL 2 mM roztworu etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) przygotowanego w wodzie traktowanej DEPC oraz 200 μL fenolu nasyconego wodą. Zawiesinę wymieszać poprzez intensywne wstrząsanie w wortexie, a następnie oddzielić fazę nieorganiczną od organicznej poprzez wirowanie przy 10,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Górną warstwę wodną zebrać do nowej mikroprobówki.</li>
<li>RNA z warstwy wodnej wytrącić poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5.2), 1 μL roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ mL oraz 2 objętości lodowatego etanolu. RNA zawiesić ponownie w 10 μL wody traktowanej DEPC.</li>
<li>Integralność rybosomalnych RNA zweryfikować za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych. 
Zazwyczaj 50 μL zawiesiny kulek pozwala uzyskać 1μg rybosomalnego RNA.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 2 przedstawia wyniki serii analiz oceniających jakość i funkcjonalność rybosomów translacyjnych wyizolowanych zgodnie z opisaną procedurą. Obserwacja pojedynczego prążka w żelach poliakrylamidowych wskazuje na obecność polipeptydów związanych z mRNA znakowanymi biotyną, przytwierdzonymi do SMB (Rycina 2A). Oczyszczanie rybosomalnych RNA za pomocą tej procedury potwierdza również obecność rybosomów związanych z tymi znakowanymi biotyną cząsteczkami mRNA (Rycina 2B). Dodanie puromycyny, antybiotyku indukującego aktywność peptydylo-transferazy rybosomu, prowadzi do odszczepienia powstających peptydylo-tRNA1. Objawia się to zmianą wzorca migracji wyizolowanego polipeptydu w żelach poliakrylamidowych (Ryc. 2C). Wspólnie dane te wskazują, że mRNA znakowane biotyną, przytwierdzone do SMB, zawierają funkcjonalne rybosomy z peptydylo-tRNA.
Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających specyficzne peptydylo-tRNA pozwala na badanie wpływu peptydylo-tRNA, antybiotyków i innych cząsteczek na funkcję rybosomów (Rysunek 3A) oraz na ich strukturę (Rysunek 3B). W przedstawionych tutaj przykładach antybiotyk sparsomycyna oraz aminokwas tryptofan (Trp) hamują hydrolityczne rozszczepienie peptydylo-tRNA nowo powstającego tnaC-tRNA indukowane przez RF2 w izolowanych rybosomach (Rysunek 3A). Oddziaływanie sparsomycyny lub Trp z rybosomem indukuje również zmiany strukturalne w niektórych nukleotydach wchodzących w skład 23S rRNA rybosomu translacyjnego (Rys. 3B). Podsumowując, materiał biologiczny otrzymany za pomocą opisanego tutaj procesu jest przydatny do pogłębienia wiedzy na temat kontaktów strukturalnych zaangażowanych w hamowanie funkcji rybosomu w wyniku jego oddziaływania z różnymi czynnikami molekularnymi.

 <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Schemat syntezy i translacji mRNA znakowanego biotyną, przedstawiający transkrypcję run-off oraz zatrzymanie rybosomu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Procedura stosowana do otrzymywania i oczyszczania translujących rybosomów zawierających peptydylo-tRNA. Fragmenty DNA o długości ok. 650 bp, zawierające gen tnaC oraz przyległy obszar, przedstawione na rysunku, służą jako matryce do przygotowania mRNA zawierających biotynę, [(bio)UMP]mRNA. Fragmenty DNA te są otrzymywane metodą PCR przy użyciu oligodeoksynukleotydów wskazanych w górnej części rysunku. Podkreślone litery oznaczają miejsce promotora T7 zakodowanego w primerze nukleotydowym. Pogrubione litery wskazują sekwencję Shine-Dalgarno wykorzystywaną w translacji sekwencji mRNA tnaC. Promotor T7 w fragmencie DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która służy do transkrypcji (strzałka) sekwencji tnaC oraz następującej po niej sekwencji niekodującej. Transkrypcja zostaje zakończona, gdy polimeraza RNA dotrze do końca 3' fragmentu DNA, za sekwencjami terminatora rpoBC (rpoBC"t"). Struktura spinki (stem-loop) terminatora rpoBC chroni mRNA przed aktywnością egzoribonukleazy 3'-5' obecną w ekstraktach bezkomórkowych stosowanych w reakcjach translacji in vitro. Wyizolowane [(bio)UMP]mRNA są wykorzystywane do generowania zatrzymanych, translujących rybosomów w testach translacji in vitro. Sekwencja tnaC w [(bio)UMP]mRNA jest translowana przez rybosom, który zatrzymuje się po wbudowaniu ostatniego aminokwasu ze względu na brak czynnika uwalniającego (RF2) w mieszaninie reakcyjnej. Kompleksy rybosom-[(bio)UMP]mRNA są izolowane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu magnetycznych kulek ze streptawidyną (SMB), które wiążą nukleotydy znakowane biotyną wbudowane w mRNA. SMB związane z kompleksami rybosom-[(bio)UMP]mRNA są ekstrahowane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu pola magnetycznego (MF).

