Name: Zastosowanie systemu wiszącego ciężarka do niedrożności tętnic wieńcowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę niedrożności tętnic wieńcowych u myszy za pomocą systemu wiszącego ciężarka. Technika umożliwia badanie mechanizmów kardioprotekcyjnych i rozmiaru zawału mięśnia sercowego in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsze badania są wspierane przez granty National Heart, Lung, and Blood Institute R01-HL0921, R01-DK083385 oraz R01-HL098294 przyznane H. K. Eltzschig, grant 1K08HL102267-01 przyznany T. Eckle, granty Foundation for Anesthesia Education and Research przyznane T. Eckle i H. K. Eltzschig, grant American Heart Association przyznany T. Eckle i H. K. Eltzschig oraz stypendium badawcze Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) przyznane M. Koeppen. Dziękujemy Shelley Eltzschig za przygotowanie ilustracji.

Uwagi ogólne:
Wszystkie czynności należy przeprowadzać pod pionowym mikroskopem stereoskopowym (Olympus, SZX10 z kolumną Z-Axis Crank Post oraz statywem STU2 StandBoom Stand), używając koagulatora chirurgicznego. Wentylacja ma kluczowe znaczenie dla procedury, dlatego należy poświęcić odpowiednią ilość czasu na wybór respiratora i optymalizację techniki wentylacji. Temperatura, ciśnienie krwi oraz znieczulenie powinny pozostać stabilne przez cały czas trwania zabiegu.
1. Znieczulenie, intubacja i monitorowanie
<ol>
	<li>Należy użyć myszy C57BL/6 w wieku co najmniej 10 tygodni. Znieczulenie należy wprowadzić za pomocą pentobarbitalu sodu w dawce 70 mg/kg masy ciała i.p. Znieczulenie należy podtrzymywać, podając około 10 mg/kg/h pentobarbitalu sodu. Należy zachować ostrożność, aby nie przekroczyć dawki, ponieważ może to znacząco obniżyć ciśnienie krwi. Ponowne podanie pentobarbitalu – nawet po kilku godzinach – może prowadzić do gwałtownego wzrostu stężenia w osoczu. W oparciu o silne dowody wskazujące na działanie kardioprotekcyjne izofluranu, zalecamy stosowanie „obojętnego” i dobrze sprawdzonego pentobarbitalu w modelu niedokrwienia mięśnia sercowego46-56.</li>
	<li>Myszy należy umieścić na stole grzewczym z kontrolą temperatury (RT, Effenberg, Monachium, Niemcy) z sondą termometru rektalnego podłączoną do kontrolera sprzężenia zwrotnego, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37°C.</li>
	<li>Po wprowadzeniu znieczulenia myszy należy unieruchomić w pozycji na plecach, przytwierdzając kończyny górne i dolne do stołu za pomocą taśmy oraz szwu zamocowanego na kostkach. To samo należy zrobić z głową, wykorzystując zęby. Odpowiednia stabilizacja jest kluczowa dla pomyślnej intubacji i precyzyjnej kontroli przebiegu operacji. Przed rozpoczęciem zabiegu mysz należy pokryć olejem mineralnym, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia alergii na sierść myszy.</li>
	<li>Należy chirurgicznie odsłonić tchawicę i przeprowadzić intubację tchawiczą przy użyciu tępych kaniul polietylenowych (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Igłę należy stępić, aby móc jej użyć jako kaniuli prowadzącej.</li>
	<li>Za pomocą pęsety należy wysunąć język, a następnie delikatnie pchnąć go pod kątem 15 stopni w stronę ciała. Nawet po odsłonięciu tchawicy i przy użyciu mikroskopu czynność ta może wymagać pewnej wprawy. Należy pamiętać, że niewielkie uszkodzenie tchawicy może uniemożliwić wentylację zwierzęcia podczas szycia. W przypadku wystąpienia problemów z drogami oddowymi należy sprawdzić, czy w tchawicy nie ma małych otworów.</li>
	<li>Prawidłowe umieszczenie rurki należy potwierdzić poprzez bezpośrednią wizualizację kaniuli w uprzednio odsłoniętej tchawicy powyżej karyny.</li>
	<li>Rurkę należy podłączyć do respiratora. Zalecamy technikę wentylacji sterowanej ciśnieniowo przy użyciu urządzenia Servo 900 C firmy Siemens (DRE Veterinary, USA). Zwierzęta będą wentylowane z maksymalnym ciśnieniem wdechowym 10 mbar, częstotliwością 110 oddechów/min oraz dodatnim ciśnieniem końcowowydechowym 3-5 mbar przy FiO2 = 0,4. Ustawienia mogą wymagać korekty, którą najłatwiej przeprowadzić, obserwując płuca podczas operacji w otwartej klatce piersiowej. Należy upewnić się, że płuca nie są zapadnięte ani nadmiernie rozciągnięte. Pomimo faktu, że Servo 900 C został zaprojektowany jako respirator dla ludzi, jego zastosowanie w trybie sterowania ciśnieniowego sprawdza się doskonale w wentylacji myszy.</li>
