Name: Sekcja oka myszy na cały wierzchowiec nabłonka barwnikowego siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Poznaj technikę sekcji oka myszy w celu uzyskania całego wierzchowca nabłonka barwnikowego siatkówki. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju siatkówki i chorób wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 dla A.J.R.B.] oraz grant badawczy Institutional Research Grant American Cancer Society [ACS-IRG-00-173-04] w ramach projektu pilotażowego [dla A.J.R.B.]. Dziękujemy również członkom laboratorium Bishopa za krytyczną lekturę manuskryptu oraz uwagi do filmu, a w szczególności Adamowi Brownowi za przykład tego, czego nie należy robić. Dziękujemy dr. Donaldowi McEwenowi z Greehey Children's Cancer Research Institute za umożliwienie nam skorzystania z jego zestawu składającego się z mikroskopu sekcyjnego i kamery wideo do nagrania procesu sekcji. Dziękujemy Daronowi Brownowi z Corte Instruments za naostrzenie i naprawę naszych narzędzi do mikrosekcji.

1. Usunięcie zbędnej tkanki z zewnętrznej strony oka
<ol>
	<li>Wlej 1X PBS do pokrywki szalki 35 mm. Poziom płynu powinien znajdować się tuż poniżej krawędzi pokrywki.</li>
	<li>Za pomocą pęsety prostej przenieś oko (lub oka) z probówki do przechowywania do szalki 35 mm. Oka są zanurzone w PBS z dwóch powodów: 1. Nadmiarowe tkanki „odpłyną” od oka, co umożliwi ich łatwe dostrzeżenie i usunięcie, oraz 2. Podczas sekcji oko w zawiesinie naturalnie zachowa swój sferyczny kształt, co pozwala na pracę z tą formą, zamiast z nią walczyć.</li>
	<li>Używając obu par pęset kątowych (45° i 15°), delikatnie usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej, odciągając tkankę w kierunku przeciwnym do przebiegu włókien (t.j. w stronę rogówki). Część tkanki łącznej pozostanie. Należy dążyć do jak najmniejszego ściskania gałki ocznej.</li>
	<li>Zamień pęsetę 15° na nożyczki sprężynowe. Stabilizując oko pęsetą 45°, użyj nożyczek sprężynowych do wycięcia pozostałych mięśni, tkanki łącznej oraz nerwu wzrokowego. *Wskazówka: Użyj zewnętrznej krawędzi nożyczek, aby odsunąć tkankę w kierunku przeciwnym do przebiegu włókien (w stronę granicy rogówkowo-twardówkowej), a następnie przytnij ją. Kontynuuj, aż wszystkie nadmiarowe tkanki zostaną usunięte z oka.</li>
</ol>
2. Usunięcie rogówki i soczewki
<ol>
	<li>Ustawiając rogówkę skierowaną do góry, użyj pęsety 45°, aby uchwycić niewielki fałd w centrum rogówki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj niewielkie nacięcie u podstawy fałdu. Następnie zwolnij uścisk fałdu.</li>
	<li>Trzymając oko nieruchomo pęsetą, wprowadź dolne ostrze nożyczek prostopadle do nacięcia i wykonaj cięcie w kierunku granicy rogówkowo-twardówkowej. Staraj się utrzymać dolne ostrze pod tęczówką, aby przeciąć zarówno rogówkę, jak i tęczówkę. Nie docinaj do samej granicy rogówkowo-twardówkowej. Pozostaw nożyczki wprowadzone do oka.</li>
	<li>Używając pęsety 45°, ostrożnie obróć oko tak, aby nożyczki znajdowały się równolegle do granicy rogówkowo-twardówkowej, i wykonaj niewielkie cięcie. Powoli obróć oko o 360°, wykonując małe nacięcia wzdłuż całego obwodu. Ponownie staraj się utrzymać dolne ostrze nożyczek sprężynowych pod tęczówką, aby przeciąć zarówno tęczówkę, jak i rogówkę. Odseparuj tęczówkę i rogówkę od reszty oka i je usuń.</li>
	<li>Przechyl oko na bok i delikatnie naciśnij tylną połowę gałki ocznej, aby wypchnąć soczewkę. Usuń soczewkę. Wnętrze pozostałej pucharowej części oka wyścielone jest siatkówką neuronalną, która powinna wyglądać gładko i być nieprzezroczysta.</li>
