Name: Izolacja mysich wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Naucz się izolować wyspy trzustkowe myszy metodą kolagenazy i gradientu Ficolla. Technika ta umożliwia przygotowanie wysp do transplantacji w badaniach nad cukrzycą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowanie kolagenazy
<ol>
<li>Odważyć kolagenazę do probówki stożkowej 50 ml i dodać bufor do izolacji, aby uzyskać stężenie końcowe wskazane w poniższej tabeli. Rozpuścić kolagenazę za pomocą vortexowania. (12 myszy + 2 dodatkowe myszy = 14 myszy x 5 ml/mysz = 70 ml całkowitej objętości roztworu kolagenazy) 
(70 ml x 0,5 mg/ml lub 0,3 mg/ml = 35 mg lub 21 mg całkowitej masy kolagenazy P) 
<table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%">
<tbody >
<tr>
<th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">Szczep</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">Wiek</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">Kolagenaza P (mg/ml)</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">Czas (min)</th>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">C3H, Balb/C, B6</td>
<td style="font-size: 12px">&gt; 12 tygodni</td>
<td style="font-size: 12px">0,8</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">C3H, Balb/C, B6</td>
<td style="font-size: 12px">&lt;= 12 tygodni</td>
<td style="font-size: 12px">0,5</td>
<td style="font-size: 12px">13</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">NOD, NOR, NON</td>
<td style="font-size: 12px">&gt; 12 tygodni</td>
<td style="font-size: 12px">0,8</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
<tr>
<td style="font-size: 12px">NOD, NOR, NON</td>
<td style="font-size: 12px">&lt;= 12 tygodni</td>
<td style="font-size: 12px">0,5</td>
<td style="font-size: 12px">17</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>Rozlać po 2 ml roztworu kolagenazy do każdej szklanej fiolki i umieścić na lodzie. Napełnić każdą strzykawkę 5 ml ilością 3 ml kolagenazy, założyć igłę 30g i umieścić na lodzie (przygotować w komorze z laminarnym przepływem powietrza).</li>
</ol>
Rozciąganie
<ol>
<li>Bezpośrednio przed sekcją uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Spryskaj całe ciało 70% ETOH, aby było całkowicie mokre. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od okolic narządów płciowych. Obróć mysz tak, aby ogon był skierowany w stronę przeciwną do badacza.</li>
<li>Przesuń jelita na lewą stronę otwartego ciała myszy. Ujawni to trzustkę i wspólny przewód żółciowy.</li>
<li>Załóż kleszczyk hemostatyczny po obu stronach jelita cienkiego w miejscu ujścia przewodu żółciowego, pozostawiając niewielką przestrzeń, przez którą roztwór kolagenazy może przedostać się do jelita.</li>
<li>Wprowadź roztwór kolagenazy do trzustki poprzez przewód żółciowy, zaczynając od pęcherzyka żółciowego, używając igły 30g i strzykawki 5 ml zawierającej 3 ml zimnego roztworu kolagenazy.</li>
<li>Wyjmij trzustkę z organizmu i umieść ją w silikonizowanej probówce zawierającej 2 ml roztworu kolagenazy. Krok ten należy wykonać SZYBKO i jak najdokładniej, minimalizując zebranie tkanki tłuszczowej i łącznej.</li>
<li>Umieść probówkę w lodzie i powtórz krok 3 z kolejną myszą.</li>
</ol>
Trawienie
<ol>
<li>Szczelnie zamknąć każdą fiolkę i umieścić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Inkubować przez 13-17 minut (czas zależy od szczepu i wieku zwierzęcia).</li>
<li>Po upływie tego czasu energicznie wstrząsnąć fiolką. Trzustka powinna się rozpaść.</li>
<li>Przelać każdy digest przez duże sterylne sito do sterylnego zlewka o pojemności 1000 ml i energicznie wypłukać zawartość sita za pomocą buforu piorącego. Przenieść digesty do stożkowych probówek 50 ml (3 trzustki/probówka 50 ml: jeśli n=12, użyć wystarczającej ilości buforu piorącego, aby objętość końcowa wyniosła 200 ml, i rozdzielić ją do 4 probówek 50 ml). Rozcieńczanie należy przeprowadzić szybko i na lodzie, aby uniknąć niepożądanego trawienia wysepek.</li>
<li>Wirowanie: Uruchomić wirówkę. Po osiągnięciu prędkości 1300 rpm wyłączyć urządzenie.</li>
<li>Odssać nadosad, pozostawiając ok. 5 mL. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie odessać osadu.</li>
<li>Resuspendować osad, energicznie opukując probówkę ręką, a następnie dodać 50 ml buforu piorącego.</li>
<li>Wirowanie: Uruchomić wirówkę. Po osiągnięciu prędkości 1300 rpm wyłączyć urządzenie.</li>
<li>Resuspendować osad i przemyć 5 ml buforu piorącego.</li>
<li>Przenieść 5 ml do probówki stożkowej 15 ml i odwirować, jak opisano powyżej.</li>
<li>Odssać nadosad tak całkowicie, jak to możliwe. (Pozostały bufor może spowodować zmianę gęstości Ficollu).</li>
</ol>
Ficoll
Należy działać szybko. Długotrwała ekspozycja na Ficoll jest TOKSYCZNA dla wysepek.
<ol>
<li>Przed dodaniem ficollu należy upewnić się, że osad jest całkowicie rozbity (tkanki nieobalne są trudne do resuspensji w ficollu).</li>
<li>Resuspendować osad w 7 ml ficollu o gęstości 1.108, intensywnie mieszając w wortexie.</li>
<li>Na wierzch każdej warstwy ficollu nanieść warstwowo po 2 ml pozostałych gęstości w następującej kolejności: 1.096, 1.069, a następnie 1.037.</li>
<li>Wirować przez 15 minut przy 1800 rpm w temperaturze 4 stopni, z WYŁĄCZONĄ funkcją hamowania!</li>
<li>Wyłowić wyspki z drugiej warstwy za pomocą spoidu (sterylnej plastikowej pipety kroplowej). Przenieść wszystkie zebrane próbki do probówki stożkowej 50 ml zawierającej ok. 25 mL zimnego buforu.</li>
<li>Przemyć, jak opisano powyżej, 3 razy buforem do przemywania (powtarzając kroki 12-15).</li>
<li>Resuspendować wyspki w 20 ml RPMI-1640 (zawierającego 10% FCS, penicylinę i streptomycynę, HEPES oraz MEM-NEAA) i delikatnie wymieszać. Odlać 100 ul próbki do zliczenia.</li>
<li>Przenieść 100 ul na płytkę z siatką (Grid-plate) 35 mm zawierającą 1 ml pożywki i 1 ml ditiizonu.</li>
<li>Inkubować pozostałe wyspki w pożywce RPMI 1640 w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7% CO2, w płytkach 160 mm z całkowitą objętością 30 ml pożywki na płytkę. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Schemat wirowania w gradiencie gęstości, proces oddzielania warstw wyspek, oznaczenia 1.037-1.108." width="220" height="194" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"></li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dityzon</td><td>odczynnik</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 5mg dityzonu w 5 ml DMSO w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 45 ml soli fizjologicznej i delikatnie wymieszać. Przefiltrować za pomocą strzykawki 60 cc i filtra strzykawkowego 0,22 &quot;m do nowej probówki 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 OC do momentu użycia. W razie potrzeby dodać 1 ml do każdej 35 mm płytki z siatką do liczenia.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do izolacji</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>HBSS zawierający 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glukozy, pH 7,4</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>bufor do izolacji zawierający 1mM CaCl2</td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td></td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>1213873</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td></td><td></td><td></td><td>Kleszczyki hemostatyczne (n=2), pęsety (n=2), nożyczki (do nacięcia skóry i wyjęcia trzustki z sąsiednich tkanek)</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td></td><td></td><td></td><td>sterylna, 5ml, 1/mysz</td></tr><tr><td>Igły 30 G</td><td></td><td></td><td></td><td>sterylne, 1/strzykawka</td></tr><tr><td>Sylikonyzowane fiolki szklane z zakrętką teflonową</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>213-018-54</td><td>sterylne, 1/mysz</td></tr><tr><td>Duże sitko zlewozmywakowe</td><td></td><td></td><td></td><td>sterylne</td></tr><tr><td>Zlewka 1000 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>sterylna</td></tr><tr><td>Kompresy z gazy</td><td></td><td></td><td></td><td>4x4, 2/mysz</td></tr><tr><td>Plastikowa zakraplaczka</td><td></td><td></td><td></td><td>sterylna</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>zwierzę</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wysepek trzustkowych myszy

