Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest różnicowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych w różne prymitywne i definitywne linie hematopoetyczne. Aby scharakteryzować wszystkie potomki komórek ES, różnicowanie mysich komórek hematopoetycznych osiąga się poprzez wysianie komórek ES na konfluentną warstwę stromalnych komórek OP9 znakowanych fluorescencyjnie mStrawberry. Każdy dzień różnicowania lub kokultury reprezentuje poszczególne etapy rozwoju hematopoetycznego w odpowiednim czasie zbioru.

Potomstwo zróżnicowanych komórek ES można oddzielić od linii komórkowej stromy M strawberry OP nine za pomocą sortowania komórek. Ten protokół różnicowania komórek ES odtwarza prymitywną i definitywną hematopoezę obserwowaną in vivo i może być wykorzystany do charakterystyki defektów hematopoetycznych związanych z liniami komórek ES z knockoutem bez użycia embrionów. Witajcie w laboratorium dr Judith Gassen w Johnson Comprehensive Cancer Center na UCLA.

Nazywam się Alicia Poz. Główną zaletą techniki, którą zaprezentuję dzisiaj, w porównaniu do istniejących metod kokultury ESO9, jest to, że procedura ta umożliwia pasażowanie wszystkich komórek z piątego i ósmego dnia, a także całkowitą separację wszystkich potomnych komórek pochodzących z ES. W przypadku stromy OP9, komórki OP9 są hodowane w pożywce do hodowli komórek OP9, którą należy wymieniać co dwa dni.

Komórki OP9 należy pasażować na trzy dni przed planowanym rozpoczęciem kokultury. Należy pamiętać, aby podczas utrzymywania linii komórkowej gęstość komórek OP9 nie przekraczała 90% konfluencji. Najpierw wypłucz komórki dwukrotnie za pomocą PBS, a następnie dodaj podgrzany 0,1% trypsyna-EDTA na pięć minut, aż komórki się odkleją. Dodaj pożywkę do hodowli komórek OP9 i przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Po wirowaniu zgranulować komórki w probówce przy 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i resuspenderć komórki w świeżej pożywce do hodowli komórek OP9 od truskawki M, a następnie wysiać komórki z minimalną gęstością 10⁴ komórek/cm² w dniu rozpoczęcia eksperymentu z kokulturą. Komórki OP9, które zostały spasażowane trzy dni wcześniej, powinny tworzyć konfluencję. Komórki ES należy hodować zgodnie ze standardowym protokołem dla danej linii komórkowej.

Przemyć komórki ES dwukrotnie PBS, zdetakować je trypsyną z EDTA o stężeniu 0,25% i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodać do komórek ES pożywkę do różnicowania w ko-kulturze i przenieść je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować komórki ES przy 400 G przez pięć do siedmiu minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu supernatantu resuspender komórki ES w medium do różnicowania kokultury. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, należy użyć tępej igły o rozmiarze 21 G. Policz komórki, stosując błękit trypanowy i hemocytometr.

Teraz należy wyjąć kolbę z M strawberry. Wyjmij komórki OP9 z inkubatora. Usuń pożywkę z komórek OP9 i dodaj do kolby pożywkę do różnicowania kokultury.

Do każdej kolby z komórkami M strawberry OP9 przenieść 1 × 10³ komórek ES na centymetr kwadratowy. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 i przy odpowiedniej wilgotności. Jest to dzień zero; ko-kultura powinna wyglądać w ten sposób. Trzy dni po rozpoczęciu ko-kultury ES i M strawberry OP9.

Obserwuje się głównie duże, płaskie skupiska potomstwa pochodzącego z ES o wyraźnych granicach, a w niektórych miejscach zaczną tworzyć się wiry komórek. Pięć dni po rozpoczęciu kokultury ostrożnie usunąć medium z kokultury i zastąpić je świeżym medium różnicującym. Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluentnej warstwie komórek M strawberry OP nine powinno prowadzić do powstania hemangioblastów, które wyglądają jak spiętrzone wiry komórek.

