Name: Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj strategię identyfikacji mutacji de novo w autyzmie i schizofrenii przy użyciu sekwencjonowania egzomu i narzędzi bioinformatycznych. Metoda ta pozwala odkryć nowe geny kandydujące, takie jak Shank3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym sponsorom Genome Canada i Génome Québec, a także Université de Montréal oraz Canadian Foundation for Innovation za sfinansowanie projektu „Synapse to Disease” (S2D).

1. Wybór choroby, która może być spowodowana mutacjami de novo
Choroba spełniająca następujące kryteria może być zgodna z hipotezą mutacji de novo: 
<ol>
 <li>Sprawność rozrodcza jest obniżona.</li>
 <li>Częstość występowania choroby jest stosunkowo wysoka i stała, mimo znacznych różnic w środowisku.</li>
 <li>Choroba jest powiązana z wyższym wiekiem ojca.</li>
 <li>Klasyczne badania sprzężeń i asocjacji nie pozwoliły wyjaśnić znaczącej części dziedziczności choroby.</li>
 <li>Dane dotyczące zgodności u bliźniąt wspierają model mutacji de novo.</li>
</ol>
Kluczowym pierwszym krokiem jest analiza prawdopodobieństwa, że w przypadku powszechnej choroby mutacje de novo mogą w części wyjaśniać jej podłoże genetyczne.
2. Wybór przypadków i próbek DNA
Wybór odpowiednich próbek ma krytyczne znaczenie dla sukcesu identyfikacji mutacji de novo. Aby zmaksymalizować szansę na znalezienie mutacji de novo, zalecamy następujące działania:
<ol>
 <li>Należy wybrać przypadki z wczesnym wiekiem wystąpienia objawów, ciężkim fenotypem, z nieobciążonymi rodzicami, starszymi ojcami oraz brakiem rodzinnego wywiadu w kierunku choroby. </li>
 <li>Należy wybrać pacjentów, dla których dostępne ilości DNA są wystarczające do przeprowadzenia badania. Szczególnie istotna jest dostępność DNA z pierwotnego źródła komórkowego, które nie było poddawane hodowli (np. DNA z krwi lub DNA ze śliny). </li>
 <li>Dostępność DNA obojga rodziców jest kluczowa dla określenia statusu przekazywania mutacji (dziedziczna vs. de novo). Dostępność dodatkowych kohort osób chorych oraz prawidłowych kontroli jest niezbędna do badań walidacji genetycznej po zidentyfikowaniu genów kandydackich. </li>
 <li>Oszacuj wielkość próby na podstawie częstości mutacji, liczby genów poddawanych badaniom oraz szacowanej frakcji przypadków, które mogą wynikać z de novo mutacja </li>
</ol>
3. Resekwencjonowanie genów; dwa główne podejścia
<ol>
 <li>Wysokojakościowe sekwencjonowanie o niskiej przepustowości 
 Podejście to opiera się na metodzie genów kandydatów.
 <ol>
 	<li>Wybór genu (genów) kandydata 
		Wybrano najlepsze geny kandydatów w oparciu o system punktacji zbudowany na 6 głównych kryteriach. Następnie obliczono sumę wszystkich punktów przypisanych przy użyciu sześciu kryteriów wymienionych w Tabeli 1. Przykład z naszego projektu, przedstawiający rozkład genów wybranych i niewybranych, znajduje się na rysunku 1. 
