Name: Badanie integracji neuronów urodzonych w wieku dorosłym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę badania integracji neuronów urodzonych w wieku dorosłym w hipokampie myszy. Technika łączy wirusowe znakowanie zwrotne z elektrofizjologią patch-clamp, umożliwiając analizę dojrzewania i połączeń synaptycznych nowych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez NINDS oraz American Heart Association dla S.Ge. Metoda ta została pierwotnie opracowana i rozwinięta przez autora w laboratorium dr. Hongjuna Songa na Uniwersytecie Johns Hopkins. Pragniemy podziękować dr. Hongjunowi Songowi za jego wskazówki i wsparcie.

1. Iniekcja wirusa
Wysokimtrowe zmodyfikowane retrowirusy (1×109 unit/ml) otrzymuje się poprzez kotransfekcję wektorów retrowirusowych i VSVG do komórek HEK293T, a następnie poprzez ultrawirowanie supernatantu wirusowego. W kwestii źródeł i metod produkcji należy zapoznać się z doskonałą demonstracją JoVE (3).
Uwaga: Młode dorosłe (4-6 tygodniowe) samice myszy C57Bl/6 (Charles River) są utrzymywane w standardowych warunkach. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi National Research Council dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC Uniwersytetu Stony Brook.
<ol>
	<li>Rozmrozić na lodzie 2 µl zamrożonego retrowirusa na każde zwierzę.</li>
	<li>Zpodaj znieczulenie (100 μg ketamina + 10 μg ksylazyny na gram masy ciała) i unieruchom zwierzę w aparacie stereotaksycznym (Steolting). Usuń włosy z głowy i przemyj skórę 70% etanolem.</li>
	<li>odsłonić czaszkę i wywiercić cztery płytkie otwory za pomocą wiertarki stomatologicznej (wiertło 0,6 mm) w następujących współrzędnych:
		<ul>
 	<li>przednio-tylny = -2 mm od bregmy; boczny = ±1,6 mm; brzuszny = 2,5 mm; przednio-tylny = -3 mm od bregmy; boczny = ±2,6 mm; brzuszny = 3,2 mm.</li>
 <li>przednio-tylny = -2 mm od bregma; boczny = ±1,6 mm; brzuszny = 2,5 mm; przednio-tylny = -3 mm od bregma; boczny = ±2,6 mm; brzuszny = 3,2 mm.</li>
		</ul>
		</li>
	<li>Zamocuj 1μl strzykawka Hamiltona z płaskim końcem i aplikacja 0.5 μl retrowirusa na miejsce z szybkością 0.25 μl/min do zakrętu zębatego. (Głębokość brzuszna – patrz współrzędne powyżej). Po każdym wstrzyknięciu odczekać 2 minuty przed powolnym wycofaniem strzykawki, aby zapobiec cofaniu się płynu. Między wstrzyknięciami krótko przemyć zewnętrzną powierzchnię końcówki strzykawki sterylnym PBS za pomocą aplikatora, aby usunąć ślady krwi.</li>
		<li>Zamknąć ranę za pomocą sterylny materiał do szwów chirurgicznych (typ P-1; rozmiar 6-0) i należy umieścić zwierzę z powrotem w standardowych warunkach hodowlanych do czasu osiągnięcia pożądanych etapów czasowych po wstrzyknięciu.</li>
	</ol>
2. Przygotowanie skrawków
Aby uzyskać wysokiej jakości skrawki ostre od dorosłych myszy, stosujemy zmodyfikowany roztwór do cięcia w celu przygotowania skrawków (patrz poniżej).
<ol>
	<li>Schłodzić roztwór do cięcia do temperatury 0-4 °C na lodzie i napowietrzać mieszaniną 95% O2-5% CO2 przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Zanestetyzować zwierzę i przeprowadzić perfuzję transkardialną przy użyciu lodowatego, nasyconego tlenem roztworu do cięcia.</li>
	<li>Szybko wyjąć mózg i umieścić go w szalce Petriego z papierem filtrującym uprzednio zwilżonym zimnym, natlenionym roztworem do cięcia. Odciąć móżdżek i wyciąć powierzchnię montażową co najmniej 1mm przed (widocznymi) współrzędnymi miejsca iniekcji. Przykleić mózg do stolika wibrotomu i zamontować go w komorze do cięcia wypełnionej zimnym i natlenionym roztworem do cięcia.</li>
