Name: Izolacja i hodowla komórek ze strefy nerkopochodnej embrionalnej nerki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Naucz się izolować i hodować komórki progenitorowe ze strefy nerkopochodnej embrionalnej nerki myszy. Ta metoda umożliwia badanie szlaków sygnałowych regulujących rozwój nefronów i ma zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant R01 DK078161 z NIDDK (LO), stypendia podoktorskie z American Heart Association (AB), Wenner-Gren Foundations of Sweden oraz Kungliga Fysiografiska Sällskapet w Lund w Szwecji (UB). Dodatkowe wsparcie zapewniły zaplecza rdzeniowe Maine Medical Center Research Institute w zakresie histopatologii, bioinformatyki i FACS (wspierane przez 2P20RR18789-06) oraz zwierzęce zaplecze badawcze MMCRI.

1. Przygotowanie odczynników do trawienia nerki
<ol>
	<li>Do ekstrakcji komórek strefy nefrogiennej (NZCs) z 8 nerek E17.5 potrzebne będzie 1,5 ml 0,25 % (w/v) roztworu kolagenazy A oraz 1 % (w/v) roztworu pankreatyny. Ponieważ pankreatyna rozpuszcza się w temperaturze pokojowej w ciągu około 2 godzin, przed eksperymentem należy przygotować ilość roztworu trawiącego wystarczającą dla przewidywanej maksymalnej liczby nerek embrionalnych. Roztwór trawiący przygotowuje się, dodając najpierw 25 mg kolagenazy A do 10 ml buforu solnego z fosforanami Dulbecco (DPBS) w przezroczystej, sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Kluczowe jest, aby DPBS NIE zawierał wapnia ani magnezu, ponieważ interferowałoby to z trawieniem enzymatycznym. Roztwór należy mieszać na nutatorze przez 10 minut do rozpuszczenia kolagenazy A. Do roztworu rozpuszczonej kolagenazy A należy dodać 100 mg pankreatyny i mieszać na nutatorze przez co najmniej 2 godziny. Alternatywnie, roztwór trawiący kolagenaza A/pankreatyna może być mieszany na nutatorze przez noc w temperaturze 4° C. Zaleca się noszenie maski, ponieważ kolagenaza A i pankreatyna łatwo przedostają się do powietrza podczas ważenia i mogą podrażniać drogi nosowe.</li>
	<li>Przygotować 5 % (v/v) roztwór płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS). Wymieszać przez odwracanie probówki. Konieczne będzie 1 ml na każdą probówkę zawierającą 8 nerek.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając bezzurową pożywkę dla keratynocytów 1 % (v/v) glutaminą i 1 % (v/v) penicyliną i streptomycyną (PenStrep).</li>
	<li>Sterylne, polistyrenowe płytki hodowli tkankowej z płaskim dnem (96, 48, 24 lub 6 dołkowe) należy pokryć roztworem ludzkiej fibronektyny w stężeniu 5 mg na cm2 powierzchni wzrostu. 5 mg proszku fibronektyny resuspenderuje się w 5 ml sterylnej wody H2O. Roztwór ten rozcieńcza się 1:25 w sterylnym DPBS bez wapnia i magnezu, a następnie dodaje się po 250 µl do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Płytki inkubuje się z roztworem fibronektyny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 4° C. Alternatywnie płytki można inkubować przez noc w temperaturze 4° C. Przed dodaniem pożywki/komórek roztwór należy odessać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
</ol>
2. Disekcja nerek i usuwanie torebek (wykonywana w temperaturze pokojowej)
<ol>
	<li>W dniu E17.5 uśmierć matkę zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez miejscową komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach (IACUC), wyjmij macicę i umieść ją w szalce Petri zawierającej DPBS z wapniem i magnezem. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęset zegarmistrzowskich, wyjmij każdy embrion z macicy i odetnij mu głowę. Po wyjęciu całego miotu z macicy, przenieś embriony do czystej szalki Petri zawierającej ilość DPBS z wapniem i magnezem wystarczającą do całkowitego przykrycia embrionów, pozostawiając przy tym jak najwięcej krwi i resztek tkanek.</li>