 <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Wyniki elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, translacja i oczyszczanie kuleczkami TnaC-tRNA, analiza RNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analizy strukturalne i funkcjonalne wyizolowanych kompleksów. A) Reakcje translacji in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem [(bio)UMP]mRNA, w których kodon startowy genu tnaC zastąpiono kodonem stop. Produkty końcowe wyizolowano przy użyciu kuleczek z streptawidyną, zgodnie z opisem na Ryc. 1. Produkty reakcji i wyizolowane cząsteczki poddano następnie analizie za pomocą elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. Oznaczono prążki tnaC-tRNA oraz peptydy tnaC. B) Całcowy RNA wyizolowano z zatrzymanych kompleksów, stosując procedury ekstrakcji fenolem. Każdy wyizolowany RNA rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelach agarozowych. Wskazano rybosomalne RNA (rRNA). C) Wyizolowane kompleksy zawierające tnaC-tRNA inkubowano z (+) lub bez (-) 0,02 mM puromycyną (Puro) w temperaturze pokojowej przez 10 min. Peptydy tnaC znakowano podczas translacji za pomocą [35S]-metioniny (A) lub [3H]-proliny (B).

 <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Wyniki eksperymentu syntezy białek; elektroforeza żelowa translacji rybosomów w obecności TnaC-tRNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analizy strukturalne i funkcjonalne rybosomów zawierających tnaC-tRNA, które są związane z antybiotykiem sparsomycyną lub aminokwasem tryptofanem. A) Izolowane kompleksy zawierające tnaC-tRNA inkubowano z (+) lub bez (-) sparsomycyny (Spar) lub tryptofanu (Trp) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie mieszaniny zmieszano z RF2 i inkubowano w 37°C przez 20 min. B) Analiza zmian metylacji w 23S rRNA indukowanych przez cząsteczki wiążące się wewnątrz rybosomu. Izolowane kompleksy wstępnie inkubowano z (+) lub bez (-) 2 mM Trp lub Spar przez 5 min w 37°C. Następnie dodano czynnik alkilujący, siarczan dimetylu, a mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 20 min. Wyekstrahowano całkowite RNA i przeprowadzono analizy przedłużania starterów z użyciem oligodeoksynukleotydu znakowanego [32P], komplementarnego do nukleotydów 23S rRNA oddalonych o 100 nukleotydów w dół strumienia od zmodyfikowanego nukleotydu. Końcowe produkty analiz przedłużania rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych. Wskazano nukleotydy 23S rRNA, na które wpłynęła obecność Trp lub Spar.

<ol><li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC%2C+a+nascent+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li>
<li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome%3A+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li>
<li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrolide+antibiotics%3A+binding+site%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li>
<li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+peptidyl+transferase+center%3A+structure%2C+function%2C+evolution%2C+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li>
<li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit%2C+a+major+antibiotic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li>
<li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li>
<li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li>
<li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2%2Fneu+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li>
<li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li>
<li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li>
<li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation%2C+activating+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction%3A+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+%27-end+of+single-stranded+DNA%2FRNA+using+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li>
<li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-ligation%3A+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Divers%22%5BJournal%5D)">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Procedura izolacji opisana w niniejszym raporcie jest wysoce powtarzalna. Niestety, nie można łatwo uniknąć obecności krótkich peptydylo-tRNA powstających z tych samych sekwencji translacyjnych; takie peptydylo-tRNA mogą stanowić 15-20 % całkowitej izolatowej substancji (Rycina 2C). Stężenie tych zanieczyszczeń może wzrosnąć w przypadku zastosowania wyższych stężeń mRNA znakowanego biotyną lub gdy użyte ekstrakty bezkomórkowe są stare bądź były wielokrotnie wykorzystywane. Dlatego bardzo ważne jest kontrolowanie jakości i stężenia składników reakcji translacji in vitro. Alternatywnie dostępne są komercyjne, wysokowydajne zrekonstytuowane ekstrakty bezkomórkowe, które mogą być stosowane w tych samych celach (system PURE)18.
