Name: Zmodyfikowany protokół kohodowli ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół kohodowli ES/OP9 do różnicowania komórek macierzystych myszy w linie hematopoetyczne. Ta metoda umożliwia pełną charakterystykę potomstwa i badanie defektów hematopoetycznych bez użycia zarodków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy U. Ganapati za opracowanie i przetestowanie linii komórkowej mStrawberry OP9. Dodatkowo dziękujemy H. Shafif za pomoc przy hodowli współdzielonej. H.P. jest wspierany stypendiem z National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (H.P.). Treść niniejszej pracy jest wyłączną odpowiedzialnością autora i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Heart, Lung, And Blood Institute ani National Institutes of Health (NIH). UCLA Flow Cytometry Core Facility jest wspierane przez NIH (CA-16042 i AI-28697), Jonsson Cancer Center, UCLA AIDS Institute oraz UCLA School of Medicine.

1. Przygotowanie komórek ES
<ol>
	<li>Hoduj komórki ES zgodnie ze standardowym protokołem dla danej linii komórkowej. Należy przygotować odpowiednią liczbę komórek ES do wysiewu na komórki mStrawberry OP9 w dniu 0 (komórki ES zostaną wysiane w zagęszczeniu 1x10^3 komórek na cm2 w dniu 0)</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek OP9
<ol>
	<li>Przed hodowlą komórek mStrawberry OP9 przygotuj pożywkę wzrostową OP9 
	Pożywka do hodowli komórek OP-9 
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>Roztwór stokowy</td>
				<td>Stężenie końcowe</td>
				<td>Objętość (mL)</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>aMEM</td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>39.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>FBS (testowany dla OP-9)</td>
				<td>10%</td>
				<td>20%</td>
				<td>10</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>L-glutamina</td>
				<td>10X (200mM)</td>
				<td>2mM</td>
				<td>0.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>50mL</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	Przechowywać w 4°C i zużyć w ciągu jednego tygodnia od przygotowania</li>
	<li>Aby utrzymać komórki mStrawberry OP9, pożywkę należy wymieniać co 2 dni, a komórki należy pasażować przed osiągnięciem pełnej konfluencji (pasażowanie przy 70-90% konfluencji). Hodowle komórek mStrawberry OP9 nigdy nie są prowadzone powyżej 90% konfluencji, ponieważ doprowadzi to do ich różnicowania w adipocyty. Patrz Rycina 3.
	<ol class="lalpha">
		<li>Pasażuj komórki, przemywając je 2X w PBS (lub 1x w PBS + 1x w 0,1% Trypsyny-EDTA)</li>
		<li>Dodaj podgrzaną wcześniej 0,1% Trypsynę-EDTA w temperaturze 37°C na 5 minut (lub do momentu odklejenia się komórek)</li>
		<li>Po odklejeniu się komórek dodaj pożywkę wzrostową OP-9. Przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 50mL.</li>
		<li>Zwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć supernatant.</li>
		<li>Resuspenduj komórki w świeżej pożywce wzrostowej mStrawberry OP9</li>
		<li>Wysiej komórki z minimalną gęstością 104komórek/cm2</li>
		<li>Hoduj komórki mStrawberry OP9 do uzyskania konfluencji, zaczynając na 3 dni przed dniem wymaganym do ko-hodowli z komórkami ES (Dzień 0, Dzień 5 lub Dzień 8/9 eksperymentu)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ko-kultura ES/mStrawberry z komórkami OP9
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki różnicującej do kokultury 
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>Stężenie początkowe</td>
				<td>Stężenie końcowe</td>
				<td>Objętość (mL)</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>aMEM</td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>39,5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>FBS</td>
				<td>10%</td>
				<td>20%</td>
				<td>10</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>L-glutamina</td>
				<td>20mM</td>
				<td>2mM</td>
				<td>0,5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>50mL</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Komórki mStrawberry OP9 (Dzień –3)
	<ol class="lalpha">
		<li>ZAWZSY przeprowadzaj pasaż komórek OP9 w dniu -3, aby w dniu 0 kokultury uzyskać konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9. Patrz Rycina 4b. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w gęstości 1x104/cm2, aby osiągnąć konfluencję w dniu 0. Pamiętaj o pasażowaniu dodatkowych komórek na dzień 5 oraz dzień 8/9 w celu kontynuacji kokultury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li class="jove_content">Przygotowanie kokultury ES/mStrawberry OP9 (Dzień 0)