	<li>Po 4 do 6 godzinach wentylacji należy przeprowadzić analizę gazometrii krwi za pomocą systemu i-STAT (Abbott, USA), aby potwierdzić prawidłową wymianę gazową (cząstkowe ciśnienie tlenu, paO2 , wynoszące 115±15 mmHg i cząstkowe ciśnienie dwutlenku węgla, paCO2, wynoszące 38 ±6 mmHg).</li>
	<li>Tętno należy monitorować za pomocą EKG (np. Hewlett Packard, Böblingen, Niemcy). Należy dopilnować, aby tętno nie spadło poniżej 450. Jeśli u myszy rozwinie się bradykardia, należy sprawdzić temperaturę oraz dawkę/stężenie środka znieczulającego. Znieczulenie ksylazyną/ketaminą indukuje tętno rzędu 250/min i dlatego nie jest zalecane.</li>
	<li>Należy zastosować odpowiednią płynoterapię. Przed wystąpieniem niedokrwienia należy przeprowadzić infuzję z soli fizjologicznej w tempie 0,1 ml/godzinę poprzez cewnik tętniczy lub żylny. Przed operacją można również podać dawkę bolusa 500 μl soli fizjologicznej i.p. Torakotomia może wywołać spadek ciśnienia krwi i wymagać dodatkowych bolusów soli fizjologicznej. Po niedokrwieniu może być konieczne zwiększenie tempa infuzji do 1 ml/godzinę, aby utrzymać średnie ciśnienie tętnicze powyżej 60 mmHg i zagwarantować wystarczającą reperfuzję, która jest krytyczna dla barwienia zawału metodą TTC.</li>
	<li>W tętnicy szyjnej należy umieścić cewnik (PE10, Tip O.D. (mm/"), Tapered&gt;.024 mm/.011") do ciągłego pomiaru ciśnienia krwi. Tętnicę szyjną odsłania się poprzez tępe rozdzielenie mięśni przytchawiczych. Po dalszym odsłonięciu i przy uważnym unikaniu jakichkolwiek urazów tkanek (szczególnie nerwu błędnego), cewnik wprowadza się do naczynia przy użyciu dwóch szwów i małego zacisku. Przed rozpoczęciem preparowania tętnicy należy przytwierdzić łapę do ciała, co pozwoli odsłonić dłuższy odcinek naczynia. Należy zawiązać koniec proksymalnej części tętnicy szyjnej. Na końcu szwu należy zamocować większy zacisk, aby uzyskać napięcie. Wokół tętnicy należy założyć drugi szew i preparować tętnicę aż do jej najbardziej dystalnego końca, gdzie należy założyć mały zacisk. Za pomocą mikronozycyc należy wykonać małe skośne nacięcie w tętnicy. Otwór należy przytrzymać cienką pęsetą (Dumont, WPI) i wprowadzić cewnik o odpowiedniej średnicy ręcznie lub za pomocą pęsety. Należy zawiązać drugi szew i zabezpieczyć tętnicę. Następnie należy poluzować zacisk i przesunąć cewnik dalej. Cewnik należy zabezpieczyć kilkoma węzłami i taśmą.</li>
</ol>
2. Technika zamknięcia tętnicy wieńcowej
<ol>
	<li>Przeprowadź rozcięcie skóry i odsłoń lewą ścianę klatki piersiowej, stosując technikę rozwarstwiania tępego.</li>
	<li>Przetnij mięśnie piersiowe większy i mniejszy za pomocą kauteryzatora, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej. Poprzez odciągnięcie mięśnia piersiowego większego płuco opada, co umożliwia wprowadzenie pęsety z jednostki elektrochirurgicznej i koagulację poziomej linii przecinającej żebra w odległości 1-3 mm powyżej płuca.</li>
	<li>Używając tępych nożyczek, przetnij ścianę klatki piersiowej. Następnie użyj zmodyfikowanych zapinek bezpieczeństwa (z usuniętą blaszką blokującą i zagiętym tępym końcem), aby utrzymać klatkę piersiową w pozycji otwartej.</li>
	<li>Aby ułatwić końcowe nałożenie szwu, przeprowadź koagulację i przetnij ścianę klatki piersiowej wzdłuż przepony w kierunku dolnej lewej strony klatki piersiowej.</li>
	<li>Odsłoń serce, rozcinając osierdzie. Aby uniknąć ruchów przepony, usuń i przetnij nerw przeponowy.</li>
