Izolacja mysich wysp trzustkowych

Cześć, nazywam się Greg Zott. Jestem w Centrum Diabetologicznym UCSF w Laboratorium Bluestone, a dzisiaj pokażę Wam proces izolowania oczek myszy. Procedura polega na wstrzyknięciu roztworu kolagenazy do trzustki myszy dawcy C3 H, gdzie następnie usuniemy tę trzustkę, strawimy ją, oczyścimy oczka na gradiacji fial, a następnie ręcznie pobierzemy je do ostatecznego przeszczepu do torebki nerkowej myszy NOD z cukrzycą, która będzie naszym biorcą.

Zanim rozpoczniemy tę procedurę, rozcieńczyliśmy nasz roztwór ATE w zmodyfikowanym buforze Hanksa i dostosowaliśmy stężenie specyficzne dla szczepu myszy, którego używamy C3 H. Odkryliśmy, że trawi się lepiej przy roztworze kolagenazy 0,8 mg na promil, a my użyjemy go do wstrzyknięcia do wspólnego przewodu żółciowego w celu rozciągnięcia trzustki. Wykonywania. Dzisiejsza procedura będzie Pavo codre z centrum diabetologicznego. Wstrzyknie, otworzy mysz, odsłoni jelita, a następnie wstrzyknie do wspólnego przewodu żółciowego.

Spryskamy mysz etanolem, aby utrzymać włosy w dół, a następnie sprawdzimy, czy mysz została prawidłowo poświęcona za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Pavo otworzy teraz mysz i odsłoni jelito i trzustkę z nacięciem w linii środkowej. Przysłona zostanie również przecięta, aby sprawdzić, czy mysz zostanie poświęcona.

Zanim zaczniemy, chciałbym zwrócić uwagę na kilka ważnych struktur. Żołądek leży właśnie tutaj, z trzustką przyczepioną pod spodem do dwunastnicy i powyżej. To jest wątroba, w której znajduje się pęcherzyk żółciowy i wspólny przewód żółciowy, który możecie zobaczyć tutaj.

To, co Pavo zrobi dalej, to wyizoluje jelito cienkie, znajdzie miejsce, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do jelita cienkiego. Po odsłonięciu jelita zaciskamy po obu stronach wspólnego przewodu żółciowego za pomocą zacisków na komary. Odkryliśmy, że pozwala to na przedostanie się większej ilości kolagenów do trzustki, podczas gdy inne grupy próbują skierować zacisk na wspólny przewód żółciowy.

Okazuje się, że jest to lepsza technika pozwalająca enzymowi dostać się do trzustki. Jest to delikatna procedura. Nie chcesz rozdzierać jelit.

Chcesz, aby zaciski delikatnie leżały po obu stronach wspólnego przewodu żółciowego. Teraz znajdziemy woreczek żółciowy, a gdy pęcherzyk żółciowy zostanie odsłonięty, użyjemy go jako przewodnika do wstrzykiwania kolagenazy do wspólnego przewodu żółciowego. Powell używa igły o rozmiarze 30 G ze strzykawką o pojemności 5 cm3 zawierającą trzy młynki roztworu kolagenazy.

Kiedy wchodzi do wspólnego przewodu żółciowego, rozszerza ten przewód roztworem kolagenazy, a następnie przemieszcza się w dół wspólnego przewodu żółciowego, aż dotrze w pobliże jelita. A kiedy schodzi w dół, roztwory enzymów są pompowane do wstrzykiwania do trzustki. Teraz, gdy trzustka jest napompowana roztworem kolagenazy, Powell zamierza usunąć hemostatyki, a następnie usunąć trzustkę z myszy, ostrożnie odrywając ją od jelita.

Usuwa go z żołądka. Okej, a potem, używając śledziony jako uchwytu, podnosi trzustkę, a następnie powoli odcina ją w wspólnym przewodzie żółciowym i to wszystko. Trzustka jest układana, a następnie śledziona jest usuwana, a tam usuwa się mezotkankę jelitową, a następnie trzustkę umieszcza się w dwumłynowym roztworze kolagenazy i wysterylizowanej szklanej fiolce i umieszcza z powrotem na lodzie.

Wyizolowana trzustka, którą umieścimy w szklanych fiolkach, zostanie teraz umieszczona w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni na około 17 minut. Umieściliśmy je w stożkowym stojaku o grubości 50 mil, aby nie unosiły się do góry. Raz podczas kąpieli uruchamia się minutnik i rozpoczyna się trawienie.

Po upływie czasu trawienia fiolki wyjmuje się z nich, a następnie wstrząsa się nimi i delikatnie je przerywa. A gdy tkanka zacznie się rozpadać, fiolkę umieszcza się na lodzie. Sterylne sito umieszcza się nad zlewką o grubości 400 mil, która zawiera bufor myjący.