	<ol class="lalpha">
		<li class="jove_content">Przemyj komórki ES 2x za pomocą PBS</li>
		<li>Poddaj komórki ES trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA, inkubuj przez 5 min w 37°C</li>
		<li>Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury</li>
		<li>Odwiruj komórki ES przy 40xg przez 5-7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant</li>
		<li>Resuspenduj komórki w pożywce różnicującej do kokultury</li>
		<li>Usuń pożywkę z komórek mStrawberry OP9</li>
		<li>Dodaj pożywkę różnicującą do kokultury do kolb z komórkami mStrawberry OP9</li>
		<li>Wysiej 1x103 komórek ES/cm2 do kolby z komórkami mStrawberry OP9. Inkubuj komórki w temperaturze 37° C, w 5% CO2 z zachowaniem wilgotności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki mStrawberry OP9 (Dzień 2)
	<ol class="lalpha">
		<li>Przeprowadź pasaż komórek mStrawberry OP9, aby uzyskać konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9 na 5. dzień kokultury. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w gęstości 1x104/cm2, aby uzyskać konfluencję w dniu 5 (jak w kroku 3.2). W razie potrzeby przeprowadź pasaż dodatkowych komórek na dzień 8/9 (jak w kroku 2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 3)
	<ol class="lalpha">
		<li>Ostrożnie usuń pożywkę z kokultury i zastąp ją świeżą pożywką różnicującą do kokultury</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	 Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 5) 
	<ol class="lalpha">
		<li>Ostrożnie przemyj kokultury 2x za pomocą PBS</li>
		<li>Poddaj komórki trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA</li>
		<li>Zmyj komórki z kolby za pomocą pożywki różnicującej do kokultury</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant</li>
		<li>Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury. Użyj tępej igły o rozmiarze 21G do resuspensji komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek</li>
		<li>Policz komórki za pomocą komory countingowej. Liczba komórek ES powinna wzrosnąć 10-150 razy w stosunku do dnia 0.</li>
		<li>Ponownie wysiej od 6,48x104/cm2 do 7,76x104/cm2 komórek z kokultury na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9</li>
		<li>ANALIZY w dniu 5 – pozostałe komórki z kokultury mogą być wykorzystane do analizy cytometrii przepływowej, cytopreparacji (30 tys. komórek), testów ChIP itp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 8/9 i Dzień 12)
	<ol class="lalpha">
		<li>Usuń pożywkę różnicującą z kolby i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x za pomocą PBS, aby usunąć komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Nie wylewaj komórek krwiotwórczych.</li>
		<li>Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA</li>
		<li>Zmyj komórki z kolby pożywką różnicującą dla ES i dodaj je do komórek krwiotwórczych z zawiesiny</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant</li>
		<li>Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury lub PBS. Użyj tępej igły o rozmiarze 21G do resuspensji komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek. Policz komórki za pomocą komory countingowej.</li>
		<li>Kokulturę można kontynuować przez 14 dni w celu oceny bardziej dojrzałych progenitorów krwiotwórczych poprzez ponowne wysiewanie komórek z kokultury na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9 w dniu 8 lub 9, a następnie ponownie w dniu 12. Wysiej zoptymalizowaną liczbę komórek w zależności od wymaganej odzyskiwalności komórek w dniu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena potomstwa pochodzącego z komórek ES (Dzień 1-14). Potomstwo pochodzące z komórek ES może być oceniane w dowolnym dniu kokultury poprzez sortowanie przepływowe komórek negatywnych pod kątem mStrawberry (potomstwo pochodzące z ES).
	<ol class="lalpha">
		<li>Usuń pożywkę różnicującą z kolby i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x za pomocą PBS, aby usunąć komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Nie wylewaj komórek krwiotwórczych.</li>
		<li>Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA</li>
		<li>Zmyj komórki z kolby pożywką różnicującą do kokultury i dodaj je do komórek krwiotwórczych z zawiesiny</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant</li>
		<li>Resuspenduj komórki za pomocą tępej igły o rozmiarze 21G i policz je</li>