	<li>Używając pęsety z małym, zwilżonym patyczkiem bawełnianym, odchyl serce w prawą stronę. Zidentyfikuj lewą tętnicę wieńcową (LCA) i upewnij się, że płuca nie są zbyt nadmuchane. Zoptymalizuj otwarcie klatki piersiowej, aby zapewnić pewny uchwyt serca podczas nakładania szwu. Jeśli ciśnienie krwi jest zbyt niskie, identyfikacja może być utrudniona. Dodatkowe bolusy soli fizjologicznej mogą ułatwić identyfikację LCA. LCA jest jaskrawoczerwonym naczyniem przebiegającym poziomo przez serce (w przeciwieństwie do żył odprowadzających). Czasami LCA najlepiej widać bez użycia mikroskopu. Nie stosuj zbyt silnego oświetlenia, ponieważ może to prowadzić do silnych odblasków uniemożliwiających wizualizację.</li>
	<li>Po wizualnej identyfikacji LCA, załóż szew nylonowy 8.0 (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) wokół LCA. W celu okresowego zamykania LCA zastosowaliśmy przewlekły model kardiomiopatii 42 z wykorzystaniem systemu obciążeń wiszących.</li>
	<li>Przewlecz szew przez mały kawałek plastikowej rurki (rurka PE-10) o tępych krawędziach i przymocuj dwa małe obciążniki (1 g, np. probówki Eppendorf wypełnione wodą) do każdego końca. Przy obciążnikach swobodnie zwisających z pręta, LCA powinna zostać natychmiast zamknięta. Ponadto, po zdjęciu obciążnika, okluzja LCA zostaje natychmiast przerwana. Prawidłowe zamknięcie LCA należy potwierdzić poprzez natychmiastową zmianę koloru naczynia z jasnoczerwonego na ciemnofioletowy, zmianę koloru mięśnia sercowego zaopatrywanego przez to naczynie (z jasnoczerwonego na biały) oraz wystąpienie uniesień odcinka ST w EKG. Podczas reperfuzji zmiany koloru natychmiast ustępują. Przez cały czas utrzymuj serce w wilgotnym stanie, przykrywając je nasączonym solą fizjologiczną kawałkiem waty w temperaturze 37°C (patrz również Rycina 1).</li>
	<li>Wybierz czas niedokrwienia zgodnie z głównym celem badania. W przypadku badań nad efektami kardioprotekcyjnymi IP idealnie byłoby zastosować czas niedokrwienia związany z wielkością zawału wynoszącą około 30 do 40% AAR. Umożliwiłoby to wykazanie zmian w obu kierunkach, np. mniejszej wielkości zawału przy IP serca lub większej wielkości zawału przy zastosowaniu eksperymentalnej terapii lub specyficznej delecji genu. Ponadto myszy z wielkością zawału mniejszą niż 50% zazwyczaj przeżywają eksperyment, podczas gdy zawały o wielkości 60 do 80% często kończą się zgonem zwierząt przed zakończeniem czasu reperfuzji. W naszym modelu 10 minut niedokrwienia mięśnia sercowego, a następnie 2 godziny reperfuzji, skutkuje wielkością zawału na poziomie 3,5 ±1,3% AAR. W przeciwieństwie do tego, czas niedokrwienia wynoszący 60 minut skutkuje średnią wielkością zawału 42±5,2% AAR (p&lt;0,01)39. Dlatego uznajemy 60 minut niedokrwienia za czas idealny do badania zmian w obu kierunkach. Niemniej jednak, w przypadku myszy z celowaną delecją genu o ciężkim fenotypie, czas niedokrwienia może wymagać dostosowania.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni czas reperfuzji. Czas reperfuzji jest krytycznie ważny dla barwienia TTC. Bezkolorowy barwnik jest redukowany do ceglastoczerwonego osadu przez dehydrogenazy w obecności koenzymu NADH. Obumierające komórki tracą zdolność do zatrzymywania NADH i w związku z tym są widoczne jako blade obszary w obrębie czerwonego, żywego mięśnia sercowego. Wyznaczenie wielkości zawału za pomocą TTC wymaga całkowitego wypłukania NADH z obszaru nekrotycznego. Jeśli jednak reperfuzja nie jest wystarczająco długa, wyznaczenie wielkości zawału metodą barwienia TTC może prowadzić do niedoszacowania rzeczywistej wielkości zawału 43. W naszych badaniach, po 60 min niedokrwienia, pomiar wielkości zawału wzrósł z 11,5 ± 4,5% po 30 minutach do 42,2 ± 5,1% po 120 minutach. Przy dłuższych czasach reperfuzji (240 minut) nie stwierdzono dalszego wzrostu wielkości zawału39. Z tego powodu zalecamy 2-godzinny okres reperfuzji, co wydaje się również uzasadnione w kontekście oznaczania enzymów sercowych. Jeśli planujesz zastosowanie prekondycjonowania niedokrwiennego, zalecamy 4 cykle IP (5 min niedokrwienia, 5 min reperfuzji), a następnie 60 min niedokrwienia i 2 godziny reperfuzji. W tych warunkach IP wiązało się z 3,2-krotną redukcją wielkości zawału z 42,2 ±5,1% do 13,3 ±3,3% AAR39. Jednak dzięki systemowi obciążeń wiszących można łatwo zastosować różne schematy prekondycjonowania.</li>