<img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabela kryteriów implikacji synaptycznej; analiza ekspresji genetycznej; badanie genów związanych z mózgiem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
 Tabela 1. Kryteria stosowane do wyboru genów kandydatów 
<img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Wykres słupkowy wyboru sekwencjonowania genów, mutacje IL1RAPL1, SHANK3, liczba analizowanych genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Wykres przedstawiający rozkład genów wybranych i niewybranych do sekwencjonowania w naszym projekcie. Uzyskano rozkład genów uszeregowanych według właściwości kandydujących poprzez sortowanie genów zgodnie z ich wartością punktową. Na przykład geny SHANK3 i NRXN1, w których znaleźliśmy mutację de novo, otrzymały odpowiednio 7 i 6 punktów (maksimum to 12).</li>
	 	<li>Zaprojektowanie starterów przy użyciu oprogramowania Primers3 za pośrednictwem Exonprimer. Należy objąć jedynie region kodujący i miejsce połączenia eksonów (splice junction), uwzględniając dodatkowe 50 par zasad po każdej stronie eksonu.</li>
	 	<li>Optymalizacja warunków PCR pod kątem wyboru polimerazy Taq, objętości reakcji itp.</li>
	 	<li>Optymalizacja wszystkich fragmentów PCR</li>
	 	<li>Amplifikacja 5 ng genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek krwi zgodnie ze standardowymi procedurami</li>
	 	<li>Przed wysłaniem do sekwencjonowania należy przeprowadzić kontrolę jakości produktów PCR, nanosząc je na żel agarozowy 2%. Próbki wybrano losowo.</li>
	 	<li>Sekwencjonowanie produktów PCR na analizatorze DNA w jednej nici. Fragment uznaje się za pomyślnie zsekwencjonowany, jeśli możliwa jest analiza ponad 90% śladów. Metoda ta jest stosowalna w badaniach przesiewowych na dużą skalę.</li>
		<li>Wykrywanie wariantów
		 <ol>
		 <li>Użycie narzędzi do wykrywania i genotypowania wariacji genomicznych, takich jak PolyPhred, Polyscan i Mutation Surveyor. Idealna jest kombinacja więcej niż dwóch narzędzi detekcyjnych. Na przykład PolyPhred v.5 i PolyPhred v.6 przy domyślnych ustawieniach nie wykrywają tych samych wariacji. Polyscan v.3 wykazuje wyższy odsetek fałszywie dodatnich mutacji dla SNP (96%) i niższy dla INDELi (93%). PolyPhred v.6 nie wykrył większości prawdziwych INDELi, ale ogólny odsetek fałszywie dodatnich mutacji (dla INDELi) był niższy niż w Polyscan v.3 (90%). Należy wyłączyć opcję wykrywania SNP w Polyscan v.3 i zachować zarówno PolyPhred v.5, jak i PolyPhred v.6 do wykrywania wariantów. Mutation Surveyor i Polyscan lepiej nadają się do wykrywania indeli. Uwaga: Opcja wykrywania SNP nie powinna być stosowana podczas korzystania z Polyscan. Powinna być włączona jedynie opcja „indel”. Polyscan generował zbyt wiele wyników fałszywie dodatnich przy wykrywaniu SNP.</li>
		 <li>W przypadku każdego wykrytego unikalnego nowego wariantu eksonowego należy potwierdzić go ręcznie poprzez ponowną amplifikację fragmentu i ponowne sekwencjonowanie probanda oraz obojga rodziców przy użyciu starterów rewersyjnych i forward, aby wyeliminować wszelkie artefakty techniczne.</li>
		 </ol>
		</li>
	</ol>
 </li>
 <li>Sekwencjonowanie całego eksomu 
 Podejście to stanowi sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, ukierunkowane na większość regionów kodujących genomu ludzkiego. Obecnie stosujemy tę nową metodę w naszym laboratorium, co przyspiesza wykrywanie potencjalnych genów kandydatów.
		<ol>
 		<li>Zamówienie zestawu „SureSelect Human All Exon” ukierunkowanego na regiony kodujące ponad 16 000 genów (50 MB genomu) zaprojektowanego przez Agilent lub innego podobnego produktu od innych producentów, np. Roche. Przed zamówieniem zestawu do wychwytu należy określić platformy sekwencjonowania (Illumina vs SOLiD).</li>
		 <li>Przeprowadzenie wychwytu zgodnie z protokołem Agilent</li>
		 <li>Sekwencjonowanie produktu na dostępnej, odpowiedniej platformie nowej generacji</li>
		 <li>Wykrywanie wariantów z sekwencjonowania całego eksomu: Dostępnych jest kilka narzędzi bioinformatycznych do wykrywania i genotypowania wariacji genomicznych z platformy sekwencjonowania nowej generacji, takich jak BWA, Bfast, Bioscope, które służą do wyrównywania sekwencji (alignment). Następnie potrzebne będą dodatkowe, bezpłatnie dostępne narzędzia do analizy końcowej (np. SAM tools, Varscan, Annovar), aby zidentyfikować (call) i adnotować warianty. Dostępne jest również komercyjne oprogramowanie integrujące wyrównywanie sekwencji, identyfikację i adnotację wariantów, takie jak NextGEN (Softgenetics), CLC Bio i inne</li>
	 </ol>
 </li>
</ol>
4. Priorytetyzacja wariantów genomicznych
Zidentyfikowane warianty są następnie priorytetyzowane do dalszych analiz w zależności od prawdopodobieństwa, że są one wariantami de novo i mają szkodliwy wpływ na funkcję i/lub strukturę białka lub mRNA. Priorytety analizy wariantów w celu wykrycia wariantów de novo powinny być następujące:
<ol>
 <li>Warianty unikalne (zaobserwowane raz w jednym przypadku)</li>
 <li>Warianty nieobecne u rodziców</li>
 <li>Warianty prowadzące do skrócenia białka: nonsensowne, indels prowadzące do przesunięcia ramki odczytu oraz mutacje splicingowe.</li>
 <li>Warianty missense i ciche, których przewiduje się, że zaburzają funkcję (np. wpływają na splicing mRNA). Do przewidywania wpływu funkcjonalnego na białko należy wykorzystać Polyphen, SIFT oraz PANTHER.</li>
</ol>
W przypadku zastosowania sekwencjonowania całego eksomu, wybór genów kandydackich może służyć jako strategia priorytetyzacji wariantów do dalszych badań.