Stosując tę metodę, biotin-16-UMP jest wbudowywany losowo wzdłuż całej długości docelowego mRNA. Istnieje możliwość, że niektóre ORF zawierające ciągi urydyny mogły włączyć ten zmodyfikowany nukleotyd do swoich sekwencji, co wpływa na ich translację. W celu uzyskania najefektywniejszej translacji należy przetestować zmienne względne stężenia biotin-16-UTP/UTP podczas syntezy mRNA. Można zastosować alternatywne metody znakowania biotyną, celujące w koniec 5', który jest najstabilniejszym końcem cząsteczek mRNA. (i) Biotynę można przyłączyć do końca 5' mRNA, wykorzystując 3'-NH2ATP (3'-amino-3'-deoksyadenozynotrifosforan) oraz ligazę RNA T419. (ii) Do końca 5' mRNA można również przyłączyć oligonukleotyd znakowany biotyną na końcu 5', wykorzystując ligazę RNA T420. (iii) Do izolacji kompleksów translacyjnych można by również użyć oligodeoksynukleotydów znakowanych biotyną na końcu 3', które odpowiadają sekwencji komplementarnej do końca 5' mRNA. Te znakowane biotyną oligodeoksynukleotydy mogłyby zostać przyłączone do SMB przed izolacją. Następnie SMB przyłączone do znakowanych biotyną oligodeoksynukleotydów mogłyby zostać zmieszane z mieszaniną reakcyjną translacji, aby umożliwić interakcję z ich komplementarnymi sekwencjami mRNA. Po izolacji hybrydowy region RNA-DNA – a konkretnie region hybrydyzujący między znakowanym biotyną oligodeoksynukleotydem a sekwencją mRNA – mógłby zostać zdegradowany za pomocą RNazy H, oddzielając zatrzymane kompleksy od kulek streptavidyny. Ta alternatywna metoda może pozwolić na wykorzystanie kompleksów w przyszłych analizach strukturalnych z zastosowaniem metod o wyższej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki zawiesiny sepharose 4B z białkiem A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor leupeptyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Taq-polimeraza DNA</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw T7 Maxiprep</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenoglikol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>tRNA z &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>L-aminokwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>statywy do separacji magnetycznej</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-trna do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Niedawne badania strukturalne i biochemiczne szczegółowo opisały wiele zdarzeń molekularnych zachodzących w rybosomie podczas hamowania syntezy białek przez antybiotyki oraz podczas syntezy powstających polipeptydów. Niektóre z tych antybiotyków oraz regulacyjne polipeptydy, występujące głównie w formie peptydylo-tRNA, hamują albo tworzenie wiązania peptydowego, albo terminację translacji1-7. Zdarzenia hamujące te mogą zatrzymać ruch rybosomu, co jest zjawiskiem określanym jako „zatrzymanie translacyjne” (translational arrest). Wykazano, że zatrzymanie translacji indukowane przez antybiotyk lub powstający polipeptyd reguluje ekspresję genów zaangażowanych w różnorodne funkcje komórkowe, takie jak wzrost komórki, oporność na antybiotyki, translokacja białek oraz metabolizm komórkowy8-13. Wiedza o tym, w jaki sposób antybiotyki i regulacyjne polipeptydy zmieniają funkcję rybosomu, jest niezbędna do pełnego zrozumienia roli rybosomu w translacji w każdym organizmie.