Najbardziej krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie prawidłowej różnicowania w piątym dniu współhodowli. Na tym etapie kolonie hematopoetycznych blastów powinny być widoczne nie tylko mikroskopowo, ale również makroskopowo. Ostrożnie przemyj współhodowlę dwukrotnie PBS, a następnie potraktuj komórki 0,25% trypsyną z EDTA. Zmyj komórki z kolby, używając pożywki do różnicowania ES, i przenieś je do probówki; odwirowuj komórki przy 400 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu usunąć nadsącz i dodać świeżą pożywkę. Następnie, używając igły stępionej o rozmiarze 21 G, resuspender komórki. Aby upewnić się, że uzyskano jednoprzestrzeniową zawiesinę komórek, należy policzyć je za pomocą hemocytometru; liczba komórek ES powinna wzrosnąć od 100 do 150 razy w stosunku do dnia zerowego. W dniu ósmym lub dziewiątym ponownie wysiać komórki z kokultury na nową warstwę konfluencyjnych komórek M strawberry OP9, a w dniu dwunastym ponownie policzyć komórki. Usunąć pożywkę z komórkami hematopoetycznymi i zachować ją.

Przemyj monowarstwę raz PBS. Aby usunąć zawieszone komórki krwiotwórcze i zachować je, dodaj do kolby 0,25% trypsyny EDTA; po przyleganiu trypsyny wypłucz komórki z kolby za pomocą pożywki różnicowania ES i dodaj je do komórek krwiotwórczych znajdujących się w zawiesinie. Wirować komórki przy 400 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Na koniec resuspenduj komórki, używając stępionej igły o rozmiarze 21 G, i dokonaj ich zliczenia. Komórki są teraz gotowe do ponownego wysiania lub użycia w dalszych analizach.

System kokultury ES M strawberry OP nine może być wykorzystany do modelowania opisanego rozwoju hematopoetycznego. Poniżej przedstawiono przegląd przebiegu czasowego kokultury, w którym wskazano dni, w których zróżnicowane potomstwo ES musi zostać przeniesione na nowe komórki M strawberry OP nine. Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek M strawberry OP nine doprowadzi do produkcji flick one positive.

Angioblasty w piątym dniu kokultury. Osteoblasty stanowią wspólny prekursor mezodermalny dla linii śródbłonkowej i krwiotwórczej i powinny występować w postaci nagromadzonych skupisk komórek, jak pokazano na tym obrazie. W miarę postępu kokultury, w szóstym lub siódmym dniu powinny pojawić się klastry składające się z dwóch do czterech komórek, które następnie przekształcą się w większe skupiska komórkowe. Prekursory krwiotwórcze są obecne do ósmego lub dziewiątego dnia, podczas gdy terminalnie zróżnicowane linie krwiotwórcze pojawiają się do 14. dnia.

W przeciwieństwie do tego, kokultura z niewłaściwym różnicowaniem ESL doprowadzi do powstania potomstwa pochodzącego z komórek ES, które w piątym dniu nie ukażą wzoru świata. Brak komórek we wzorze świata wskazuje na niewłaściwe formowanie blastów GIO. Kokultura z niewłaściwym formowaniem eblastów ostatecznie doprowadzi do zahamowania różnicowania linii hematopoetycznej i powinna zostać odrzucona zgodnie z tym zmodyfikowanym protokołem kokultury ES OP9.

Potomstwo pochodzące z ES jest negatywne pod kątem m strawberry i może zostać oddzielone metodą sortowania przepływowego od komórek pozytywnych pod kątem M strawberry. W dowolnym dniu współhodowli pobrano dziewięć komórek do oceny. Przedstawiono wyniki z reprezentatywnego eksperymentu.

Wcześniej opublikowane protokoły kokultury ES OP dziewięciu skupiały się wyłącznie na pasażowaniu i ocenie nieadherentnych komórek pływających. W tym zmodyfikowanym protokole pasażowane są i mogą być oceniane wszystkie komórki pochodzące z ES, zarówno adherentne, jak i nieadherentne. Prowadzi to do zwiększenia wydajności uzyskiwania komórek krwiotwórczych, umożliwia identyfikację rzadkich populacji komórek oraz zapewnia pełną charakterystykę wszystkich potomnych komórek ES, zarówno krwiotwórczych, jak i niekrwiotwórczych.