		<li>Potomstwo pochodzące z komórek ES (komórki mStrawberry-negatywne) można oddzielić metodą sortowania przepływowego od komórek OP9 mStrawberry-pozytywnych. Potomstwo pochodzące z ES można następnie scharakteryzować za pomocą analizy cytometrii przepływowej, cytopreparacji, testów ChIP itp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Harmonogram kokultury mysich komórek ES/mStrawberry z komórkami OP9; dni zbioru komórek i pasażowania; schemat badawczy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. System kokultury ES/mStrawberry i OP9. Nasze laboratorium wykorzystuje in vitro System kokultury komórek ES do modelowania rozwoju hematopoetycznego. W tym systemie kokultury komórki ES różnicują się w hemangioblasty w 5. dniu, gdy zostaną umieszczone na konfluencyjnej warstwie komórek mStrawberry OP9. W miarę trwania kokultury w 8. dniu obecne są prekursory hematopoetyczne, natomiast w 14. dniu pojawiają się terminalnie zróżnicowane linie hematopoetyczne. Strzałki wskazują dni różnicowania, w których konieczne jest pasażowanie potomstwa pochodzącego z komórek ES na nowe konfluencyjne warstwy komórek mStrawberry OP9.
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Etapy różnicowania hematopoetycznego, obrazy mikroskopowe; rozwój komórek, stadium hemangioblastyczne, prekursory." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Prawidłowe różnicowanie komórek ESKomórki ES wysiewa się na konfluentną warstwę komórek mStrawberry OP9 w dniu 0. Potomstwo pochodzące z komórek ES zaczyna być widoczne w 3. dniu różnicowania, przyjmując postać skupisk komórek o wyraźnej granicy lub zaczynając tworzyć wzory wirowate. Hemangioblasty, będące wspólnym mezodermalnym prekursorem linii śródbłonkowej i hematopoetycznej, powinny pojawić się w 5. dniu jako piętrzące się wiry komórek. W przypadku okresów kokultury dłuższych niż pięć dni, potomstwo pochodzące z komórek ES powinno występować w postaci skupisk komórek hematopoetycznych. W 6. lub 7. dniu powinny pojawić się skupiska składające się z dwóch do czterech komórek, które do 8. lub 9. dnia kokultury urosną w większe agregaty komórkowe. Pozostałe potomstwo pochodzące z komórek ES znajduje się ściśle związane z adherentną warstwą komórek zrębowych.
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Tworzenie hemangioblastów, dzień 5, obraz mikroskopowy, niewłaściwy wzorzec rozwoju, analiza badań komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Nieudane różnicowanie komórek ES. Wyniki z tej kokultury odzwierciedlają nieprawidłowe różnicowanie komórek ES. Należy zauważyć, że w 5. dniu potomstwo pochodzące z komórek ES nie układa się w strukturę wiru. Brak komórek ułożonych w wir wskazuje na nieprawidłową formację hemangioblastów. Jeśli hemangioblasty nie rozwiną się prawidłowo, dalsza kokultura doprowadzi do zahamowania różnicowania linii hematopoetycznej. Kokultury z nieprawidłową formacją hemangioblastów należy utylizować.
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Kultury mStrawberry OP9, obraz mikroskopowy, porównanie wzrostu komórek niezlewnej i zlewnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kultury komórek OP9 z mStrawberry. (A) Komórki OP9 mStrawberry są poddawane pasażowaniu przy konfluencji 70–90%. (B) W celu prawidłowej różnicowania komórki ES oraz pochodne z nich komórki potomne są wysiewane na nadmiernie konfluencyjną warstwę komórek OP9 mStrawberry.
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Analiza cytometryczna, wykres rozrzutu, sortowanie komórek mStrawberry+, dane SSC-A vs FSC-A." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywny profil przepływu dla kokultury ES/mStrawberry OP9. Wszystkie potomstwo pochodzące z komórek ES są komórkami mStrawberry-ujemnymi i mogą zostać wyselekcjonowane metodą sortowania przepływowego z komórek OP9 mStrawberry. Brama dla komórek mStrawberry-ujemnych została wyznaczona przy użyciu tradycyjnej kokultury ES/OP9.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
<li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).</li>