	<li>Używając pęsety, wykonaj nacięcie okalające ścianę brzuszną embrionu na wysokości pępka. Następnie połóż embrion na plecach, unieruchom go w okolicach barków jedną pęsetą i za pomocą drugiej pęsety usuń narządy wewnętrzne, od płuc aż po pęcherz moczowy. Przy odpowiedniej wprawie można to wykonać jednym ruchem. Nerki powinny pozostać przytwierdzone do tylnej części masy narządów. Jeśli nerki nie pozostaną przytwierdzone do usuniętych narządów, można je ostrożnie wypreparować z grzbietowej ściany ciała. Nerki uszkodzone podczas procesu sekcji należy odrzucić, ponieważ zanieczyszczą one końcową kulturę niepożądanymi typami komórek.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel nerki od pozostałych narządów, dbając o to, aby nerki pozostały ze sobą połączone. Przytrzymaj tkankę między nerkami jedną pęsetą, a drugą chwyć nadnercze przylegające do jednej z nerek. Nadnercze powinno być przytwierdzone do torebki nerki. Delikatnie odwarstw nadnercze i torebkę z zewnętrznej strony nerki, w sposób podobny do obierania banana. Należy uważać, aby nie rozdzielić nerki na pół podczas obierania i nie uszkodzić tkanki nerki znajdującej się pod torebką. Ostrożnie usuń pozostałości torebki oraz moczowód, jeśli jest nadal przytwierdzony. Powtórz czynność z drugą nerką.</li>
	<li>Użyj uciętej pipety transferowej, aby przenieść nerki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml z HBSS. Powtórz kroki 2.2–2.4 dla każdego embrionu. Nerki można łączyć po 8 sztuk na probówkę. Przy wprawie sekcja i usuwanie torebek zajmują 2–3 minuty na embrion.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne nerek (wszystkie etapy w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej)
<ol>
	<li>Za pomocą pipetora usunąć roztwór HBSS z probówek o pojemności 5 ml zawierających nerki, uważając, aby nie dotknąć nerek. Natychmiast dodać 1,5 ml roztworu trawiennego Collagenase A/Pancreatin do probówki 5 ml z nerkami, przed przejściem do kolejnej próbki. Powtórzyć czynność dla każdej probówki z nerkami.</li>
	<li>Umieścić probówki z trawieniami enzymatycznymi nerek na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze na 15 minut. Na 2 minuty przed zakończeniem trawienia dodać 3 μl DNazy (1 U/ml) do nowej probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml dla każdego wykonywanego trawienia.</li>
	<li>Szybko wyjąć trawienia z inkubatora, dodać 75 μl FBS i odwrócić probówki 3 razy w celu wymieszania. Pozostawić na stole laboratoryjnym na 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść 1,4 ml zawiesiny komórkowej do polistyrenowej probówki 5 ml zawierającej DNazę (1 U/ml), pozostawiając w pierwotnej probówce pozostałe 0,2 ml zawiesiny komórkowej i nerki. Pozostawione 0,2 mL roztworu będzie zawierać zanieczyszczenia, takie jak macierz pozakomórkowa.</li>
	<li>Mieszać zawiesinę komórkową z DNazą na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze przez 10 minut.</li>
	<li>Szybko wyjąć zawiesiny komórkowe z inkubatora i przenieść każdą z nich do probówki Eppendorf 1,5 ml. Wirować zawiesiny komórkowe w mikrowirówce przy 325 g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć nadsącz z granulatu komórkowego i resuspendować granulat w 1 ml 5% FBS/HBSS, pipetując w górę i w dół od 5 do 6 razy. Zamknąć każdą probówkę przed przejściem do kolejnej próbki.</li>
	<li>Wirować zawiesiny komórkowe w mikrocentryfudze przy 325 g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i dodać do każdej probówki 0,5 ml bezserumowej pożywki do keratynocytów (KSFM) z dodatkami, a następnie zamknąć probówkę przed przejściem do kolejnej próbki. Po dodaniu pożywki do wszystkich probówek, delikatnie resuspendować każdy granulat komórkowy, pipetując w górę i w dół od 5 do 6 razy za pomocą mikropipety 1 ml. Połączyć wszystkie zawiesiny komórkowe w nowej polistyrenowej probówce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wstępnie zwilżyć KSFM dwie nakrętki z sitkiem komórkowym 40 μm umieszczone na polistyrenowej probówce o okrągłym dnie 5 ml dla każdej próbki. Przenieść zawiesiny komórkowe przez jedną nakrętkę z sitkiem za pomocą mikropipety 1 ml. Unikać dotykania filtra końcówką pipety. Zebrać przefiltrowany płyn i powtórzyć filtrację przez drugą nakrętkę z sitkiem. Zdjąć nakrętkę z sitkiem i zastąpić ją nową nakrętką z nowej polistyrenowej probówki 5 ml.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek i przenieść komórki do dołków płytki hodowlanej pokrytej fibronektyną w gęstości 100 000-200 000 komórek na cm2, rozcieńczając w razie potrzeby pożywką KSFM z dodatkami. Zazwyczaj uzyskuje się około 4,5x106 komórek z miotu 10 embrionów.</li>
	<li>Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37° C przy 5% CO2.</li>
	<li>Pozwolić komórkom na regenerację i przytwierdzenie się w pożywce przez 2-4 godziny przed stymulacją dodatkowymi odczynnikami. Stymulować komórki wybranym związkiem przez okres od 1 do 48 godzin. Oczyścić RNA do analizy PCR za pomocą zestawu Qiagen RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcjami producenta lub postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby przeprowadzić fluorescencyjne barwienie immunocytochemiczne komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników do fiksacji komórek i immunobarwienia