</ol>
3. Wyznaczanie obszaru zagrożonego (AAR) oraz wielkości zawału mięśnia sercowego
Po indukcji zawału mięśnia sercowego (z IP lub bez), obszar ten jest ukrwiany przez LCA (obszar zagrożony, AAR), a wielkość samego zawału zostanie określona za pomocą techniki barwienia. Następnie wielkość zawału zostanie obliczona jako procent zawału mięśnia sercowego w stosunku do AAR. W tym celu stosuje się wcześniej opisaną technikę podwójnego barwienia błękitem Evansa i chlorkiem trifenylotetrazoliom (TTC) 44.
<ol>
	<li>Wyznacz obszar zagrożony (AAR) poprzez wtryskiwanie wsteczne 1% barwnika błękitu Evansa do aorty przy zamkniętej lewej tętnicy wieńcowej (LCA). Alternatywnie, jeśli założony został cewnik tętnicy szyjnej, należy wykorzystać tę drogę do podania błękitu Evansa. Błękit Evansa zabarwi na niebiesko całą tkankę mięśnia sercowego z wyjątkiem AAR. W tym kroku krytyczne jest uniknięcie pęcherzyków powietrza w cewniku, ponieważ zostałyby one wstrzyknięte do krążenia wieńcowego i uniemożliwiłyby barwienie błękitem Evansa. Przed barwieniem błękitem Evansa można pobrać krew do pomiaru enzymów sercowych. Ponadto zaleca się usunięcie krwi poprzez wstrzyknięcie 5 ml soli fizjologicznej przez cewnik aorty lub tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Wyciąć serce i wypłukać w lodowatej 0,9% soli fizjologicznej</li>
	<li>Zatopić w 2% agarozie. Nie należy używać gorącej agarozy, ponieważ uniemożliwi to prawidłowe barwienie.</li>
	<li>Po 30 minutach w +4°C (lub 15 minutach w -20°C), pociąć serce na plastry o grubości 1 mm przy użyciu matrycy do serca lub mikrotomu. Jeśli serce jest umieszczane w zamrażarce, należy unikać wysychania podczas mrożenia, co mogłoby prowadzić do braku zabarwienia serc.</li>
	<li>Inkubować plastry z 1% TTC w 37°C przez 10 min w 15 ml probówce z niebieską zakrętką w łaźni wodnej. Pozwoli to na wyznaczenie obszaru zawału jako strefy białej, podczas gdy tkanka żywa zabarwi się na czerwono.</li>
	<li>Utrwalić zabarwione plastry w 10% formaldehydzie przez noc. Dzięki temu obszar zawału jest lepiej skontrastowany, co poprawia jakość zdjęć.</li>
	<li>Wyznaczyć obszar zagrożony (AAR) oraz wielkość zawału za pomocą planimetrii, korzystając z oprogramowania NIH Image 1.045.</li>
	<li>Obliczyć procent zawału mięśnia sercowego w stosunku do obszaru zagrożonego.</li>
</ol>
4. Pomiar enzymów sercowych
Ze względu na ograniczenia związane z barwieniem TTC, jako dodatkowy wskaźnik nasilenia zawału mięśnia sercowego zalecamy oznaczenie poziomu troponiny I serca (cTnI) w surowicy myszy. Krew pobiera się z żyły wrotnej, a następnie poziom cTnI w surowicy określa się za pomocą ilościowego szybkiego testu cTnI (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA).
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Schemat eksperymentu na sercu myszy przedstawiający układ do ligacji lewej tętnicy zstępującej oraz widoki chirurgiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Model IP serca z wykorzystaniem systemu obciążników wiszących do okluzji wieńcowej. Technika ta nie wymaga wiązania węzła w celu uzyskania okluzji tętnicy wieńcowej. (B, C) Układ chirurgiczny. (D) Obraz serca myszy z lewą tętnicą wieńcową (LCA, strzałki) po okluzji. Wizualna identyfikacja LCA jest niezbędna do ligacji i przedkondycjonowania niedokrwiennego u myszy. Szew nylonowy 8.0 jest umieszczany wokół LCA 1-2 mm poniżej lewego przedsionka. Szew jest przeciągnięty przez małą plastikową rurkę (*). Koniec każdego szwu jest przymocowany do małego obciążnika (1g), a szew jest ułożony na prętach po obu stronach. (E) Wyznaczenie AAR po okluzji LCA i retrograde'owym wstrzyknięciu barwnika błękitu Evansa do aorty. AAR pozostaje niezafarbowana, podczas gdy reszta mięśnia sercowego jest niebieska. Po inkubacji tkanki AAR z TTC obszar zawału zabarwił się na biało, natomiast tkanka żywa na czerwono.