	<li>Przygotować skrawki w płaszczyźnie coronalnej lub horyzontalnej (300-350μm) i przenieść je pipetą o dużym prześwicie do komory inkubacyjnej zawierającej ACSF w temperaturze pokojowej, napowietrzany mieszaniną 95% O2/5% CO2.</li>
	<li>Inkubować skrawki przy ciągłym napowietrzaniu w temperaturze 32°C przez 30-60 minut. Na czas rejestracji przywrócić w komorze temperaturę pokojową.</li>
</ol>
3. Eksperymenty elektrofizjologiczne
<ol>
	<li>Próbki przekłada się do komory rejestracyjnej, która jest stale perfundowana nasyconym tlenem ACSF w temperaturze 32°C - 34°C.</li>
	<li>Bipolarną wolframową elektrodę stymulującą umieszcza się w warstwie molekularnej zakrętu zębatego, korzystając z obiektywu mikroskopu o niskim powiększeniu (10X).</li>
	<li>Nowo powstałe DGC w strefie podziarnistej/warstwie komórek ziarnistych identyfikuje się na podstawie ekspresji GFP lub dTomato. Rejestrację metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell przeprowadza się na nowo powstałych neuronach przy dużym powiększeniu (40X).</li>
	<li>Właściwości wyładowcze rejestrowanych komórek uzyskuje się poprzez wstrzykiwanie serii prądów w trybie current-clamp.</li>
	<li>Impulsy elektryczne są dostarczane przez elektrodę stymulującą za pomocą izolatora stymulacji sterowanego przez oprogramowanie rejestrujące, a następnie rejestruje się wywołane prądy postsynaptyczne w nowo powstałych DGC.</li>
</ol>
4. Analiza danych
Amplitudy wywołanych odpowiedzi postsynaptycznych analizuje się na różnych etapach rozwoju neuronów powstałych w wieku dorosłym.
5. Reprezentatywne wyniki
Stosując powyższy protokół, powszechnie uzyskuje się ekspresję GFP w nowo powstałych neuronach zakrętu zębatego, podobną do tej przedstawionej na Rysunku 1. Należy zauważyć, że nowo powstałe neurony są łatwo wizualizowane, a zarówno dendryty, jak i aksony są wyraźnie oznakowane. Ekspresja w cienkich aksonach GDC i małych kolcach dendrytycznych zależy od jakości i miana wirusa, zastosowanego promotora oraz czasu ekspresji in vivo. W naszych badaniach nowo powstałe komórki i organella subkomórkowe są zazwyczaj widoczne w ciągu kilku dni po wtryśnięciu, a ekspresję w kolcach można śledzić od najwcześniejszych etapów rozwoju. Rejestracje whole-cell z nowo powstałych neuronów na różnych etapach czasowych umożliwiają badanie unikalnych właściwości tych komórek, np. potencjałów czynnościowych (Rysunek 2a), a także procesu integracji synaptycznej z istniejącymi obwodami neuronalnymi podczas dojrzewania (Rysunek 2b).
<img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej neuronów ziarnistych w warstwie molekularnej zakrętu zębatego hipokampa szczura." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1 Obraz konfokalny dwufotonowy noworodkowych neuronów w poziomym przekroju zakrętu zębatego dorosłej myszy. Zielone komórki to noworodkowe DGCs w 21dpi (dni po wtryskaniu), wykazujące ekspresję GFP, znakowane retrowirusem pUX-GFP.
<img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Wykres elektrofizjologiczny; kształty fal sygnałów neuronalnych; pomiar czasowy; dane elektrofizjologiczne." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2 a) Właściwości generowania potencjałów czynnościowych w noworodkowym DGC w 21 dpi. b) reprezentatywne wywołane pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) zarejestrowane w noworodkowym DGC w 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Ciągła neurogeneza w hipokampie mózgów dorosłych ssaków stanowi unikalny eksperymentalny model badawczy do analizy rozwoju i integracji neuronów w dojrzałym mózgu. Przedstawiony tutaj protokół łączy znakowanie retrowirusowe z metodami elektrofizjologicznymi w celu zbadania integracji nowo powstałych neuronów ziarnistych zakrętu zębatego w mózgach dorosłych myszy.