5. Walidacja genetyczna
<ol>
 <li>Przeprowadź ponowne sekwencjonowanie całego genu w dodatkowych przypadkach pacjentów (w celu zidentyfikowania innych mutacji sprawczych) oraz w grupach kontrolnych. Próbki kontrolne zostaną wykorzystane do oceny częstości allelicznej priorytetowych wariantów. Każdy gen zawierający co najmniej dwie różne szkodliwe mutacje de novo (nonsensowne, splicingowe, przesunięcia ramki odczytu oraz przewidywane szkodliwe mutacje missense) znalezione u różnych pacjentów (ale nie w próbkach kontrolnych ani publicznych bazach danych) powinien zostać uznany za wysokopriorytetowy do dalszych badań walidacyjnych. Obejmuje to: 1) badanie potencjalnego defektu splicingu w liniach limfoblastoidalnych pochodzących od pacjenta. Z naszego doświadczenia wynika, że większość genów pozwala na uzyskanie produktów RT-PCR z linii limfoblastoidalnych; 2) zbadanie zmienionych poziomów ekspresji białek za pomocą ilościowej analizy Western blot ekstraktów białkowych z linii limfoblastoidalnych oraz 3) dalsze testowanie mutacji/genu na poziomie funkcjonalnym w modelach zwierzęcych (c elegans, Zebrafish) i liniach komórkowych, zgodnie z wcześniejszą praktyką naszej grupy (np. 5,6).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Postępując zgodnie z tym protokołem, udało nam się zidentyfikować nowe geny związane z schizofrenią i autyzmem. Przykładem jest nasze niedawne odkrycie dotyczące genu SHANK3 (Ryc. 2). Wykryto dwie różne mutacje de novo w genie SHANK3: jedną mutację nonsensowną u trzech dotkniętych chorobą braci oraz jedną mutację missense u jednej dotkniętej chorobą kobiety.
<img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Schemat rodowodu; sekwencjonowanie DNA; analiza mutacji genowych; wzorce dziedziczenia rodzinnego; wyniki syntezy białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. (A) Segregacja nonsensownej mutacji R1117X u trzech dotkniętych braci z rodziny PED 419. Probanda zaznaczono strzałką. (B) Segregacja mutacji missense R536W u probandki, która nie wystąpiła u jej zdrowego brata w rodzinie PED 56.

<ol><li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li>
<li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia%3A+manifestations%2C+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med+Monogr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).</li>
<li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+and+paternal+age%3A+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li>
<li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li>
<li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li>
<li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Procedura opisana w niniejszym dokumencie ma na celu identyfikację określonych powszechnych chorób, które prawdopodobnie wynikają częściowo z mutacji de novo, oraz udowodnienie tej hipotezy. Mutacje de novo są dobrze udokumentowanym mechanizmem rozwoju wielu chorób, na przykład dziedzicznych zespołów nowotworowych, lecz były słabo badane w przypadku chorób powszechnych. Wynika to częściowo z wyzwań technicznych związanych z identyfikacją mutacji de novo, co wymaga sekwencjonowania dużych ilości DNA, które stało się opłacalne dopiero niedawno wraz z pojawieniem się sekwencjonowania nowej generacji (Next Generation Sequencing). Ponadto stopa mutacji de novo u ludzi do niedawna była jedynie szacunkiem. Dopiero w ostatnim czasie pojawiły się doniesienia bezpośrednio określające stopę mutacji u ludzi. Przed przeprowadzeniem tych pomiarów trudno było przewidzieć wielkość próby niezbędną do tego rodzaju badań oraz ustalić, czy obserwowana stopa mutacji de novo jest wyższa od stopy bazowej. Sekwencjonowanie genów kandydackich czy całego genomu? Ponieważ większość zgłoszonych mutacji chorobowych to mutacje missense/nonsense oraz mutacje w obrębie miejsc splicingowych (według strony internetowej HGMD), nasza strategia przesiewowa pozwoliłaby zidentyfikować ponad 68% znanych mutacji. Istnieje również wyraźna zależność między stopniem drastyczności zamiany aminokwasu a prawdopodobieństwem wystąpienia fenotypu klinicznego. W porównaniu z konserwatywną substytucją aminokwasu, zmiana nonsense jest 9,0 razy bardziej prawdopodobna pod kątem przejawiania się klinicznie 7. Zatem obecnie sekwencjonowanie genów kandydackich jest najbardziej efektywną kosztowo strategią.