<ol>
	<li>Przygotować 4% PFA: Rozpuścić 4% paraformaldehyd w PBS (v/v) w temperaturze 55° C przy regularnym mieszaniu. Przed użyciem schłodzić do temperatury pokojowej. Roztwór ten jest toksyczny i należy go utylizować w wyznaczonych pojemnikach na odpady.</li>
	<li>Przygotować roztwór do permeabilizacji, dodając Triton X-100 do PBS w celu uzyskania roztworu o stężeniu 0,3% (v/v).</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór blokujący w PBS z surowicą pochodzącą od tego samego gatunku, u którego wytworzono przeciwciało wtórne. Na przykład, jeśli przeciwciało przeciwko antygenowi docelowemu pochodzi od królika i będzie wykrywane za pomocą przeciwciała donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568, należy przygotować roztwór blokujący zawierający 5% surowicy osła. Przechowywać w temperaturze 4° C.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając odpowiednie stężenie przeciwciała do 5% roztworu blokującego.</li>
	<li>Roztwór przeciwciała wtórnego przygotować bezpośrednio przed użyciem. Dodać przeciwciało sprzężone z fluorophorem w stężeniu zalecanym przez producenta wraz z barwnikiem jądrowym DAPI i innymi markerami organelli, takimi jak faloidyna, do 5% roztworu blokującego. W przypadku konieczności przechowywania, roztwór należy trzymać w ciemności w temperaturze 4° C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować 50% roztwór glicerolu/PBS (v/v) do przechowywania komórek poddanych immunobarwieniu. Alternatywnie można zastosować Vectashield.</li>
</ol>
5. Fiksacja komórek i immunobarwienie
<ol>
	<li>Poniższy protokół został opracowany w celu utrwalenia i barwienia NZC na płytce 24-dołkowej. Podane objętości dotyczą pojedynczego dołka. Podczas wszystkich etapów odczynniki należy pipetować delikatnie, aby uniknąć odklejenia komórek; w etapach inkubacji nie zaleca się wstrząsania płytki.</li>
	<li>Delikatnie usunąć medium za pomocą mikropipety 1 ml i dodać 0,5 ml 4% PFA do przytwierdzonych hodowli komórkowych. Inkubować przez 15 minut bez zakłócania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 4% PFA i dodać 0,5 ml roztworu do permeabilizacji na dołek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór do permeabilizacji i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w 4° C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał wtórnych. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml 50% roztworu glicerolu/PBS (v/v) lub odpowiednią ilość Vectashield, aby pokryć dno powierzchni dołka.</li>
	<li>Wykonać obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub przechowywać owiniętą w folię w 4° C.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy: kontrast fazowy i immunofluorescencja próbek komórek przy powiększeniu 20x i 40x." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Komórki NZC zostały oczyszczone z embrionów w stadium E17.5, wysiane w zagęszczeniu 200,000 komórek na cm2 i inkubowane w temperaturze 37° C przez łącznie 24 godziny. Komórki obrazowano w kontraście fazowym przy użyciu odwróconego mikroskopu Leica DM IRB przed barwieniem immunofluorescencyjnym. (A) Widok w kontraście fazowym (20X) komórek NZC po 24 godzinach hodowli. (B) Komórki utrwalono i zabarwiono za pomocą króliczego przeciwciała anty-PAX2 specyficznego dla komórek progenitorowych nefronów (kolor czerwony) oraz wtórnego przeciwciała osiołczego anty-króliczego sprzężonego z Alexa Fluor 568. Zwróć uwagę na niebieskie jądra komórkowe zabarwione DAPI. (C) Widok w kontraście fazowym (40X) skupiska progenitorów nefronów (w centrum) po 24 godzinach hodowli. (D) Obraz (40X) komórek NZC izolowanych z embrionów LacZ+ szczepu Foxd1LacZ, który wykazuje ekspresję β-galaktozydazy pod kontrolą promotora Foxd1. Foxd1 wykazuje ekspresję w populacji komórek zrębowych w strefie nefrogennej rozwijającej się nerki. Komórki zabarwiono markerem F-aktyny falloidyną (pierwotny koniugat Oregon green), barwnikiem jądrowym DAPI (kolor niebieski) oraz króliczym przeciwciałem anty-β-galaktozydazie (wtórne – osiołcze anty-królicze Alexa Fluor 568) w celu detekcji komórek zrębowych Foxd1+ (kolor czerwony).