Aby zapewnić sukces przeprowadzanych eksperymentów, zalecamy stosowanie się do poniższych wskazówek podczas krytycznych etapów procedury:
Aby uniknąć niepożądanych infekcji i stanów zapalnych, wszystkie narzędzia należy wysterylizować (poprzez autoklawowanie, użycie dowolnego rodzaju sterylizatora lub 70% etanolu) przed operacją. Przed wstrzyknięciem należy przemyć końcówkę igły strzykawki sterylnym PBS.
W przypadku iniekcji wirusa zwierzęta muszą być stabilnie zamocowane w urządzeniu stereotaksycznym, a źródła niepotrzebnych ruchów podczas wstrzykiwania należy zminimalizować. Należy upewnić się, że głowa jest dobrze i stabilnie unieruchomiona, oraz wyregulować pozycję nosa myszy tak, aby bregma i lambda znajdowały się na jednym poziomie przed obliczeniem współrzędnych iniekcji. Wirus należy pobrać do strzykawki szybko, aby zminimalizować ekspozycję na temperaturę pokojową – retrowirusy są szczególnie wrażliwe na temperaturę. Wirus należy wstrzykiwać powoli z zalecaną prędkością, aby zminimalizować uszkodzenia ciśnieniowe. Zastosowanie zalecanej strzykawki z płaską końcówką (w przeciwieństwie do powszechnych końcówek ściętych)&nbsp;zapewni równomiernie rozłożony obszar infekcji zakrętu zębatego.
Przed przygotowaniem skrawków, roztwór do cięcia oraz inkubujący ACSF muszą być napowietrzane mieszaniną 95% O2-5% CO2 przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić nasycenie roztworów tlenem. Aby uzyskać najlepszą jakość skrawków, zwierzęta powinny zostać poddane szybkiej perfuzji, a tkanka powinna być utrzymywana w zimnym, nasyconym tlenem roztworze.
W celu rejestracji stopniowo zwiększaj intensywność bodźca, aż do pojawienia się odpowiedzi postsynaptycznej. W razie potrzeby zmień położenie elektrody stymulującej w obrębie warstwy molekularnej zakrętu zębatego.
Podsumowując, zalecane podejście umożliwia badanie odrębnych właściwości i potencjalnych ról funkcjonalnych neuronów powstałych w życiu dorosłym podczas ich wczesnej integracji z aktywnymi, dojrzałymi obwodami neuronalnymi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Roztwór do cięcia (w mM): 110 chlorku choliny, 2,5 KCl, 1,3 KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25,0 NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0,5 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 7 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 dekstrozy, 1,3 askorbianu sodu, 0,6 pirogronianu sodu, 5,0 kwasu kynurenowego.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, w mM): 125,0 NaCl, 25,0 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2,5 KCl, 2 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,3 KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,3 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,3 askorbianu sodu, 0,6 pirogronianu sodu, 10 dekstrozy. &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Roztwór wewnętrzny do techniki patch-clamp w konfiguracji whole-cell (w mM): 120 gluconianu potasu, 15 KCl, 4 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0,1 EGTA, 10,0 HEPES, 4 MgATP, 0,3 Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP, 7 fosfokreatyny (pH 7,4, 300 mOsm).&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