Sukces opisanego postępowania zależy od kilku krytycznych etapów, które zostały szczegółowo omówione i zilustrowane na dwóch przykładach: autyzmu oraz schizofrenii. Istnieje wiele pułapek, których należy unikać, takich jak wybór odpowiedniej choroby, dobór pacjentów do badań, źródło DNA oraz szczegóły dotyczące efektywnej identyfikacji mutacji de novo. Przedstawiamy metodę najefektywniejszego określania frakcji przypadków dowolnej choroby, które są wynikiem takich mutacji spontanicznych.

strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Istnieje kilka linii dowodów wspierających rolę mutacji de novo jako mechanizmu powstawania powszechnych zaburzeń, takich jak autyzm i schizofrenia. Po pierwsze, stopień występowania mutacji de novo u ludzi jest stosunkowo wysoki, przez co w populacji z wysoką częstotliwością powstają nowe mutacje. Jednakże w większości powszechnych chorób nie raportowano mutacji de novo. Mutacje w genach prowadzące do ciężkich chorób, w których występuje silna selekcja negatywna przeciwko fenotypowi – np. letalność w stadiach embrionalnych lub obniżona sprawność rozrodcza – nie będą przekazywane wielu członkom rodziny, a zatem nie zostaną wykryte za pomocą mapowania genów przez sprzężenie lub badań asocjacyjnych. Obserwacja bardzo wysokiej zgodności u bliźniąt jednojajowych i bardzo niskiej zgodności u bliźniąt dwujajowych również silnie wspiera hipotezę, że znaczna część przypadków może wynikać z nowych mutacji. Jest to przypadek chorób takich jak autyzm i schizofrenia. Po drugie, pomimo obniżonej sprawności rozrodczej1 i niezwykle zmiennych czynników środowiskowych, zapadalność na niektóre choroby utrzymuje się na całym świecie na stosunkowo wysokim i stałym poziomie. Dotyczy to autyzmu i schizofrenii, których zapadalność wynosi około 1% na całym świecie. Obciążenie mutacyjne można rozumieć jako równowagę między selekcją za lub przeciwko szkodliwej mutacji a jej powstawaniem poprzez mutację de novo. Niższy poziom reprodukcji stanowi czynnik selekcji negatywnej, który powinien redukować liczbę alleli mutantów w populacji, co ostatecznie prowadziłoby do zmniejszenia rozpowszechnienia choroby. Presje selekcyjne te mają tendencję do różnej intensywności w różnych środowiskach. Niemniej jednak, te ciężkie zaburzenia psychiczne utrzymują się na stałym, stosunkowo wysokim poziomie rozpowszechnienia w populacji światowej, w szerokim zakresie kultur i krajów, pomimo silnej selekcji negatywnej przeciwko nim2. Nie jest to wynik, którego należałoby oczekiwać w chorobach z obniżoną sprawnością rozrodczą, chyba że istniałby wysoki stopień nowych mutacji. Wreszcie, wpływ wieku ojca: istnieje znacząco zwiększone ryzyko choroby wraz ze wzrostem wieku ojca, co może wynikać z zależnego od wieku wzrostu liczby paternalnych mutacji de novo. Ma to miejsce w przypadku autyzmu i schizofrenii3. Stosunek tempa mutacji u mężczyzn do kobiet szacuje się na około 4–6:1, co prawdopodobnie wynika z większej liczby podziałów komórek linii zarodkowej wraz z wiekiem u mężczyzn. Można zatem przewidzieć, że mutacje de novo częściej będą pochodzić od mężczyzn, szczególnie tych starszych4. Wysoki stopień nowych mutacji może częściowo wyjaśniać, dlaczego badaniom genetycznym nie udało się dotąd zidentyfikować wielu genów predysponujących do złożonych chorób genetycznych, takich jak autyzm i schizofrenia, oraz dlaczego zidentyfikowano choroby dla zaledwie 3% genów w ludzkim genomie. Identyfikacja mutacji de novo jako przyczyny choroby wymaga ukierunkowanego podejścia molekularnego, obejmującego badanie rodziców i osób chorych. Proces ustalania, czy podłoże genetyczne choroby może w części wynikać z mutacji de novo, oraz podejście molekularne służące do ustalenia tego związku zostaną przedstawione na przykładach autyzmu i schizofrenii.