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejsze badanie opisuje nową technikę przeprowadzania IP w nienaruszonym modelu mysim z wykorzystaniem systemu obciążnika wiszącego, co pozwala uniknąć okluzji tętnicy wieńcowej za pomocą węzła. W rzeczywistości badanie to wykazuje wysoką powtarzalność wielkości obszaru zawału oraz ochronę serca poprzez IP, co minimalizuje zmienność związaną z modelami okluzji wieńcowej opartymi na wiązaniu węzła. Badacze rozważający badanie kardioprotekcji poprzez IP u myszy mogą odnieść korzyść z zastosowania tego modelu.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodowy (Fatal Plus)</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td>V.P.L. 9372</td><td>4mg/mL w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17779 Fluka</td><td>1.5 % w PBS</td></tr><tr><td>Błękit Evansa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td>10g w 1 L PBS</td></tr><tr><td>Insyte 22 G</td><td>BD Biosciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, jedwab 4.0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, Prolene 8.0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>M8739</td><td>wielorazowe</td></tr><tr><td>Matryca do serca</td><td>Zivic Instruments</td><td># HSMS001</td><td></td></tr><tr><td>Siemens 900 C</td><td>DRE Veterinary</td><td># 336</td><td>odnowiony</td></tr><tr><td>mikroskop sekcyjny (SZX10 )</td><td>Olympus Corporation</td><td>n/a</td><td>należy zapewnić odpowiednią odległość roboczą</td></tr><tr><td>Stół grzewczy</td><td>Rt, Effenberger, Germany</td><td>n/a</td><td>jedyny dostawca</td></tr><tr><td>Urządzenie do pomiaru ciśnienia tętniczego</td><td>Cyber Sense, Inc</td><td>BPM02</td><td></td></tr><tr><td>I STAT</td><td>Abbott Laboratories</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie systemu obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej u myszy

Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Badania nad ostrym uszkodzeniem u myszy stanowią obszar intensywnych poszukiwań, ponieważ coraz bardziej dostępne stają się myszy z nokautem różnych genów 1-38. Kardioprotekcja poprzez przedwarunkowanie niedokrwienne (IP) pozostaje dziedziną intensywnych badań. W celu dalszego wyjaśnienia jej podstaw molekularnych szczególnie istotne jest wykorzystanie badań na myszach z nokautem 7, 14, 30, 39. Pomimo faktu, że w poprzednich badaniach z powodzeniem przeprowadzano niedokrwienie i reperfuzję serca u myszy, model ten jest niezwykle trudny pod względem technicznym. W szczególności trudne technicznie jest wizualne zidentyfikowanie tętnicy wieńcowej, umieszczenie szwu wokół naczynia oraz okluzja wieńcowa poprzez zawiązanie naczynia węzłem z podparciem. Dodatkowym wyzwaniem jest ponowne rozwiązanie węzła w celu okresowej reperfuzji tętnicy wieńcowej podczas IP bez powodowania urazów chirurgicznych. Ponadto, jeśli węzeł nie zostanie zawiązany wystarczająco mocno, nieumyślna reperfuzja wynikająca z niedoskonałej okluzji tętnicy wieńcowej może wpłynąć na wyniki. W rzeczywistości może się to łatwo zdarzyć z powodu ruchów bijącego serca.
Ze względu na potencjalne problemy związane ze stosowaniem systemu podwiązywania tętnic wieńcowych, przyjęliśmy wcześniej opublikowany model przewlekłej kardiomiopatii oparty na systemie obciążników zawieszeń do przerywanego zamykania tętnicy wieńcowej podczas IP 39. W ten sposób zamknięcie tętnicy wieńcowej można osiągnąć bez konieczności wiązania jej węzłem. Ponadto reperfuzję naczynia można łatwo uzyskać poprzez podtrzymanie obciążników, które znajdują się w miejscu oddalonym od tkanek serca.
Systematycznie przetestowaliśmy ten układ, uwzględniając zmienność czasu niedokrwienia i reperfuzji, schematy prekondycjonowania, temperaturę ciała oraz tło genetyczne39. Oprócz barwienia obszaru zawału, przetestowaliśmy troponinę I serca (cTnI) jako marker zawału mięśnia sercowego w tym modelu. Rzeczywiście, poziomy cTnI w osoczu korelowały z wielkością zawałów (R2=0.8). Wreszcie, w kilku badaniach wykazaliśmy, że technika ta pozwala uzyskać wysoką powtarzalność wielkości zawałów podczas IP i zawału mięśnia sercowego u myszy6, 8, 30, 40, 41. W związku z tym technika ta może być pomocna dla badaczy analizujących mechanizmy molekularne zaangażowane w kardioprotekcję poprzez IP, stosując podejście genetyczne u myszy z ukierunkowaną delecją genu. Dalsze badania nad IP serca z wykorzystaniem myszy transgenicznych mogą uwzględnić tę technikę.