badanie integracji neuronów powstałych w wieku dorosłym

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogeneza zachodzi w mózgach dorosłych ssaków w strefie podkomorowej (SVZ) komory bocznej oraz w strefie podziarnistej (SGZ) zakrętu zębatego hipokampa przez całe życie. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że neurogeneza hipokampa u dorosłych jest powiązana z różnymi zaburzeniami mózgu, w tym z epilepsją, schizofrenią, depresją i lękiem (1). Zrozumienie procesu prawidłowej i aberracyjnej integracji neuronów powstałych w dorosłości może rzucić światło na etiologię tych chorób i pomóc w opracowaniu nowych terapii.
Neurogeneza w SGZ u dorosłych odzwierciedla embrionalny i ponatalny rozwój neuronów, obejmując etapy specyfikacji losu, migracji, integracji synaptycznej i dojrzewania. Jednak pełna integracja następuje w przedłużonym, 6-tygodniowym okresie. Początkowe wejście synaptyczne do nowo powstałych w dorosłości komórek ziarnistych zakrętu zębatego (DGCs) w SGZ ma charakter GABAergiczny, po czym w 14. dniu pojawia się wejście glutaminergiczne (2). Specyficzne czynniki regulujące tworzenie obwodów neuronów powstałych w okresie dorosłym w zakręcie zębatym są obecnie nieznane.
W naszym laboratorium stosujemy deficyjny w replikację wektor retrowirusowy oparty na wirusie białaczki mysiej Moloney do dostarczania białek fluorescencyjnych i hipotetycznych genów regulacyjnych do tych proliferujących komórek. Ta technika wirusowa zapewnia wysoką swoistość i rozdzielczość w analizie daty powstania komórek, ich linii, morfologii oraz synaptogenezy.
W typowym eksperymencie często wykorzystuje się dwa lub trzy wirusy zawierające unikalne znaczniki, transgeny i elementy promotorowe do analizy pojedynczych komórek w określonym procesie rozwojowym in vivo. Poniższy protokół opisuje metodę analizy funkcjonalnej integracji noworodkowych neuronów z wykorzystaniem pojedynczego retrowirusa z zielonym (GFP) lub czerwonym (dTomato) białkiem fluorescencyjnym oraz elektrofizjologii techniki patch-clamp.

Opisano metodę badania integracji nowo powstałych komórek ziarnistych zakrętu zębatego u dorosłych zwierząt. Technika ta wykorzystuje zmodyfikowanego retrowirusa do znakowania nowych neuronów, a następnie rejestrację elektrofizjologiczną w celu określenia funkcjonalnej integracji in vivo.