<li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells%3A+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Embryonic+stem+cells+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cells : methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek mStrawberry OP9 prowadzi do powstania hemangioblastów Flk1+ w 5. dniu kokultury. Hemangioblasty powinny występować w postaci spiętrzonych kłaczków komórek, co przedstawiono na Rysunku 1. W pozostałym czasie kokultury widoczne potomstwo pochodzące z komórek ES powinno pojawiać się jako skupiska komórek krwiotwórczych (Rysunek 1). W 6. lub 7. dniu powinny pojawić się od dwóch do czterech skupisk komórek, które do 8. lub 9. dnia kokultury urosną w większe skupiska komórek (zarówno przylegające, jak i w zawiesinie). Inne potomstwo pochodzące z komórek ES znajduje się również w ciasnym połączeniu z przyległą warstwą komórek zrazikowych.
Choć nie jest to wyszczególnione w protokole, kluczowe jest wstępne przetestowanie FBS stosowanego w medium wzrostowym dla komórek ES, mediach wzrostowych dla komórek mStrawberry OP9 oraz mediach różnicowania dla ES/mStrawberry OP9. Odpowiednio przetestowana surowica powinna zapewnić prawidłowy wzrost komórek mStrawberry OP9, a także właściwe różnicowanie komórek ES w kokulturze aż do 5. dnia różnicowania. Jako alternatywę lub uzupełnienie dla komórek mStrawberry OP9, komórki OP9 mogą zostać napromieniowane dawką 8000 rad przed wysianiem do osiągnięcia pełnej konfluencji (7,8x104 komórek/cm2). Napromieniowanie komórek OP9 pozwala na wyeliminowanie powtarzających się etapów przesiewania, a także umożliwia niemal całkowite usunięcie starych, zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz.
Komórki OP9 zmodyfikowano genetycznie w celu ekspresji białka mStrawberry poprzez transdukcję komórek OP9 wektorem lentiwirusowym w stężeniu 3ug/mL, wykazującym ekspresję mStrawberry pod kontrolą promotora CMV (wektor pRRLsin-CMV, UCLA vector core).
Standardowe protokoły kokultury ES/OP9 zakładają umieszczanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także etap przeżycia w 5. dniu w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9 z pasażu komórkowego. Ponadto, do oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES usuwane są jedynie komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Jednakże, zarówno etap przeżycia, jak i zbieranie wyłącznie komórek w zawiesinie mogą prowadzić do pominięcia znacznej liczby rozwijających się krwiotwórczych komórek pochodnych z ES. Problem ten staje się istotny przy próbach charakteryzacji defektów krwiotwórczych związanych z liniami ES z knockoutem. Aby obejść ten problem, w naszym laboratorium zastosowano zmodyfikowaną kokulturę z wykorzystaniem komórek OP9 wykazujących ekspresję mStrawberry. Zapewnia to przeniesienie całego potomstwa ES do dalszej kokultury w 5. dniu oraz możliwość zbioru całego potomstwa pochodnego z ES do dalszych analiz. Modyfikacja ta stanowi użyteczne narzędzie w ocenie i charakteryzacji potomstwa krwiotwórczego pochodzącego z linii ES zarówno człowieka, jak i myszy.
Ten model kokultury ES-mStrawberry z komórkami OP9 odwzorowuje różne stadia prymitywnej i definitywnej hematopoezy. W badaniach nad najwcześniejszymi etapami rozwoju hematopoetycznego często stosuje się test BL-CFC (Blast-like colony forming cell), który ocenia powstawanie hemangioblastów z komórek ES. Choć test BL-CFC jest użytecznym narzędziem przy badaniu wczesnego rozwoju hematopoetycznego, system kokultury mStrawberry-ES wykazuje większą użyteczność, ponieważ pozwala na ocenę nie tylko hemangioblastów, ale także bardziej dojrzałych linii hematopoetycznych.
Poprzednie prace z wykorzystaniem tradycyjnych protokołów różnicowania OP9/ES i EB wykazały, że w celu uzyskania krótko- i długoterminowo repopulujących komórek macierzystych krwi in vitro mogą być niezbędne dodatkowe czynniki, takie jak nadekspresja HoxB4. Konieczne są dalsze badania, aby ocenić, czy sortowane populacje pochodzące z ES, u których nie stwierdzono obecności mStrawberry, zawierają rzeczywiste komórki macierzyste krwi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Składniki zapasu pożywki do utrzymania komórek OP-9</td></tr><tr><td>aMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB01</td><td>Przetestowane</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C I</td><td>&lt;u&gt;200nM&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Składniki zapasu pożywki do różnicowania komórek ES/OP-9</td></tr><tr><td>aMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Przetestowane</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td>200mM</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany protokół kokultury es / op9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