Mysi model niedokrwienia mięśnia sercowego i prekondycjonowania niedokrwiennego jest ważnym narzędziem do badania mechanizmów kardioprotekcyjnych in vivo. W niniejszej pracy przedstawiamy łatwy w zastosowaniu model in situ dla IP serca, wykorzystujący system obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej.

Zastosowanie systemu obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej u myszy

Badania nad ostrym uszkodzeniem w modelach mysich stanowią obszar intensywnych analiz, zwłaszcza że coraz bardziej dostępne stają się myszy z nokautem różnych genów 1-38. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie niedokrwienia mięśnia sercowego w sercu neuronowym z zastosowaniem lub bez zastosowania uprzedniego uprzedzenia niedokrwiennego. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie zoptymalizowanej techniki znieczulenia, ułożenia zwierzęcia, wentylacji i płynoterapii. Drugim krokiem procedury jest wykonanie bocznej torakotomii w celu ułatwienia dostępu do tętnicy wieńcowej.Trzecim krokiem jest umieszczenie ultrascienkiej nici chirurgicznej pod tętnicą i zastosowanie systemu z obciążnikiem w celu wywołania niedokrwienia. Na koniec do tętnicy szyjnej wstrzykuje się barwnik błękit Evansa, a następnie przeprowadza barwienie TTC serca w celu wizualizacji zawałowej tkanki. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące zakres uszkodzenia mięśnia sercowego u zwierząt genetycznie zmodyfikowanych lub leczonych farmakologicznie.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na problemy z identyfikacją tętnicy wieńcowej oraz złożoność znieczulenia, wentylacji i uzupełniania płynów. Aby rozpocząć, umieść znieczuczoną mysz w pozycji grzbietnej na stole grzewczym z kontrolą temperatury, wykonaj pętle z nici chirurgicznej wokół każdej kończyny, a następnie przymocuj nici do stołu taśmą. Następnie unieruchom głowę, przeprowadzając nić pod górnymi siekaczami.Ruchy myszy podczas unieruchamiania. Wykorzystanie szwu wskazuje na niewłaściwą głębokość znieczulenia dla procedury chirurgicznej. W takim przypadku należy powtórnie podać myszy dawkę pentobarbitalu w ilości od jednej trzeciej do jednej czwartej dawki początkowej, a następnie potwierdzić znieczulenie za pomocą testu uścisku palca (toe pinch).Po przygotowaniu mysz można pokryć olejem mineralnym, aby ograniczyć ekspozycję na alergeny pochodzące z sierści. Podaj bolus soli fizjologicznej w ilości 500 µL i wprowadź sondę rektalną podłączoną do kontrolera sprzężenia zwrotnego temperatury, aby zapewnić utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37 °C. Aby odsłonić tchawicę, wykonaj nacięcie wzdłuż szyi i rozszerz je tępym narzędziem.Wypreparuj otaczające mięśnie i tkankę łączną. Przytrzymaj język pęsetą i ostrożnie wprowadź tępą kaniulę polietylenową pod kątem 15 stopni w kierunku ciała. Potwierdź prawidłowe umieszczenie rurki poprzez bezpośrednią wizualizację kaniuli w uprzednio odsłoniętej tchawicy.Nad Coriną. Podłącz rurkę do respiratora servo 900 C. Ustaw szczytowe ciśnienie wdechowe na 10 millibars przy częstotliwości 110 oddechów na minutę oraz dodatnie ciśnienie końcowowydechowe od trzech do pięciu millibars z frakcją tlenu w mieszaninie wdechowej równą 0,4.Po pomyślnym podłączeniu zwierzęcia do respiratora, do tętnicy szyjnej wprowadza się cewnik w celu pomiaru ciśnienia tętniczego krwi i częstości akcji serca. Dłuższy odcinek tętnicy zostanie odsłonięty, jeśli przedtem przymocuje się kończynę do boku ciała. Należy rozpocząć od tępego rozdzielenia mięśni przytętniczych w celu odsłonięcia tętnicy szyjnej; po jej wyizolowaniu należy zawiązać szew na końcu proksymalnym tętnicy i zabezpieczyć ją klamrą lub taśmą.Nałóż drugi szew w odległości około 0.5 centymetra od pierwszego i zawiąż go, lecz nie zaciskaj szwu wokół tętnicy. Wypreparuj tętnicę aż do jej najbardziej dystalnego końca i załóż mały zacisk, aby zapobiec utracie krwi. Za pomocą mikronożyczek wykonaj małe, ukośne nacięcie w tętnicy poniżej pierwszego szwu.Przytrzymaj otwór za pomocą precyzyjnej pęsety podczas wprowadzania cewnika. Przesuń cewnik do przodu. Przeprowadź drugą szydzącą nić i zaciśnij węzeł, aby utrzymać cewnik na miejscu.Następnie poluzować zacisk i przesunąć cewnik dalej. Zabezpieczyć cewnik kilkoma węzłami oraz taśmą. Po umieszczeniu cewnika w odpowiedniej pozycji, rozpocząć infuzję soli fizjologicznej z prędkością 0.1 milliliter per hour i podłączyć go do urządzenia do pomiaru ciśnienia tętniczego.Na koniec przymocuj klamry do kończyn w celu monitorowania częstotliwości akcji serca. Po zakończeniu przygotowań chirurgicznych wykonaj nacięcie nad klatką piersiową i odsłoń mięśnie piersiowe. Przetnij mięśnie piersiowe w taki sposób, aby można było je odciągnąć pionowo w górę.Użyj sznurka, aby wyznaczyć poziomą linię na ścianie klatki piersiowej w miejscu nacięcia, wykorzystując mięsień kordy. Skurcze są normalną reakcją na przyłożony prąd. Należy odróżnić te ruchy od niewłaściwej głębokości znieczulenia, uciskając palcami lub pincetą palce u nóg.Przed rozcięciem unieś mięsień, aby upewnić się, że płuca opadną i nie będą przeszkadzać. Roznij ścianę klatki piersiowej tępymi nożyczkami i użyj zmodyfikowanych igieł zabezpieczających, aby utrzymać klatkę piersiową w pozycji otwartej. Następnie rozetnij klatkę piersiową wzdłuż przepony, oddzielając ją od jamy klatki piersiowej.Najpierw wyznacz przewidywaną linię cięcia za pomocą qy, a następnie wykonaj pionowe cięcie wzdłuż przepony w kierunku dolnej lewej strony klatki piersiowej. Przeprowadź sekcję osierdzia, aby odsłonić serce, i przetnij nerw przeponowy. Aby uniknąć ruchów przepony, użyj wilgotnego aplikatora z bawełnianym końcem, aby przesunąć serce w prawą stronę.Zidentyfikuj lewą tętnicę wieńcową (LCA) i zoptymalizuj otwarcie klatki piersiowej. Zapewni to pewny uchwyt serca. Podczas zakładania szwu, przez cały czas trwania procedury utrzymuj serce w stanie wilgotnym, używając nasączonego roztworem soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C kawałka waty. Po zidentyfikowaniu naczynia, umieść szew nylonowy pod LCA.Przygotuj system obciążeń wiszących, przeplatając oba końce szwu przez niewielki odcinek plastikowej rurki z zaokrąglonymi krawędziami. Do każdego końca szwu przymocuj niewielki ciężarek i przerzuć szew przez pręt, aby wytworzyć napięcie, podczas gdy ciężarki swobodnie zwisają z pręta. LCA powinno zostać natychmiast zamknięte. Powodzenie.Zatkanie LCA można potwierdzić poprzez natychmiastową zmianę koloru naczynia z jasnoczerwonego na ciemnofioletowy oraz zmianę koloru mięśnia sercowego zaopatrywanego przez to naczynie z jaskrawoczerwonego na biały. Przerwij zatkanie LCA w określonym czasie, zdejmując obciążniki. Prawidłowa reperfuzja jest widoczna, gdy kolor powraca, co pozwala wyznaczyć obszar zagrożenia.Lub wstrzyknij 1% barwnika Evans blue do aorty, gdy LCA jest zamknięte. Evans blue zabarwi na niebiesko całą tkankę mięśnia sercowego z wyjątkiem obszaru r.W celu dalszej analizy obszaru zawału, wyciąć serce i wypłukać je w lodowatej soli fizjologicznej 0,9%. Osadzić serce w 2% aeros i pozostawić w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Przeciąć serce na plastry o grubości jednego milimetra.Za pomocą matrycy do serca lub mikrotomu należy inkubować skrawki w 1% TTC w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po wywołaniu, przy użyciu 15 ml probówki z niebieską zakrętką w kąpieli wodnej, obszar zawału pozostanie biały, natomiast tkanki żywe zabarwią się na czerwono. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie niedokrwienia mięśnia sercowego drogę do badania efektów kardioprotekcyjnych z wykorzystaniem modeli genetycznych i farmakologicznych.