W niniejszej pracy opisujemy prostą metodologię, którą można wykorzystać do oczyszczania, wyłącznie w celach analitycznych, tych rybosomów, które translują konkretny mRNA i zawierają specyficzny peptydylo-tRNA14. Procedura ta opiera się na selektywnej izolacji translujących rybosomów związanych z mRNA znakowanym biotyną. Kompleksy translacyjne te są oddzielane od innych rybosomów w tej samej mieszaninie przy użyciu paramagnetycznych kulek streptawidyny (SMB) i pola magnetycznego (MF). mRNA znakowane biotyną są syntetyzowane w testach transkrypcji run-off z wykorzystaniem jako matryc fragmentów DNA generowanych metodą PCR, które zawierają promotory transkrypcyjne T7. Polimeraza RNA T7 włącza biotynę-16-UMP z biotyny-UTP; w naszych warunkach w cząsteczce mRNA o długości 600 nt z 25% zawartością UMP wbudowuje się około dziesięciu cząsteczek biotyny-16-UMP. Tak oznakowane biotyną cząsteczki mRNA są następnie izolowane i wykorzystywane w testach translacji in vitro przeprowadzanych z użyciem bezkomórkowych ekstraktów pozbawionych czynnika uwalniającego 2 (RF2), uzyskanych ze szczepów Escherichia coli zawierających rybosomy typu dzikiego lub zmutowane. Rybosomy translujące sekwencje mRNA znakowane biotyną zostają zatrzymane w obrębie kodonu stop z powodu braku białka RF2, które zazwyczaj odpowiada za terminację translacji. Zatrzymane rybosomy zawierające nowo zsyntetyzowany peptydylo-tRNA są izolowane i usuwane z reakcji translacji za pomocą SMB i MF. Kuleczki te wiążą wyłącznie cząsteczki mRNA zawierające biotynę.
Wyizolowane kompleksy translacyjne mogą być wykorzystywane do analizy cech strukturalnych i funkcjonalnych komponentów rybosomalnych typu dzikiego lub zmutowanych, bądź sekwencji peptydylo-tRNA, a także do określania interakcji rybosomów z antybiotykami lub innymi czynnikami molekularnymi 1,14-16. Aby zbadać funkcję tych wyizolowanych kompleksów rybosomalnych, można przeprowadzić testy peptydylo-transferazy w obecności antybiotyku puromycyny1. Do badania zmian strukturalnych w kompleksach translacyjnych można zastosować uznane procedury, takie jak i) sieciowanie do specyficznych aminokwasów14 oraz/lub ii) testy ochrony przed alkilacją1,14,17.

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

W ostatnim czasie badania strukturalne i biochemiczne szczegółowo opisały wiele zdarzeń molekularnych zachodzących w rybosomie podczas hamowania syntezy białek...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza struktury i funkcji czystych rybosomów zawierających unikalny peptyd tRNA. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie testów translacji in vitro z wykorzystaniem bezkomórkowych ekstraktów pozbawionych czynnika uwalniającego oraz mRNA znakowanych biotyną, w celu wygenerowania zatrzymanych kompleksów rybosom-peptyd tRNA przyłączonych do znakowanych biotyną cząsteczek mRNA. W drugim kroku kule paramagnetyczne związane ze streptawidyną są mieszane z układami testowymi translacji in vitro, aby umożliwić ich oddziaływanie z cząsteczkami biotyny znajdującymi się w mRNA.Następnie kuleczki wyodrębnia się przy użyciu pól magnetycznych, które usuwają zatrzymane kompleksy peptyd-tRNA-rybosom przyłączone do mRNA z całkowitej mieszaniny reakcyjnej. W dalszej kolejności oczyszczone kompleksy peptyd-tRNA-rybosom można mieszać z czynnikami translacyjnymi, takimi jak czynniki uwalniające (RF), antybiotyki hamujące translację lub chemiczne środki modyfikujące, w celu analizy ich funkcji. Wyniki dotyczące inhibicji i struktury rybosomu wykazują hamowanie hydrolizy peptyd-tRNA oraz jego korelację ze zmianami strukturalnymi w rybosomach na podstawie aktywności peptydylotransferazy lub testów terminacji translacji z wykorzystaniem żeli SDS-PAGE lub Tris-RapiPAGE oraz testów ochrony przed modyfikacją z wykorzystaniem żeli urea-PAGE.