Diferencjacja komórek ES in vitro w kierunku linii krwiotwórczych jest przydatna przy badaniu populacji komórkowych, które są trudne do uzyskania in vivo, oraz w charakterystyce najwcześniejszych genów zaangażowanych w hematopoezę, bez konieczności mierzenia się z letalnością embrionalną. System kokultury ES/OP9 został pierwotnie zaprojektowany w celu wytworzenia potomstwa krwiotwórczego bez nadprodukcji makrofagów, ponieważ linia komórek zstrojowych OP9 pochodzi z czaszki myszy z mutacją osteopetrozy, którym brakuje funkcjonalnego M-CSF. System kokultury ES/OP9 in vitro może być wykorzystywany do odtworzenia wczesnego rozwoju krwiotwórczego. Hodowane na komórkach zstrojowych OP9, komórki ES różnicują się w hemangioblasty Flk-1+, progenitorów krwiotwórczych, a ostatecznie w dojrzałe, terminalnie zróżnicowane linie. Standardowy protokół kokultury ES/OP9 polega na umieszczeniu komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także na okresowych etapach przepaszczania w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9. Co więcej, obecne protokoły obejmują ocenę wyłącznie komórek krwiotwórczych znajdujących się w zawiesinie i nie są zoptymalizowane pod kątem oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES w każdym dniu różnicowania. Jednakże, ze względu na etapy przepaszczania i zbieranie wyłącznie komórek z zawiesiny, można pominąć znaczną część potomstwa pochodzącego z komórek ES oraz rozwijających się komórek krwiotwórczych. Kwestia ta staje się istotna przy próbie charakterystyki wad krwiotwórczych związanych z liniami ES z nokautem. Opisujemy tutaj zmodyfikowaną kokulturę ES/mStrawberry OP9, która pozwala na wyeliminowanie zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz. Metoda ta umożliwia pełną ocenę całego potomstwa pochodzącego z komórek ES we wszystkich dniach kokultury, co prowadzi do uzyskania wzorca różnicowania krwiotwórczego, który bardziej bezpośrednio odpowiada wzorcowi różnicowania krwiotwórczego obserwowanemu w embrionie.