Murine Pancreatic Islet Isolation

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Witam, nazywam się Greg Zott. Pracuję w Laboratorium Bluestone w Centrum Cukrzycy UCSF i dzisiaj zaprezentuję proces izolacji wysepek trzustkowych myszy. Procedura obejmuje wstrzyknięcie roztworu kolagenazy do trzustki myszy dawcy szczepu C3 H, a następnie usunięcie trzustki, jej trawienie, oczyszczenie wysepek na gradiencie w probówce oraz ich ręczny dobór w celu końcowego przeszczepienia do torebki nerki cukrzycowej myszy NOD, która będzie naszym biorcą.Przed rozpoczęciem tej procedury rozcieńczyliśmy roztwór ATE w zmodyfikowanym buforze Hanksa i dostosowaliśmy stężenie specjalnie do linii myszy C3 H, której używamy. Ustaliliśmy, że trawienie przebiega lepiej przy zastosowaniu roztworu kolagenazy o stężeniu 0,8 mg/mL, którego użyjemy do wstrzyknięcia do wspólnego przewodu żółciowego w celu rozszerzenia trzustki. Procedurę przeprowadzi dziś Pavo Codre z centrum diabetologii. Wykona on nacięcie, otworzy mysz, odsłoni jelita, a następnie wstrzyknie preparat do wspólnego przewodu żółciowego.Myszy spryskamy etanolem, aby wygładzić futro, a następnie za pomocą uciśnięcia palca u nogi zweryfikujemy, czy zwierzę zostało prawidłowo uśmiercone. Pavo otworzy teraz jamę brzuszną myszy, wykon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja wysp trzustkowych u myszy

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Naucz się izolować wyspy trzustkowe myszy metodą kolagenazy i gradientu Ficolla. Technika ta umożliwia przygotowanie wysp do transplantacji w badaniach nad cukrzycą.

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Przeglądaj więcej filmów