Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie pierwotnej hodowli komórek strefy nefrogiennej z rozwijającej się nerki. Cel ten osiąga się poprzez wypreparowanie nerek z embrionów w 17,5 dniu rozwoju. Kolejnym krokiem procedury jest usunięcie torebek nerkowych.

Następnie przeprowadza się ograniczoną digestię enzymatyczną narządów, aby uwolnić komórki mezenchymy czapeczki i zrębu kory ze strefy nefrogennej. Ostatnim etapem procedury jest wysianie komórek na fibronektynę i hodowla w medium bezsurowiczym. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące oczyszczoną populację komórek strefy nefrogennej poprzez immunobarwienie specyficznych markerów.

Choć tę metodę można wykorzystać do badania sygnalizacji komórkowej, można ją również zastosować do zrozumienia wymagań substratowych dla ekspansji komórkowej. Na przykład, w przypadku technik wszczepiania, procedurę zaprezentują Derek Adams, technik w moim laboratorium, oraz Aaron Brown, postdoc w moim laboratorium. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów i przygotowaniu naczyń do hodowli tkankowej zgodnie z protokołem pisemnym, należy rozpocząć sekcję embrionalnej nerki myszy, uśmiercając matkę w dniu E 17.5.

Zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji, usuń macicę i umieść ją w szalce Petri zawierającej kilka mililitrów soli fizjologicznej w buforze lub DPBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęsety zegarmistrzowskiej, wyjmij każdy embrion, a drugą pęsetą przeprowadź dekapitację. Po usunięciu z macicy i odcięciu głów wszystkich embrionów z miotu, przenieś je do czystej szalki Petri zawierającej ilość DPBS z wapniem i magnezem wystarczającą do ich całkowitego przykrycia.

Przy każdym zarodku należy pozostawić jak najwięcej krwi i resztek tkanek, a następnie za pomocą pęsety wykonać okrężne nacięcie ściany brzusznej na wysokości pępka. Następnie ułożyć zarodek na grzbiecie i unieruchomić ramiona jedną pęsetą. Drugą pęsetą usunąć narządy wewnętrzne, od płuc aż po pęcherz moczowy.

Nerki będą przymocowane do tylnej części masy narządów wewnętrznych. Następnie należy delikatnie oddzielić nerki od pozostałych organów, dbając o to, aby pozostały one ze sobą połączone.

Następnie przytrzymaj tkankę między nerkami jedną pincetą i chwyć nadnercze przytwierdzone do torebki jednej z nerek drugą pincetą. Delikatnie oddziel torebkę od nerki. Należy uważać, aby nie uszkodzić nerki.

Należy upewnić się, że z nerki oraz z macicy, jeśli nadal jest przytwierdzona, usunięto wszelkie pozostałości torebki. Powtórzyć czynność z drugą nerką. Na koniec przyciąć pipetę transferową do odpowiedniej średnicy i delikatnie przenieść nerki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 mL zawierającej HBSS.

Powtórz izolację nerek dla każdego zarodka i połącz nerki w probówce, umieszczając do ośmiu nerek w jednej probówce w środowisku sterylnym. Rozpocznij proces trawienia enzymatycznego, najpierw usuwając za pomocą pipety roztwór HBSS z probówki o pojemności pięciu mililitrów zawierającej nerki. Zachowaj ostrożność, aby nie dotknąć nerek, i niezwłocznie dodaj 1,5 mililitra kolagenazy, roztworu trawiennego pancreatinum.

Powtórz czynność dla każdej probówki z nerkami i zakręć probówki. Następnie umieść je w mieszalniku w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut. Tuż przed zakończeniem inkubacji, do nowej probówki polistyrenowej o pojemności 5 mL przelej 3 µL DNAs o stężeniu 1 U/µL dla każdego przeprowadzanego trawienia.

Po inkubacji szybko wyjmij trawioną próbkę z inkubatora, dodaj 75 µL FBS i odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać zawartość. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Następnie przenieś 1,4 mL zawiesiny komórkowej do probówki polistyrenowej o pojemności 5 mL zawierającej DNAs Mix i umieść na rotatorze w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut.

Po inkubacji przenieś każdą zawiesinę komórkową do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 325 ×g przez pięć minut. Następnie usuń supernatant, wirując probówki przy 325 ×g przez pięć minut. Resuspenduj osad w 1 ml 5% FBS-HBSS, pipetując zawiesinę w górę i w dół od pięciu do sześciu razy.

Zakręć każdą probówkę przed przejściem do następnej próbki. Po wirowaniu usuń nadsącz i dodaj 500 µL KSFM z dodatkami do każdej probówki, po tym jak medium zostanie dodane do wszystkich probówek. Delikatnie resuspenduj każdy osad komórkowy, pipetując go w górę i w dół pięć do sześciu razy za pomocą mikropipety 1 mL. Połącz wszystkie zawiesiny komórkowe w nowej polistyrenowej probówce o pojemności 5 mL.

Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez uprzednio zwilżony sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm i zbierz przefiltrowany materiał do nowej probówki polistyrenowej. Unikaj dotykania sitka końcówką pipety po zebraniu całego materiału. Przefiltruj uzyskany materiał ponownie przez nowe, uprzednio zwilżone sitko komórkowe.

Usuń sitko i zamknij probówkę nową sterylną zakrętką z innej probówki. Policz komórki i wysiej je z gęstością od 100 000 do 200 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce KSM z dodatkami, korzystając z kodowanej płytek do hodowli włóknistej. Pozostaw komórki strefy nefrogenejnej do regeneracji i przylegania w inkubatorze z kontrolą wilgotności w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez dwie do czterech godzin przed przystąpieniem do jakiejkolwiek stymulacji w ramach eksperymentu.

Przedstawiono obraz w kontraście fazowym (powiększenie 20x) komórek strefy nefrogenną wysianych w zagęszczeniu 200 000 komórek na centymetr kwadratowy i hodowanych przez 24 godziny. Na obrazie komórki strefy nefrogenną wybarwiono przeciwciałem anty-PAX2, które jest specyficzne dla komórek progenitorowych nefronu (kolor czerwony), natomiast jądra komórkowe wybarwiono DAPI (kolor niebieski).

Przedstawiono obraz w kontraście fazowym skupiska progenitorów nefronów przy powiększeniu 40x. Aby dodatkowo wykazać specyficzność, komórki strefy nefrogenezy wyizolowano z embrionów, w których laxy znajdowało się pod kontrolą promotora Fox D one, wykazującego ekspresję w populacji komórek stromy. Następnie komórki w obrębie strefy nefrogenezy rozwijającej się nerki barwiono DAPI na jądra w kolorze niebieskim, phalloidiną na F-aktynę w kolorze zielonym oraz przeciwciałem anty-beta-laktyzazie w kolorze czerwonym.

Po opanowaniu techniki, monowarstwowa kultura pierwotna komórek strefy nefrogennej może zostać przygotowana w ciągu około dwóch godzin. Kultury te umożliwiają szybkie i wysokoprzepustowe badania szlaków sygnalizacji komórkowej w rozwoju progenitorów nefronu, będąc wysoce podatnymi na transdukcję wirusową, traktowanie białkami rekombinowanymi oraz małymi cząsteczkami. Do izolacji specyficznych typów komórek z tych kultur można również zastosować dalsze procedury sortowania komórek.