Badanie integracji neuronów powstałych w wieku dorosłym

Neurogeneza zachodzi w mózgach dorosłych ssaków w strefie podkomorowej (SVZ) komory bocznej oraz w strefie podziarnistej (SGZ) ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie metody badania integracji funkcjonalnej granulatowych komórek zębatych powstałych w wieku dorosłym. Jest to realizowane najpierw poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie retrowirusa do zakrętu zębatego dorosłych myszy w celu oznakowania nowo powstałych granulatowych komórek zębatych. Drugim krokiem procedury jest perfuzja myszy w określonych etapach czasowych zimnym roztworem do krojenia oraz wyjęcie mózgu.Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie ostrych przekrojów mózgu za pomocą vibratomu. Czwartym krokiem procedury jest wykonanie rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole cell na nowo powstałych komórkach ziarnistych zakrętu zębatego oraz stymulacja warstwy molekularnej ostrych przekrojów mózgu. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące funkcjonalną integrację synaptyczną nowo powstałych neuronów poprzez rejestrację i analizę wywołanych prądów postsynaptycznych w nowo powstałych neuronach ziarnistych zakrętu zębatego.Głównymi zaletami tej techniki są retroviralne znakowanie nowo powstałych neuronów w mózgu dorosłego osobnika oraz przygotowanie świeżych skrawków mózgu zwierząt dorosłych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurogenezy u dorosłych, takie jak funkcjonalna utrata nowo powstałych neuronów w mózgu dorosłym. Przygotuj się do iniekcji wirusa, wyjmując z zamrażarki retrowirus zawierający zielone białko fluorescencyjne GFP lub czerwone białko fluorescencyjne D tomato i rozmrażając go na lodzie.Dwa mikrolitry retrowirusa na zwierzę; znieczulić czterotygodniową do sześciotygodniowej samicę myszy. Sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie łapy, umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym, ogolić włosy na głowie i przetrzeć skórę 70%etanolem. Za pomocą skalpela naciąć skórę i odsłonić czaszkę.Skoryguj pozycję nosa myszy tak, aby punkt bgma i lambda znajdowały się w tej samej płaszczyźnie poziomej, używając wiertarki stomatologicznej z wiertłem 0,6 mm. Wywierć cztery otwory w czaszce w pokazanych tutaj współrzędnych. Szybko napełnij strzykawkę Hamiltona z płaską końcówką o pojemności 1 µL rozmrożonym retrowirusem.Umieść strzykawkę nad jednym z otworów wykonanych w punkcie minus 2 mm bgma, aby wstrzyknąć retrowirusa do zakrętu zębatego. Obniż strzykawkę do głębokości pionowej 2,5 mm. Wstrzyknij 0,5 µl retrowirusa z prędkością 0,25 µl na minutę, aby zapobiec cofaniu się płynu.Po każdym wstrzyknięciu odczekaj dwie minuty przed powolnym wycofaniem strzykawki. Krótko przemyj zewnętrzną powierzchnię końcówki strzykawki sterylnym PBS za pomocą aplikatora, aby usunąć ślady krwi. Postępuj w ten sam sposób, aby wstrzyknąć 0,5 µL retrowirusa w trzy pozostałe miejsca na głębokościach brzusznych wynoszących odpowiednio 2,5 lub 3,2 mm.Zamknąć ranę za pomocą sterylnego materiału do szwów chirurgicznych i umieścić zwierzę z powrotem w klatce, aż nowo powstałe neurony osiągną pożądaną datę dojrzałości. Po upływie 21 dni przygotować się do krojenia mózgu myszy, sporządzając niezbędne roztwory. Schłodzić roztwór do cięcia na lodzie w temperaturze od 0 do 4 °C i napowietrzyć go mieszaniną 95% oxygen, 5% carbon dioxide przez co najmniej 30 minut.Umieść sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (A CSF) w temperaturze pokojowej i napowietrzaj go mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 30 minut. Po 30 minutach chłodzenia na lodzie przygotuj nasycony tlenem roztwór tnący do perfuzji serca. Po znieczuleniu myszy przeprowadź perfuzję serca.Następnie szybko wyjmij mózg i umieść go w szalce Petri zawierającej roztwór do cięcia oraz kawałek papieru filtrowanego. Odetnij móżdżek, a następnie wykonaj cięcie wieńcowe jeden do dwóch milimetrów przed miejscami iniekcji, aby uzyskać płaską powierzchnię. Do montażu super.Przyklej mózg do platformy Vibram. Zamontuj platformę w komorze tnącej urządzenia Vibram wypełnionej natlenionym roztworem do cięcia. Obniż ostrze i ustaw okno cięcia w urządzeniu Vibram.Rozpocznij krojenie tkanki. Każdy plaster przekrój na pół wzdłuż linii środkowej. Za pomocą pipety o dużym otworze przenieś plastry do komory inkubacyjnej w temperaturze pokojowej.Temperatura A CSF napowietrzany 95%tlenem i 5%dwutlenkiem