<ol><li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li>
<li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li>
<li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li>
<li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li>
<li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li>
<li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W niniejszym protokole opisujemy metodę izolacji i hodowli komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki. Jest to rozwinięcie metody opublikowanej pierwotnie w ramach badania wpływu leczenia BMP7 na komórki strefy nefrogennej (Blank et al., 2009). W początkowym badaniu przeprowadzono szereg eksperymentów w celu charakterystyki typów komórek reprezentowanych w populacji NZC. Krótko mówiąc, oczyszczanie NZC z wykorzystaniem reporterów genetycznych dla zrębu korowego (Foxd1+/lacZ) (Hatini <em...

<table><tbody><tr><td>Pinceta zegarmistrzowska nr 5&amp;rsquo;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4905</td><td>wymagane 2 pary</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche Group</td><td>10 103 578 001</td><td>używać maski</td></tr><tr><td>Pankreatyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8096</td><td>używać maski</td></tr><tr><td>DPBS z Ca, Mg</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-513F</td><td>z Mg &amp;amp; Ca</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>14-901E</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>KSFM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10724-011</td><td>bez dodanych czynników wzrostu</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>stosować w stężeniu 1% v/v</td></tr><tr><td>PenStrep 10 000 U penicyliny / ml 10 mg streptomycyny / ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>stosować w stężeniu 1% v/v</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>dostarczana w proszku</td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 24-dołkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>142485</td><td>Nunclon</td></tr><tr><td>DPBS bez Mg &amp;amp; Ca</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe 5mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DNaza (1 U/&amp;mu;l)</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>4 &amp;#x03BC;l na 1.5 ml</td></tr><tr><td>Sito do komórek 40 mikronów</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>z nakrętką i probówką</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>stosować w stężeniu 4% w/v</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>VWR international</td><td>VW3929-2</td><td>stosować w stężeniu 0.3% v/v</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>dostarczany w proszku</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>stosować w stężeniu 5% v/v</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-PAX2</td><td>Invitrogen</td><td>71-6000</td><td>rozcieńczyć 1:100</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-&amp;#946;-gal</td><td>MP Biomedicals</td><td>559762</td><td>rozcieńczyć 1:200</td></tr><tr><td>Faloidyna Oregon Green 488</td><td>Invitrogen</td><td>O7466</td><td>rozcieńczyć 1:200</td></tr><tr><td>Osie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>rozcieńczyć 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>rozcieńczyć 1:5000</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td>wymieszać 50% z H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>stosować protokół &quot;DNase on column&quot;</td></tr><tr><td>Pipety transferowe, 3ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357575</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Rozwój zarodkowy nerki był przedmiotem szerokich badań, zarówno jako model oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych w organogenezie, jak i w celu lepszego zrozumienia przyczyn wrodzonych chorób nerek. W ostatnim czasie, w rozwijającej się dziedzinie medycyny regeneracyjnej, badano możliwość kierowania naiwnych embrionalnych komórek macierzystych w stronę losów nefrogenezy. Badania genetyczne u myszy pozwoliły zidentyfikować kilka szlaków niezbędnych do rozwoju nerek, a niedawno opracowano ogólny katalog transkrypcji genów w tym narządzie. <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>dostarczając licznych potencjalnych regulatorów kluczowych funkcji rozwojowych. Organogenezę nerki gryzoni można badać w kulturze organów; w wielu raportach podejście to wykorzystywano do analizy skutków aplikacji kandydackich białek lub wyciszenia ekspresji kandydackich genów przy użyciu siRNA lub morfolino. Jednakże przydatność kultury organów w badaniu sygnalizacji regulującej różnicowanie w przeciwieństwie do odnawiania komórek macierzystych/progenitorowych w rozwijającej się nerce jest ograniczona, ponieważ hodowane organy zawierają zwartą macierz pozakomórkową, która ogranicza dyfuzję makrocząsteczek i cząsteczek wirusowych. Aby zbadać zdarzenia sygnalizacji komórkowej wpływające na niszę komórek macierzystych/progenitorowych w nerce, opracowaliśmy system pierwotnych komórek, który odtwarza strefę nefrogenną lub niszę komórek progenitorowych rozwijającej się nerki. ex vivo w izolacji od nabłonkowego induktora różnicowania. Dzięki ograniczonemu trawieniu enzymatycznemu komórki strefy nefrogenezy mogą zostać selektywnie uwolnione z rozwijających się nerek w stadium E17,5. Po filtracji komórki te mogą być hodowane w formie nieregularnej warstwy jednowarstwowej w zoptymalizowanych warunkach. Analiza genów markerowych wykazuje, że hodowle te zawierają rozkład typów komórek charakterystyczny dla strefy nefrogenezy. in vivooraz aby utrzymywały odpowiednią ekspresję genów markerowych podczas okresu hodowli. Komórki te są bardzo podatne na działanie małych cząsteczek i białek rekombinowanych, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co znacznie ułatwia badanie efektów regulatorów kandydackich komórek macierzystych/progenitorowych. Podstawowe parametry biologii komórki, takie jak proliferacja i śmierć komórek, a także zmiany w ekspresji markerów molekularnych charakterystycznych dla komórek macierzystych/progenitorowych nefronów in vivo mogą zostać z sukcesem wykorzystane jako wyniki eksperymentalne. Trwająca w naszym laboratorium praca z wykorzystaniem tej nowej techniki hodowli komórek pierwotnych ma na celu odkrycie podstawowych mechanizmów rządzących regulacją odnawiania się w stosunku do różnicowania w komórkach macierzystych/progenitorowych nefronów.