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Istnieje wiele dowodów wspierających rolę mutacji de novo jako mechanizmu powstawania częstych zaburzeń, takich jak autyzm i schizofrenia. Po pierwsze, ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest możliwość identyfikacji mutacji de novo w powszechnych schorzeniach genetycznych. Po zidentyfikowaniu choroby, która odpowiada hipotezie mutacji de novo, stosuje się krytyczne kryteria wyboru przypadków pacjentów, w których przeszukiwane są mutacje de novo. Następnie, w ramach tej strategii, do identyfikacji takich mutacji wykorzystuje się sekwencjonowanie o wysokiej jakości i niskiej przepustowości lub sekwencjonowanie całego egzomu.Mutacje de novo w genie Shank 3 stwierdzono u osób cierpiących na schizofrenię. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat genetyki schizofrenii i autyzmu, może być ona również wykorzystana do badania innych powszechnych schorzeń, takich jak opóźnienie rozwoju psychoruchowego.Nie wszystkie choroby pasują do profilu choroby de novo. Przed przedstawieniem protokołu należy zatem omówić niezbędne kryteria, które choroba musi spełniać, aby mogła zostać uznana za chorobę wywołaną mutacją de novo. Pacjenci z taką chorobą wykazują obniżenie sprawności organizmu.Choroba ta występuje często w bardzo zróżnicowanych środowiskach. Czasami jest ona powiązana z wyższym wiekiem ojca. Klasyczne badania sprzężeń i analizy asocjacyjne nie wyjaśniają znacznej części dziedziczności tej choroby.I wreszcie, dane dotyczące zgodności u bliźniąt muszą wspierać model de novo. Następnie należy zastosować kryteria wyboru próbek z dużym prawdopodobieństwem wystąpienia mutacji de novo. Mutacja de novo koreluje z wczesnym wystąpieniem, ciężkimi fenotypami, brakiem objawów choroby u rodziców oraz starszym wiekiem ojców, którzy nie wykazują symptomów choroby.Dostępność DNA może ograniczać wybór próbek. O ile próbki nie są dostępne zarówno od pacjenta, jak i od rodziców pacjenta, nie można wykluczyć dziedziczenia. Ponadto, do walidacji zidentyfikowanego genu kandydata niezbędna jest dostępność dodatkowych kohort osób dotkniętych schorzeniem oraz osób zdrowych.Po zgromadzeniu wystarczająco dużej liczby próbek od kandydatów i grupy kontrolnej, należy przystąpić do analizy i wyboru najlepszych genów kandydackich w oparciu o system punktowy. Przykładowo, poniższy zestaw kryteriów może zostać wykorzystany do oceny genów związanych z chorobami neuropoznawczymi.Choroby neurologiczne, takie jak na przykład stwardnienie zanikowe boczne, wymagałyby zastosowania zupełnie innych kryteriów. Obejmują one dowody na zaangażowanie synaptyczne, dowody na lokalizację synaptyczną, dane dotyczące wzorców ekspresji w tkankach, modele zwierzęce, dane poznawcze, argumenty z analizy genetycznej oraz dowody na udział w procesie chorobowym. Po zastosowaniu tych kryteriów wiele genów można wykluczyć z badania na rzecz lepszych kandydatów.Po sekwencjonowaniu, w celu analizy genów kandydackich, zastosowano kombinację dwóch lub więcej narzędzi do analizy sekwencji, ponieważ zazwyczaj działają one w różny sposób. Na przykład wskaźnik fałszywie dodatnich mutacji dla SMP, obliczony za pomocą oprogramowania polys scan, jak pokazano na tym wykresie, jest wyższy niż wskaźnik obliczony przez oprogramowanie poly Fred. Polys scan wykazuje również niższy wskaźnik mutacji dla indeli niż poly Fred.W ostatnim kroku dla każdego nowego wariantu egzonowego należy wyeliminować artefakty techniczne poprzez weryfikację za pomocą PCR i ponownego sekwencjonowania. Należy przeanalizować region zainteresowania w DNA wyizolowanym z próbek krwi pacjenta oraz obojga rodziców; wykonanie tego kroku na DNA z krwi jest istotne, ponieważ niektóre mutacje mogą wynikać z artefaktów spowodowanych podziałami w hodowlanych liniach komórkowych limfoblastów. Skuteczną