use-of-a-hanging-weight-system-for-coronary-artery-occlusion-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie systemu zawieszenia ciężaru do zamknięcia tętnic wieńcowych u myszy

Precyzyjny mysi model ostrego uszkodzenia nerek (AKI) wywołanego niedokrwieniem jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia nerek i potencjalnego poszukiwania środków terapeutycznych do leczenia uszkodzeń nerek. System obciążników wiszących zapewnia narzędzie do natychmiastowej i niezawodnej okluzji oraz reperfuzji tętnicy nerkowej bez powodowania zastoju nerkowego.

Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Opracowaliśmy nowy mysi model systemu obciążnika wiszącego do zamykania zatoki wrotnej. Technika ta może być użyteczna w przyszłych badaniach nad niedokrwieniem w mysich modelach wątroby.

Zastosowanie systemu z obciążnikiem wiszącym do indukowania niedokrwienia wątroby u myszy

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Procedura chirurgiczna stosowana w celu wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego u myszy rozpoczyna się od lewej torakotomii między trzecim a czwartym żebrem, aby umożliwić wizualizację przedniej powierzchni serca i lewego płuca. Następnie podwiązuje się lewą tętnicę wieńcową, zamyka klatkę piersiową i pozostawia mysz do samoistnego powrotu do sprawności.

Zmodyfikowana technika ligacji tętnicy wieńcowej u myszy

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na wygenerowaniu mysiego modelu zawału mięśnia sercowego poprzez trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.

Generowanie mysiego modelu zawału mięśnia sercowego: zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej w modelu mysim

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC) zachowuje podstawowe cechy regularnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC), eliminując jednocześnie użycie respiratora z intubacją tchawiczą. Okazuje się, że jest to wysoce pożądana metoda w wysokoprzepustowych badaniach przeciążenia lewej komory, szczególnie w badaniach translacyjnych.

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Przedstawiono tutaj zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten można wykorzystać do zbadania patofizjologii i związanej z nią odpowiedzi zapalnej po zawale mięśnia sercowego.

Podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej: chirurgiczny mysi model zawału mięśnia sercowego

Poznaj metodę niedrożności tętnic wieńcowych u myszy za pomocą systemu wiszącego ciężarka. Technika umożliwia badanie mechanizmów kardioprotekcyjnych i rozmiaru zawału mięśnia sercowego in vivo.

Zastosowanie systemu obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej u myszy

Przeglądaj więcej filmów