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Rozwój embrionalny nerki był szeroko badany zarówno jako model oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych w organogenezie, jak i w celu uzyskania...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie pierwotnej hodowli komórek strefy nefrogiennej z rozwijającej się nerki. Cel ten osiąga się poprzez wypreparowanie nerek z embrionów w 17,5 dniu rozwoju. Kolejnym krokiem procedury jest usunięcie torebek nerkowych.Następnie przeprowadza się ograniczoną digestię enzymatyczną narządów, aby uwolnić komórki mezenchymy czapeczki i zrębu kory ze strefy nefrogennej. Ostatnim etapem procedury jest wysianie komórek na fibronektynę i hodowla w medium bezsurowiczym. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące oczyszczoną populację komórek strefy nefrogennej poprzez immunobarwienie specyficznych markerów.Choć tę metodę można wykorzystać do badania sygnalizacji komórkowej, można ją również zastosować do zrozumienia wymagań substratowych dla ekspansji komórkowej. Na przykład, w przypadku technik wszczepiania, procedurę zaprezentują Derek Adams, technik w moim laboratorium, oraz Aaron Brown, postdoc w moim laboratorium. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów i przygotowaniu naczyń do hodowli tkankowej zgodnie z protokołem pisemnym, należy rozpocząć sekcję embrionalnej nerki myszy, uśmiercając matkę w dniu E 17.5.Zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji, us

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowla komórek z strefy nefrogennej zarodka nerki myszy embrionalnej

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

W tym filmie pokazujemy kroki izolacji i oczyszczania komórek nabłonka kanalików nerkowych dla szerokiego zakresu badań biologii molekularnej i hodowli komórkowych.

Izolacja mysich komórek nerkowych: technika izolowania i generowania pierwotnej kultury komórek nabłonka kanalików nerkowych

Ten protokół opisuje metodę izolowania i hodowli podstaw metanefrycznych z embrionów myszy.

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę izolacji i hodowli komórek zrębu okołonaczyniowego nerek (kPSC) opartą na perfuzji całego narządu za pomocą enzymów trawiennych i wzbogacaniu komórek NG2. Dzięki tej metodzie możliwe jest uzyskanie wystarczającej liczby komórek do terapii komórkowej.

Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.

Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Naucz się izolować i hodować komórki progenitorowe ze strefy nerkopochodnej embrionalnej nerki myszy. Ta metoda umożliwia badanie szlaków sygnałowych regulujących rozwój nefronów i ma zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Przeglądaj więcej filmów