</ol>
3. Podziel powstałą „czarkę” z oka na cztery części, tworząc strukturę przypominającą kwiat o 4 „płatkach”
<ol>
	<li>Oko należy ustawić w taki sposób, aby otwór naczynia z okiem znajdował się prostopadle do ciała. Do stabilizacji i pozycjonowania naczynia należy użyć pęsety pod kątem 45°.</li>
	<li>Trzymając nożyczki sprężynowe przed sobą, prostopadle do ciała, należy wsunąć dolne ostrze nożyczek w górną krawędź otwartego naczynia z okiem. Za pomocą pęsety pod kątem 45° należy ostrożnie wyrównać naczynie tak, aby można było wykonać jedno proste cięcie od granicy rogówki i twardówki w kierunku główki nerwu wzrokowego. Wszystkie cięcia powinny być prostopadłe do granicy rogówki i twardówki i, o ile nie określono inaczej, powinny przebiegać jak najbliżej główki nerwu wzrokowego, nie naruszając jej.</li>
	<li>Należy obrócić naczynie z okiem o 180°, zachowując jego prostopadłe ustawienie względem ciała. Należy zastosować technikę opisaną w kroku 3.2, aby wykonać drugie cięcie prostopadłe.</li>
	<li>Należy obrócić naczynie i powtórzyć technikę opisaną w punkcie 3.2, aby wykonać dwa kolejne cięcia. Wszystkie cztery cięcia powinny być oddalone od siebie o kąt jak najbliższy 90°. Należy pamiętać, że oko nie jest idealnie sferyczne, więc wystąpić może pewna zmienność.</li>
</ol>
4. Przetnij każdy z czterech „płatków” na pół, tworząc strukturę przypominającą kwiat o ośmiu płatkach
<ol>
	<li>Przenieś ćwiartkę gałki ocznej z szalki 35 mm na czyste szkiełko. Ustawiając gałkę oczną stroną górną do góry, podważ ją pęsetą pod kątem 45°. Ostrożnie wyjmij ją z cieczy i umieść na czystym szkiełku.</li>
	<li>Używając obu par pęset kątowych, delikatnie rozchyl oko tak, aby siatkówka neuronalna była skierowana do góry. NIE USUWAJ SIATKÓWKI NEURONALNEJ – pomaga ona zachować sferyczny kształt oka, dzięki czemu nie będziesz musiał przeciwdziałać jego strukturze. Chroni ona również nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) przed przypadkowym uszkodzeniem podczas kolejnych etapów.</li>
	<li>Obracaj szkiełko, aż jeden z „płatków” znajdzie się prostopadle do Twojej pozycji.</li>
	<li>Za pomocą pęsety pod kątem 15° delikatnie chwyć róg płatka. Róg płatka powinien stanowić rogówka, a nie siatkówka neuronalna lub RPE. Delikatnie unieś róg, pozwalając mu zachować naturalne zakrzywienie.</li>
	<li>Wsuń dolne ostrze nożyczek sprężynowych pomiędzy płatek a szkiełko. Ustaw nożyczki tak, aby można było wykonać pojedyncze, proste i prostopadłe cięcie od granicy rogówkowo-twardówkowej w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Tnij jak najbliżej głowy nerwu wzrokowego, unikając jednak jego przecięcia. Puść płatek, pozwalając mu opaść na szkiełko.</li>
	<li>Obróć szkiełko o 90°, tak aby kolejny płatek znajdował się prostopadle do Twojej pozycji. Powtórz krok 4.5.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5 i 4.6 jeszcze dwukrotnie. Powstała struktura powinna przypominać ośmiopłatkowy kwiat.</li>
</ol>
5. Usunięcie siatkówki neuronowej
<ol>
	<li>Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat. Zapobiegnie to przywieraniu siatkówki neuronalnej podczas oddzielania jej od RPE.</li>