Trawienie trzustki jest następnie ostrożnie przelewane przez sito do buforu płuczącego. W celach demonstracyjnych okap został wyłączony, a szyba okapu została podniesiona, abyśmy mogli zobaczyć, co robimy. Po przelaniu trawienia trzustki do zlewki, fiolki przepłukuje się tym samym buforem do płukania, a bufor do płukania umieszcza się na sicie.

Posiadamy strzykawkę wypełnioną buforem do mycia. Użyjemy tego, aby na siłę przemyć chusteczkę przez ekran. Chodzi o to, aby uwolnić wszelkie luźne oczka, które nie są przyczepione do matrycy, ale pozostawiają błony i niestrawioną tkankę na ekranie.

A kiedy skończysz myć chusteczkę, to jest to, co zwykle widzisz pod koniec zabiegu. Tkanka trzustki, która znajduje się na dnie rurki, zostanie teraz przeniesiona do dwóch stożkowych o grubości 50 mil, a tkanka zostanie umyta, tkanka zostanie równomiernie wymieszana, a następnie równomiernie rozprowadzona, tak aby w każdej probówce znajdowała się równa objętość osadu. Zlewkę przepłukuje się teraz większą ilością buforu do mycia.

Boki są płukane, aby cała tkanka, która została ponownie wezwana do zlewki, została ponownie wezwana. Następnie jest równo rozdzielany między każde dwa, oba po 50 mil. Stożkowe następnie są uzupełniane buforem do płukania.

Tkanka jest kilkakrotnie odwracana, a następnie umieszczana w wirówce. To jest szybki obrót. Wirówkę pozwala się osiągnąć tysiąc obr./min, a następnie jest wyłączana.

Tkanka w tym czasie jest bardzo S, oczka są bardzo wrażliwe i nie chcesz ich nadmiernie zagęścić. Rurki są usuwane i wykonamy ten krok prania jeszcze trzy razy. To już koniec trzeciego prania.

Składniki stożkowej probówki o grubości 50 mil są przenoszone do stożkowej probówki o średnicy 15 mil i wirowane przez tysiąc RP M, a następnie zatrzymywane. Supernat zostanie usunięty i rozpocznie się pierwsza część FI Call . Jesteśmy na etapie, w którym mamy nasze granulowane trawienie trzustki.

Ponownie zawiesimy tę chusteczkę, aby była przyjemna i luźna do granulek. Dodamy pierwszy gradient gęstości, który wynosi 1 1 0 8. Dodamy pięć milsów do każdej tuby.

Granulat jest następnie dokładnie mieszany w każdym z gradientów. Ważne jest, aby uzyskać dobry rozkład tkanek w najcięższym nachyleniu. Teraz nałożymy dwie warstwy o gęstości 1 0 9 6.

Następnie nałożymy na to dwie warstwy o gęstości 1 0 6 9, a następnie na tę gęstość 1 0 3 7. Ważne jest, aby podczas nakładania warstw gęstości nie mieszać. Następnie wszystkie warstwy zostały dodane do tuby.

I jak widzicie, to jest szczyt 1 1 0 8, szczyt 9 1 0 9 6, szczyt 1 0 6 9 i szczyt 1 0 3 7. Można było zauważyć, że tkanka zaczyna już poruszać się do swojej właściwej gęstości, nawet bez zrostu centri. Gradienty fial są rozpędzane do prędkości 1800 obr./min przez 15 minut i pamiętaj, aby po wyjęciu probówek z wirówki wyłączyć hamulec.

Między warstwą 0 0 0 9 6 i 0 0 7 widać ładny pas tkanki ocznej Pabla. Teraz usuń warstwę 0, 3, 7, aby usunąć wszelkie resztki tkanek i DNA, które mogły zostać uwolnione podczas przetwarzania. Używając sterylnej plastikowej pipety pastwiskowej, usunie teraz warstwę wysp trzustkowych i przeniesie je do stożka o grubości 50 mililitrów, zawierającego 25 milicali buforu do płukania.

Chcesz zrobić ten krok szybko, ponieważ fol jest toksyczny dla oczek. Właściwie usunęliśmy całą warstwę 0 6 9 i 0 9 6. Pavo nacina górną część plastikowej pipety pastwiskowej i spłukuje ją buforem do mycia.

Oczka są następnie odwirowywane, tak jak wirujemy wcześniej. Wirówkę doprowadzamy do tysiąca obrotów na minutę, a następnie zatrzymujemy ją i odsysamy. Oczka sklarowane nad osadem zostaną trzykrotnie przemyte środkiem myjącym.

Tak więc właśnie zakończyliśmy proces izolacji powiek, który przeprowadziliśmy od trawienia do gradientu fol do oczyszczonych oczek po naszym trzecim myciu buforem do mycia, ponownie zawiesiliśmy oczka w naszych pożywkach RPMI i odtworzyliśmy to na płytce do hodowli tkankowej. Oczka te są teraz gotowe do testów in vitro lub preparatów in vivo, takich jak przeszczep oczek.