Komórki OP9 mStrawberry umożliwiają pełną ocenę wszystkich potomnych pochodzących z ES z kokultury.

Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

Różnicowanie komórek ES in vitro w kierunku linii hematopoetycznej jest przydatne podczas badania populacji komórkowych, do których dostęp in vivo jest utrudniony...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest różnicowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych w różne prymitywne i definitywne linie hematopoetyczne. Aby scharakteryzować wszystkie potomki komórek ES, różnicowanie mysich komórek hematopoetycznych osiąga się poprzez wysianie komórek ES na konfluentną warstwę stromalnych komórek OP9 znakowanych fluorescencyjnie mStrawberry. Każdy dzień różnicowania lub kokultury reprezentuje poszczególne etapy rozwoju hematopoetycznego w odpowiednim czasie zbioru.Potomstwo zróżnicowanych komórek ES można oddzielić od linii komórkowej stromy M strawberry OP nine za pomocą sortowania komórek. Ten protokół różnicowania komórek ES odtwarza prymitywną i definitywną hematopoezę obserwowaną in vivo i może być wykorzystany do charakterystyki defektów hematopoetycznych związanych z liniami komórek ES z knockoutem bez użycia embrionów. Witajcie w laboratorium dr Judith Gassen w Johnson Comprehensive Cancer Center na UCLA.Nazywam się Alicia Poz. Główną zaletą techniki, którą zaprezentuję dzisiaj, w porównaniu do istniejących metod kokultury ESO9, jest to, że procedura ta umożliwia pasażowanie wszystkich komórek z piątego i ósmego dnia, a także całkowitą separację wszystkich potomnych komórek pochodzących z ES. W przypadku stromy OP9, komórki OP9 są hodowane w pożywce do hodowli komórek OP9, którą należy wymieniać co dwa dni.Komórki OP9 należy pasażować na trzy dni przed planowanym rozpoczęciem kokultury. Należy pamiętać, aby podczas utrzymywania linii komórkowej gęstość komórek OP9 nie przekraczała 90% konfluencji. Najpierw wypłucz komórki dwukrotnie za pomocą PBS, a następnie dodaj podgrzany 0,1% trypsyna-EDTA na pięć minut, aż komórki się odkleją. Dodaj pożywkę do hodowli komórek OP9 i przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Po wirowaniu zgranulować komórki w probówce przy 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i resuspenderć komórki w świeżej pożywce do hodowli komórek OP9 od truskawki M, a następnie wysiać komórki z minimalną gęstością 10⁴ komórek/cm² w dniu rozpoczęcia eksperymentu z kokulturą. Komórki OP9, które zostały spasażowane trzy dni wcześniej, powinny tworzyć konfluencję. Komórki ES należy hodować zgodnie ze standardowym protokołem dla danej linii komórkowej.Przemyć komórki ES dwukrotnie PBS, zdetakować je trypsyną z EDTA o stężeniu 0,25% i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodać do komórek ES pożywkę do różnicowania w ko-kulturze i przenieść je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować komórki ES przy 400 G przez pięć do siedmiu minut w temperaturze pokojowej.Po usunięciu supernatantu resuspender komórki ES w medium do różnicowania kokultury. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, należy użyć tępej igły o rozmiarze 21 G. Policz komórki, stosując błękit trypanowy i hemocytometr.Teraz należy wyjąć kolbę z M strawberry. Wyjmij komórki OP9 z inkubatora. Usuń pożywkę z komórek OP9 i dodaj do kolby pożywkę do różnicowania kokultury.Do każdej kolby z komórkami M strawberry OP9 przenieść 1 × 10³ komórek ES na centymetr kwadratowy. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 i przy odpowiedniej wilgotności. Jest to dzień zero; ko-kultura powinna wyglądać w ten sposób. Trzy dni po rozpoczęciu ko-kultury ES i M strawberry OP9.Obserwuje się głównie duże, płaskie skupiska potomstwa pochodzącego z ES o wyraźnych granicach, a w niektórych miejscach zaczną tworzyć się wiry komórek. Pięć dni po rozpoczęciu kokultury ostrożnie usunąć medium z kokultury i zastąpić je świeżym medium różnicującym. Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluentnej warstwie komórek M strawberry OP nine powinno prowadzić do powstania hemangioblastów, które wyglądają jak spiętrzone wiry komórek.Najbardziej krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie prawidłowej różnicowania w piątym dniu współhodowli. Na tym etapie kolonie hematopoetycznych blastów powinny być widoczne nie tylko mikroskopowo, ale również makroskopowo. Ostrożnie przemyj współhodowlę dwukrotnie PBS, a następnie potraktuj komórki 0,25% trypsyną z EDTA. Zmyj komórki z kolby, używając pożywki do różnicowania ES, i przenieś je do probówki; odwirowuj komórki przy 400 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu usunąć nadsącz i dodać świeżą pożywkę. Następnie, używając igły stępionej o rozmiarze 21 G, resuspender komórki. Aby upewnić się, że uzyskano jednoprzestrzeniową zawiesinę komórek, należy policzyć je za pomocą hemocytometru; liczba komórek ES powinna wzrosnąć od 100 do 150 razy w stosunku do dnia zerowego. W dniu ósmym lub dziewiątym ponownie wysiać komórki z kokultury na nową warstwę konfluencyjnych komórek M strawberry OP9, a w dniu dwunastym ponownie policzyć komórki. Usunąć pożywkę z komórkami hematopoetycznymi i zachować ją.Przemyj monowarstwę raz PBS. Aby usunąć zawieszone komórki krwiotwórcze i zachować je, dodaj do kolby 0,25% trypsyny EDTA; po przyleganiu trypsyny wypłucz komórki z kolby za pomocą pożywki różnicowania ES i dodaj je do komórek krwiotwórczych znajdujących się w zawiesinie. Wirować komórki przy 400 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Na koniec resuspenduj komórki, używając stępionej igły o rozmiarze 21 G, i dokonaj ich zliczenia. Komórki są teraz gotowe do ponownego wysiania lub użycia w dalszych analizach.System kokultury ES M strawberry OP nine może być wykorzystany do modelowania opisanego rozwoju hematopoetycznego. Poniżej przedstawiono przegląd przebiegu czasowego kokultury, w którym wskazano dni, w których zróżnicowane potomstwo ES musi zostać przeniesione na nowe komórki M strawberry OP nine. Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek M strawberry OP nine doprowadzi do produkcji flick one positive.Angioblasty w piątym dniu kokultury. Osteoblasty stanowią wspólny prekursor mezodermalny dla linii śródbłonkowej i krwiotwórczej i powinny występować w postaci nagromadzonych skupisk komórek, jak pokazano na tym obrazie. W miarę postępu kokultury, w szóstym lub siódmym dniu powinny pojawić się klastry składające się z dwóch do czterech komórek, które następnie przekształcą się w większe skupiska komórkowe. Prekursory krwiotwórcze są obecne do ósmego lub dziewiątego dnia, podczas gdy terminalnie zróżnicowane linie krwiotwórcze pojawiają się do 14. dnia.W przeciwieństwie do tego, kokultura z niewłaściwym różnicowaniem ESL doprowadzi do powstania potomstwa pochodzącego z komórek ES, które w piątym dniu nie ukażą wzoru świata. Brak komórek we wzorze świata wskazuje na niewłaściwe formowanie blastów GIO. Kokultura z niewłaściwym formowaniem eblastów ostatecznie doprowadzi do zahamowania różnicowania linii hematopoetycznej i powinna zostać odrzucona zgodnie z tym zmodyfikowanym protokołem kokultury ES OP9.Potomstwo pochodzące z ES jest negatywne pod kątem m strawberry i może zostać oddzielone metodą sortowania przepływowego od komórek pozytywnych pod kątem M strawberry. W dowolnym dniu współhodowli pobrano dziewięć komórek do oceny. Przedstawiono wyniki z reprezentatywnego eksperymentu.Wcześniej opublikowane protokoły kokultury ES OP dziewięciu skupiały się wyłącznie na pasażowaniu i ocenie nieadherentnych komórek pływających. W tym zmodyfikowanym protokole pasażowane są i mogą być oceniane wszystkie komórki pochodzące z ES, zarówno adherentne, jak i nieadherentne. Prowadzi to do zwiększenia wydajności uzyskiwania komórek krwiotwórczych, umożliwia identyfikację rzadkich populacji komórek oraz zapewnia pełną charakterystykę wszystkich potomnych komórek ES, zarówno krwiotwórczych, jak i niekrwiotwórczych.