	<li>Zazwyczaj siatkówka neuronalna jest luźno przytwierdzona do RPE. Jednak usunięcie wyłącznie siatkówki neuronalnej, bez naruszania RPE, wymaga praktyki i wprawy. Delikatnie uchwyć fragment siatkówki neuronalnej jedną parą pęset kątowych, stabilizując (przytrzymując) resztę oka drugą parą pęset kątowych. Odsuń siatkówkę neuronalną od reszty oka. Kontynuuj tę procedurę, aż cała siatkówka neuronalna zostanie usunięta. *Wskazówka: włóż końcówkę pęsety 15° w głowę nerwu wzrokowego, aby zakotwiczyć oko. Następnie użyj pęsety 45°, aby podsunąć ją pod siatkówkę neuronalną i unieść ją do góry i na zewnątrz. Najlepiej jest unosić siatkówkę neuronalną od strony głowy nerwu wzrokowego w kierunku granicy rogówkowo-twardówkowej. Pamiętaj o usunięciu wszelkich luźnych pozostałości tęczówki. Tęczówka jest dość lepka i w przeciwnym razie może przykleić się do RPE.</li>
	<li>Przepłucz preparat 1X PBS. Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat, a następnie go odessij. Wylej PBS. Powtarzaj czynność w razie potrzeby, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Zamocuj preparat(y) na szkiełku
<ol>
	<li>Nanieś pipetą 80-90 μL 90% glicerolu na nowe szkiełko w kształcie prostokąta. Użyj boku końcówki pipety, aby stworzyć równomiernie rozprowadzoną, prostokątną plamę glicerolu. (Jest to procedura montażu dwóch RPE na jednym szkiełku).</li>
	<li>Wsuń dolne ramię pęsety 15° pod preparat. Delikatnie podnieś preparat ze szkiełka sekcyjnego.</li>
	<li>Powoli opuść preparat do glicerolu. Delikatnie poruszaj pęsetą, wyciągając ją spod preparatu.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1-6.3 dla drugiego preparatu.</li>
	<li>Obróć szkiełko tak, aby dłuższy bok był prostopadły do Twojego ciała. Trzymaj szkiełko nakrywką pod kątem 45° do szkiełka przedmiotowego, tak aby się go dotykało. Przesuwaj je w stronę plamy glicerolu, aż wejdą w kontakt. Zachowując kontakt między szkiełkiem nakrywką a przedmiotowym, powoli przesuwaj nakrywkę od plamy w stronę krawędzi szkiełka. Ustaw długie boki szkiełka przedmiotowego i nakrywki tak, aby były równoległe. Trzymaj rogi szkiełka nakrywki między kciukiem a palcem wskazującym.</li>
	<li>Chwyć pęsetę 15° w drugą rękę. Oprzyj górną (wolną) krawędź szkiełka nakrywki w zgięciu ramienia pęsety. Bardzo powoli opuszczaj szkiełko nakrywkę. W momencie zetknięcia szkiełka nakrywki z glicerolem zatrzymaj się i poczekaj, aż glicerol się rozprzestrzeni. Powtarzaj proces opuszczania i czekania, aż preparaty całego RPE zostaną w pełni przykryte. Ma to zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w wysoce lepkim glicerolu. NIE NACISKAJ SZKIEŁKA NAKRYWKI – glicerol zostanie wypchnięty spod niej, co spowoduje bardzo słabą adhezję.</li>
	<li>Za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci zamaluj obwód w miejscu styku szkiełka nakrywki i przedmiotowego.</li>
	<li>Umieść szkiełko na pustym statywie w celu wyschnięcia.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Wynikiem tej procedury powinna być struktura przypominająca kwiat, która powinna być w znacznym stopniu symetryczna.
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Schemat spintroniki: wizualizacja domeny magnetycznej, wskazująca kierunkową magnetyzację na schemacie." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Całkowity preparat RPE z myszy szczepu C67Bl/6J typu dzikiego. RPE zwierząt o czarnym lub agouti umaszczeniu powinno mieć ciemnobrązowy kolor i gładką powierzchnię. Występowanie pofalowań w topografii płatków jest zjawiskiem normalnym. Pigmentacja poszczególnych preparatów może być zróżnicowana ze względu na różną gęstość barwnika zarówno w RPE, jak i w znajdującej się pod nim naczyniówce. Białe strzałki wskazują hipopigmentowane „kanały” – jest to zjawisko prawidłowe, wynikające z obecności naczyń krwionośnych oka. Niebieska strzałka wskazuje uszkodzenie mechaniczne RPE oraz leżącej pod nią naczyniówki.