alternatywą dla sekwencjonowania wybranych genów kandydackich jest zastosowanie sekwencjonowania wysokoprzepustowego do odczytu regionów kodujących 16 000 genów.Obecnie w sprzedaży dostępne są zestawy do przygotowania próbek do sekwencjonowania całego egzomu oferowane przez różnych dostawców komercyjnych. Po otrzymaniu sekwencji do laboratorium, do wyboru pozostaje kilka narzędzi bioinformatycznych służących do wykrywania i genotypowania wariacji genomicznych. Przed priorytetyzacją mutacji w obrębie całego egzomu należy wybrać warianty z uszeregowanych genów kandydackich, zgodnie z wcześniejszymi wyjaśnieniami.W przypadku wszystkich wariantów każdy z nich powinien zostać spriorytyzowany zgodnie z dwoma kryteriami. Po pierwsze, wariant powinien być unikalny i nie występować ani u rodziców, ani w publicznych bazach danych s i p. Po drugie, warianty te powinny być przewidywane jako wpływające na funkcję genu zgodnie z ich lokalizacją w sekwencji, poprzez skrócenie lub zmianę.Powłoka. Programy takie jak PolyPhen, sift i Panther mogą służyć do sporządzania tych predykcji w celu zidentyfikowania innych mutacji sprawczych oraz upewnienia się, że zidentyfikowane mutacje nie występują u zdrowych osobników poprzez ponowne sekwencjonowanie całego genu w dodatkowych przypadkach pacjentów oraz w grupach kontrolnych. Każdy gen zawierający co najmniej jedną mutację de novo, którą przewiduje się, że jest szkodliwa, powinien zostać poddany dalszej walidacji. Potwierdzone warianty można scharakteryzować funkcjonalnie, przeprowadzając analizę mRNA i/lub białek na liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych niosących dane mutacje.Te analizy funkcjonalne można przeprowadzić na liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych, stosując wysokiej jakości niskoprzepustowe podejście do badania genu canida. U pacjentów z schizofrenią zidentyfikowano gen z dwiema różnymi mutacjami de novo. Jedna mutacja nonsensowna wystąpiła u trzech dotkniętych chorobą braci.W tej rodzinie mutacja spowodowała powstanie przedwczesnego sygnału terminacji w kodonie 117 genu SHANK3. W innej rodzinie u dotkniętej chorobą kobiety stwierdzono mutację typu missense w tym samym genie. Mutacja ta powoduje zamianę argininy na tryptofan, aminokwas o bardzo różnych właściwościach, w kodonie 536.Po obejrzeniu tego filmu i zastosowaniu opisanych metod powinni Państwo być w stanie ocenić interesującą Państwa chorobę, aby sprawdzić, czy mutacje Novo odgrywają w niej jakąkolwiek rolę.

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Strategia identyfikacji de novo mutacji w częstych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Ten manuskrypt przedstawia prostą, ale potężną metodę in vitro do oceny kurczliwości mięśni gładkich w odpowiedzi na środki farmakologiczne lub stymulację nerwów. Główne zastosowania to badania przesiewowe leków i zrozumienie fizjologii tkanek, farmakologii i patologii.

Kurczliwość paska mięśni gładkich pęcherza moczowego jako metoda oceny farmakologii dolnych dróg moczowych

Analiza obrazu siatkówki to dyskretna procedura wizualizacji mikrokrążenia. Wpływ czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych może powodować zmiany kalibrów naczyń siatkówki. Opisano procedury pozyskiwania obrazów dna oka oraz etapy obliczania kalibrów statków.

Fotografia dna oka jako wygodne narzędzie do badania odpowiedzi mikronaczyniowych na czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych w badaniach epidemiologicznych

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Poznaj strategię identyfikacji mutacji de novo w autyzmie i schizofrenii przy użyciu sekwencjonowania egzomu i narzędzi bioinformatycznych. Metoda ta pozwala odkryć nowe geny kandydujące, takie jak Shank3.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Przeglądaj więcej filmów