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zmodyfikowany protokół współhodowli ES / OP9 umożliwia lepszą charakteryzację potomstwa krwiotwórczego

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film opisuje technikę długoterminowej kohodowli 2D komórek białaczkowych z komórkami zrębu szpiku kostnego w celu zbadania ich interakcji z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego. Model kokultury 2D wykorzystuje komórki ostrej białaczki limfoblastycznej oraz zrębu szpiku kostnego lub osteoblasty, które wpływają na fenotyp komórek nowotworowych. Badanie to pomoże w badaniu mechanizmów, które leżą u podstaw przeżycia komórek białaczkowych wspomaganych szpikiem kostnym podczas ekspozycji na...

Kokultura 2D komórek białaczkowych z BMSC: metoda uzyskiwania subpopulacji komórek białaczkowych

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Obecne protokoły utrzymania nieśmiertelnych, multipotencjalnych komórek progenitorowych (iMOP) i różnicowania otycznego są otyczne.  Zwrócono uwagę na warunki hodowli i markery molekularne, które wskazują na różnicowanie w nabłonek czuciowy i neurony zwojowe spirali (SGN).

Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje procedurę indukowania różnicowania ludzkich komórek macierzystych i prądkotworzycznych krwiotwórczych pochodzących z szpiku kostnego pacjenta i komórek jednojądrzasty składnik krwi obwodowej. Test wykorzystuje półsztywne medium kulturowe wspierające zobowiązanie do linii erytrocytarnej i mieloidalnej oraz zawiera standaryzowane metryki umożliwiające reprodukowalną klasyfikację kolonii w celu charakteryzacji przedklinicznego leku.

Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Poznaj zmodyfikowany protokół kohodowli ES/OP9 do różnicowania komórek macierzystych myszy w linie hematopoetyczne. Ta metoda umożliwia pełną charakterystykę potomstwa i badanie defektów hematopoetycznych bez użycia zarodków.

Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

Przeglądaj więcej filmów