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Wynik chromatografii cienkowarstwowej; radialny wzór rozdziału na płytce krzemionkowej pokazujący rozkład związku." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Całkowity preparat RPE od myszy typu dilute. Okazy pobrane od zwierząt z mutacją dilute mogą mieć kolor od niemal przezroczystego do kawy z mlekiem, a każdy pojedynczy okaz prawdopodobnie wykazuje zmienność w obrębie tkanki, co zaznaczono tutaj czarnymi okręgami. Zasadniczo RPE pobrane od młodszych zwierząt są jaśniejsze, a od starszych – ciemniejsze. Czarne strzałki wskazują część leżącego poniżej unaczynienia, które wydaje się hipopigmentowane.
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; porównanie struktury komórkowej w skali 50μm; analiza badawcza." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Barwienie falloidyną może być wykorzystane do wykrywania uszkodzeń fizycznych RPE. Barwienie falloidyną wyraźnie obrysowuje błony komórkowe, ukazując sześciokątny kształt nabłonka. (A) Przykład od czarnej myszy. (B) Przykład od myszy dilute.
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Porównanie obrazów mikroskopowych schematu struktury rośliny, przedstawiające układ i morfologię komórkową." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Niewłaściwie wypreparowany RPE od myszy linii dilute. (A) Nawiasy wskazują zbyt szerokie brzegi rogówki, co może powodować wybrzuszenia i/lub fałdowanie. Wewnątrz czarnego koła widoczne są nadmierne ilości tkanki obcej, która nie została usunięta z tylnej części oka. Są one szczególnie widoczne, ponieważ próbka pochodzi od zwierzęcia linii dilute. Płatek w lewym dolnym rogu jest częściowo złożony. (B) Ten preparat całego organu ma wygląd wiatraczka. Czarne strzałki wskazują niektóre wykonane nacięcia. Wiele nacięć od podziału rogówkówkowo-twardówkowego w kierunku głowy nerwu wzrokowego nie pokrywa się z średnicą. (C) Czarne strzałki wskazują, w jaki sposób nacięcia powinny zostać wykonane: zgodnie z średnicą i prostopadle do stycznej.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

RPE jest miejscem przeprowadzania testu pun , który jest badaniem in vivo naprawy kierowanej homologią. Test pun był wykorzystywany do badania wpływu różnych uszkodzeń DNA1,2 oraz genów sygnałowych i naprawczych DNA3,4,5 na częstotliwość naprawy kierowanej homologią. Badanie to jest wysoce czułe, umożliwiając wykrywanie zdarzeń w pojedynczych komórkach RPE1. Może ono również wykrywać różnice w czasie występowania zdarzeń naprawy kierowanej...

<table><tbody><tr><td>pinceta prosta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>końcówka: .08 x .04 mm materiał: INOX</td></tr><tr><td>pinceta 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>końcówka: .05 x.01 mm materiał: INOX</td></tr><tr><td>pinceta 15&amp;#x00B0; &quot;wygięta w górę&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>końcówka: .1 x.06 mm materiał: INOX</td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>szerokość końcówki grzebieniowej 0.3mm długość ostrza 3mm materiał: stal nierdzewna</td></tr><tr><td>stereomikroskop binokularny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>z zastosowaniem źródła światła odbitego</td></tr><tr><td>faloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) znajduje się w tylnej części oka ssaków, bezpośrednio pod siatkówką nerwową, która zawiera fotoreceptory (pręciki i czopki). RPE stanowi monowarstwa pigmentowanych komórek sześcianowatych i ściśle przylega do znajdującej się powyżej siatkówki nerwowej. Ta bliskość sprawia, że RPE jest niezwykle interesujący dla badaczy zajmujących się chorobami siatkówki. RPE jest również miejscem przeprowadzania testu in vivo naprawy DNA kierowanej przez homologię, znanego jako test pun . Oko mysie jest szczególnie trudne do wypreparowania ze względu na niewielki rozmiar (około 3,5 mm średnicy) i kulisty kształt. Niniejszy artykuł szczegółowo demonstruje procedurę sekcji oka, która pozwala na uzyskanie preparatu całego nabłonka RPE. W tej procedurze pokazujemy, jak pracować z wykorzystaniem, a nie przeciwko, kulistej strukturze oka. W skrócie, z tylnej części oka usuwa się tkankę łączną, mięśnie i nerw wzrokowy. Następnie usuwa się rogówkę i soczewkę. Kolejno wykonuje się strategiczne cięcia, które prowadzą do znacznego spłaszczenia pozostałej tkanki. Na koniec delikatnie oddziela się siatkówkę nerwową, odsłaniając nienaruszony RPE, który pozostaje przytwierdzony do leżącej poniżej błony naczyniowej i twardówki. Taki preparat całego nabłonka może być wykorzystany do przeprowadzenia testu pun , a także do badań immunohistochemicznych lub immunofluorescencyjnych tkanki RPE.