węgla. Kontynuuj krojenie, aż pojawi się przedni koniec hipokampa. Inkubuj skrawki w kąpieli wodnej o temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, stale napowietrzając roztwór.Przywróć temperaturę komory inkubacyjnej do temperatury krawędziowej na czas rejestracji. Skrawki są teraz gotowe do rejestracji. Rozpocznij od perfuzji komory rejestracyjnej nasyconym tlenem A CSF o temperaturze 32 do 34 °C z prędkością około 2 ml/min.Użyj dużej pipety z szklanego borokrzemianu, aby przenieść skrawka do komory rejestracyjnej. Przy małym powiększeniu umieść na wierzchu skrawka drut platynowy w kształcie litery U z nylonowymi sznurkami, aby go przytrzymać. Zidentyfikuj warstwę molekularną zakrętu zębatego.Następnie opuść elektrodę stymulującą do warstwy molekularnej zakrętu zębatego. Przy dużym powiększeniu zidentyfikuj nowo powstałe komórki ziarniste zakrętu zębatego w strefie podziarnistej lub warstwie ziarnistej na podstawie ekspresji zielonego lub czerwonego białka fluorescencyjnego.Zlokalizuj nowo powstałe neurony wykazujące ekspresję GFP lub D tomato, przełączając się między filtrem DIC a filtrami fluorescencyjnymi. Wybierz komórkę o stosunkowo silnej fluorescencji i zdrowym ciele komórki do rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Wprowadź szklaną mikropipetę o oporności końcówki od 3 do 6 MΩ, wypełnioną odpowiednim roztworem wewnętrznym, do uchwytu mikropipety na głowicy wzmacniacza, korzystając z obiektywu o dużym powiększeniu mikroskopu.Za pomocą mikromanipulatora opuść mikropipetę do wybranego ziarnistego neuronu komórki zębatej i utwórz patch całokomórkowy. W trybie clamp prądowy (current clamp) wstrzyknij serię prądów i zarejestruj właściwości wyładowania nowo powstałego neuronu. Za pomocą elektrody stymulującej podaj pojedynczy impuls lub parę impulsów elektrycznych, a następnie zarejestruj wywołane prądy postsynaptyczne.Jeśli nie wystąpi odpowiedź postsynaptyczna, należy przenieść elektrodę stymulującą w inne miejsce w warstwie molekularnej i spróbować zarejestrować prądy postsynaptyczne wywołane w nowej lokalizacji stymulacji. Po zakończeniu eksperymentu należy użyć programu Clampfit do pomiaru amplitudy wywołanych odpowiedzi postsynaptycznych w nowo powstałych neuronach. Na tej rycinie przedstawiono ekspresję GFP w nowo powstałych neuronach w zakręcie zębatym dorosłej myszy 21 dni po wstrzyknięciu retrowirusa GFP.Należy zauważyć, że nowo powstałe neurony są łatwo widoczne, a zarówno dendryty, jak i aksony są wyraźnie oznakowane. Dendryty to wypustki rozciągające się z somy do warstwy molekularnej zakrętu zębatego, natomiast aksony są również widoczne w hilos oraz obszarze CA3. Rysunek ten przedstawia rejestrację prądów metodą clamp w całej komórce (whole cell current clamp) nowo powstałej komórki ziarnistej zakrętu zębatego 21 dni po wstrzyknięciu retrowirusa P-U-X-G-F-P u dorosłej myszy.Górny ślad przedstawia potencjały czynnościowe wywołane wstrzykiwaniem prądu. Rysunek ten pokazuje prądy postsynaptyczne wywołane w noworodkowej komórce ziarnistej zakrętu zębatego 21 dni po wstrzyknięciu wirusa. Poprzez stymulację w warstwie molekularnej.Wystąpienie odpowiedzi postsynaptycznej dowodzi, że nowo powstały neuron zintegrował się już z istniejącymi obwodami neuronalnymi i po swoim rozwoju otrzymuje sygnały synaptyczne z ENT różnego pochodzenia. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neurogenezy dorosłych do zgłębiania funkcjonalnej integracji nowo powstałych neuronów w mózgu dorosłego.

studying-the-integration-of-adult-born-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie integracji neuronów urodzonych u dorosłych

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Opisano metody manipulacji i analizy neurogenezy hipokampa zależnej od NF-κB u dorosłych. Przedstawiono szczegółowy protokół testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (określanego jako separacja wzorca przestrzennego - labirynt Barnesa) w celu zbadania wyników poznawczych u myszy. Technika ta powinna również pomóc w umożliwieniu badań w innych warunkach eksperymentalnych.

Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Poznaj metodę badania integracji neuronów urodzonych w wieku dorosłym w hipokampie myszy. Technika łączy wirusowe znakowanie zwrotne z elektrofizjologią patch-clamp, umożliwiając analizę dojrzewania i połączeń synaptycznych nowych komórek.

Badanie integracji neuronów powstałych w wieku dorosłym

Przeglądaj więcej filmów