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie różnicowe, jest fakt, że wyizolowane próbki zawierają głównie rybosomy z tylko jedną populacją pep tRNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny ekspresji genów, takie jak natura nowo powstających polipeptydów oraz wpływ antybiotyków na funkcję rybosomów, na przykład poprzez modulację procesu translacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać dwa gramy suchego osadu bakterii e coli z kultur w fazie logarytmicznej.Przemyj osad, resuspendując go w jednym litrze buforu, a następnie odwiruj przy 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu dwóch przemyć, resuspenduj otrzymany osad bakteryjny w 40 mililitrach buforu i rozbij komórki bakteryjne za pomocą prasy Frencha, stosując ciśnienie 6 000 PSI. Ciśnienie to odpowiada 600 jednostkom przy użyciu tłoka o średnicy jednego cala.Zebrać zawiesinę po rozbiciu do czystej szklanej probówki o pojemności 50 mililitrów. Poddać zawiesinę działaniu 1 milimolowego DIO triolu lub DTT, a następnie odwirować próbkę przy 30 000 G przez 30 minut. Usunąć otrzymany nadsącz i powtórzyć procedurę wirowania.Należy zachować nadfiltr uzyskany po drugim wirowaniu, a następnie rozdzielić końcowy nadfiltr do mikroprobówek. Na koniec należy szybko zamrozić alikwoty, używając mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, a próbki przechowywać w temperaturze -60 lub -80 stopni Celsjusza.Rozpocznij przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych pozbawionych RF two, mieszając 4,5 milliliters zawiesiny kulek protein A spheros four B z pięcioma milliliters antyserum anty-RF two. Obracaj mieszaninę na rotatorze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj mieszaninę przy 2 500 Gs, aby oddzielić kulki od antyserum.Odlać supernatant. Kuleczki zawierają teraz przeciwciała anty-RF dwa i będą selanjutnya określane jako kuleczki anty-RF dwa. Przemyć kuleczki, resuspending je w 1 mL buforu bee.Następnie odwiruj kuleczki w ten sam sposób co poprzednio, aby oddzielić kuleczki anti RF two od buforu B. Powtórz tę procedurę płukania dwukrotnie. Po wypłukaniu kuleczek zmieszaj 1 ml ekstraktu bezkomórkowego z 150 µL kuleczek anti RF two i inkubuj na rotatorze w temperaturze 4 °C przez dwie godziny. Odwiruj mieszaninę przy 10 000 ×g, aby oddzielić ekstrakt bezkomórkowy od kuleczek.Usunąć supernatant i ponownie potraktować go kolejnymi 150 µL kulek anty-RF dwa przed ponownym powtórzeniem inkubacji i przeprowadzeniem kolejnego procesu wyprecypowania. Rozdzielić końcowy roztwór ekstraktu bezkomórkowego pozbawionego RF dwa do mikroprobówek w ilości 100 µL na probówkę. Alikwoty zamrozić, używając mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, i przechowywać w temperaturze -60 lub -80 °C.Przygotuj reakcję PCR, łącząc matrycę plazmidową zawierającą sekwencje do przetłumaczenia, oligonukleotydy, dNTP, nienaruszoną polimerazę DNA oraz bufor do strategii PCR. Po przygotowaniu próbki do PCR przeprowadź reakcję amplifikacji, a następnie wytrącaj DNA w celu oczyszczenia produktów PCR, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5.2 oraz dwie objętości lodowatego etanolu. Po powtórzeniu procedury wytrącania, zawieś otrzymane DNA w 100 µL dietylopirokarbonianu lub wody traktowanej DEPC.Zweryfikuj integralność produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelach agarozowych. Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać 100 µg produktu DNA o długości 600 par zasad. Przygotuj 100 µL reakcji transkrypcji in vitro w wodzie wolnej od nukleaz, mieszając 5 µg fragmentu DNA wygenerowanego w PCR z rybonukleotydami, znakowanym biotyną UTP oraz mieszaniną enzymu T7.Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Aby określić ilość otrzymanego mRNA, usunąć matrycę DNA poprzez dodanie DNazy wolnej od RNA. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 10 minut.Aby oczyścić produkty mRNA, wytrącić RNA dwukrotnie, dodając 1/10 objętości trzy molarnego octanu sodu o pH 5,2 oraz dwie objętości zimnego etanolu, a następnie zawiesić wytrącone mRNA w 100 µl wody traktowanej DEPC. Sprawdzić integralność znakowanych biotyną produktów mRNA za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych. Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać od jednego do dwóch miligramów produktu mRNA o długości 600 nukleotydów znakowanego biotyną. Aby rozpocząć izolację rybosomów translujących zawierających peptyd-tRNA, przygotować 500 µl mieszaniny do translacji in vitro w wodzie traktowanej DEPC.W pierwszej kolejności należy przygotować buforową mieszaninę reakcyjną opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, a następnie dodać 75 M każdego z aminokwasów z wyjątkiem tego, który zostanie zastąpiony aminokwasem promieniotwórczym. Następnie do roztworu buforowego zawierającego aminokwasy należy dodać od 20 do 50 µL ekstraktu bezkomórkowego z komórek pozbawionych RF2. Mieszaninę inkubuje się przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację rybosomów.Po aktywacji rybosomów należy dodać do próbki od 10 do 15 µg mRNA znakowanego biotyną. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.W międzyczasie przygotować 3 mL kulek paramagnetycznych z streptawidyną lub SMB w buforze C. Po inkubacji dodać zawiesinę SMP do mieszaniny reakcyjnej translacji. Inkubować nową zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Oddzielić SMB od mieszaniny, przykładając pole magnetyczne za pomocą statywów do separacji magnetycznej. Resusp.Zawiesić SMB w buforze C i ponownie oddzielić kuleczki za pomocą statywu magnetycznego. Po dwukrotnym powtórzeniu tej procedury płukania, ponownie zawiesić kuleczki w 500 µL buforu C. Przechowywać zawiesinę w lodzie i niezwłocznie przystąpić do kolejnego etapu. Aby zwizualizować peptid TRNA, zmieszać 10 µL zawiesiny SMB w buforze C z 10 µL buforu do ładowania, a następnie rozdzielić komponenty przytwierdzone do kuleczek, przeprowadzając elektroforezę próbek w 10% żelach poliakrylamidowych Tris-Tric.Osusz żele za pomocą próżniowej suszarki do żeli. Następnie zweryfikuj integralność i czystość peptydu TRNA, wystawiając wysuszony żel na film rentgenowski. W celu analizy rybosomalnego RNA połącz 190 µL 2 mM roztworu EDTA przygotowanego w wodzie traktowanej dpci, 200 µL fenolu nasyconego wodą oraz 10 µL zawiesiny kulek.Wymieszać otrzymaną zawiesinę za pomocą intensywnego wirowania w vortexie. Oddzielić fazę nieorganiczną od fazy organicznej poprzez wirowanie z prędkością 10 000 Gs przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać górną warstwę wodną do nowej mikroprobówki. RNA z warstwy wodnej wytrącić, dodając 1/10 objętości octanu sodu 3 M o pH 5,2, 1 µL roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/mL oraz dwie objętości lodowatego etanolu. Wytrącone RNA zawiesić ponownie w 10 µL wody traktowanej DEPC.Zweryfikuj integralność rybosomalnych RNA za pomocą elektroforezy na żelach niros. Zazwyczaj 50 µL zawiesiny uzyskuje jeden µg rybosomalnego RNA. Poniżej przedstawiono wyniki serii analiz oceniających jakość i funkcjonalność wyizolowanych rybosomów translacyjnych.Obserwacja pojedynczego prążka rozdzielonego w żelach poliakrylamidowych wskazuje na obecność polipeptydów związanych z znakowanymi biotyną mRNA przytwierdzonymi do SMB. Oczyszczanie rybosomalnych RNA przy użyciu tej procedury potwierdza również obecność rybosomów związanych z tymi znakowanymi biotyną mRNA.Dodanie puromycyny, antybiotyku indukującego aktywność peptydylotransferazy rybosomu, prowadzi do odszczepienia powstających peptydylo-tRNA. Jest to obserwowane jako zmiana wzoru migracji wyizolowanego polipeptydu w żelach poliakryloamidowych. Wspólnie dane te wskazują, że mRNA znakowane biotyną przyłączone do SMB zawierają funkcjonalne rybosomy z peptydylo-tRNA.Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających specyficzne tRNA-peptydy pozwala na badanie wpływu antybiotyków wiążących tRNA-peptydy oraz innych cząsteczek na funkcję i strukturę rybosomów. W przedstawionych tutaj przykładach antybiotyk parsamyna oraz aminokwas tryptofan hamują hydrolityczne rozszczepienie powstającego tRNA-peptydy TNAC przez RF2 w izolowanych rybosomach.Oddziaływanie tryptofanu lub sparsomycyny z rybosomem indukuje również zmiany strukturalne w niektórych nukleotydach tworzących 23 S-R-R-N-A rybosomu tłumaczącego. Po opanowaniu metody, główną część tej procedury można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego stosowania się do opisanych czynności. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące struktury rybosomu zawierającego unikalne Pepin, RNA, można zastosować inne metody, takie jak cryo em, do przeprowadzenia dodatkowej analizy strukturalnej.

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja translacjonujących rybosomów zawierających peptydylo-tRNA na potrzeby analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę izolacji rybosomów zawierających peptydylo-tRNA do analizy struktury i funkcji translacji. Technika wykorzystuje biotynowane mRNA i magnetyczne kule streptawidynowe, umożliwiając badanie wpływu peptydów i antybiotyków na aktywność rybosomalną.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Przeglądaj więcej filmów