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) znajduje się w tylnej części oka ssaków, bezpośrednio pod siatkówką nerwową, która zawiera fotoreceptory (pręciki i...

Nazywam się Allison Clavon. Jestem asystentką badawczą dr. Alexa Bishopa w Gree Children's Cancer Research Institute w UT Health Science Center w San Antonio w Teksasie. Dzisiaj zaprezentuję, jak przeprowadzić sekcję oka gryzonia w celu pozyskania pełnej ilości nabłonka pigmentowego siatkówki.Tkanka ta jest istotna dla badań nad rozwojem i chorobami siatkówki, a także stanowi miejsce przeprowadzania testu naprawy DNA sterowanej przez homologię in vivo. Zatem zacznijmy. Oto oko przygotowane do sekcji.Najpierw przyjrzyjmy się strukturom anatomicznym, które będą służyć jako punkty orientacyjne podczas całej procedury. To oko zwierzęcia poddanego utrwalaniu. Tutaj, z tyłu oka po przeciwnej stronie, znajduje się nerw wzrokowy.To jest rogówka. Tęczówka jest widoczna przez rogówkę. Biała obszar z tyłu oka to twardówka.Dlatego obszar ten nazywa się granicą rogówki i twardówki. Pierwszym krokiem preparatyki jest usunięcie tkanek zbędnych, takich jak tkanka łączna mięśni oraz nerw wzrokowy. Następnie należy usunąć rogówkę, wykonując cięcie okrężne.W tym momencie można wyjąć soczewkę, co spowoduje powstanie pustej oczodołu. Następnie wykonuje się cztery cięcia od granicy rogówki i twardówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Powstała struktura przypomina czteropłatkowy kwiat.Każdy z tych czterech płatków zostaje następnie przecięty wzdłuż środka, w wyniku czego powstaje struktura przypominająca kwiat o ośmiu płatkach. Na tym etapie materiał może się wygiąć w niektórych obszarach ze względu na jego sferyczny charakter. Aby temu zapobiec i uzyskać bardziej płaski uchwyt otworu, można wykonać osiem krótszych nacięć, przechodzących przez miejsca wygięcia.Na stanowisku pracy należy przygotować zestaw materiałów, w tym pipetę o objętości 100 lub 200 µL wraz z odpowiednimi końcówkami, szalkę Petriego X-P-B-S-A o średnicy 35 mm, szkiełka i lamelki, 90% glicerol oraz bezbarwny lakier do paznokci do przygotowania preparatów, statyw do suszenia szkiełek, pudełko chusteczek Kim wipes oraz pojemnik na odpady. Oprócz tych podstawowych materiałów niezbędny będzie zestaw specjalistycznych narzędzi do mikrosekcji, w tym pęsetę prostą oraz pęsetę wygiętą pod kątem 45°, służące do podtrzymywania, obracania i ogólnej manipulacji gałką oczną podczas sekcji. Pęsety wygięte pod kątem 15° są skierowane ku górze i również służą do manipulowania gałką oczną.Na koniec będą potrzebne nożyczki sprężynowe. Bardzo ważne jest użycie nożyczek sprężynowych zamiast nożyczek tradycyjnych. Przed rozpoczęciem tej sekcji upewnij się, że wysokość krzesła jest dostosowana w taki sposób, aby przy wyprostowanej sylwetce Twoje oczy znajdowały się na poziomie okularów.Zgarbienie się przy mikroskopie powoduje ból barków i pleców oraz obniża jakość przeprowadzonych sekcji. Aby rozpocząć, wlej niewielką ilość XPBS do pokrywki szalki o średnicy 35 milimetrów. Następnie przenieś oczy przeznaczone do sekcji do szalki.Jest to oko myszy szczepu C 57 black typu dzikiego. Można zauważyć, że jest ono bardzo małe, o średnicy około 3,5 mm. Nieprzezroczystość twardówki nadaje mu niebieskawy odcień.Pierwszym krokiem sekcji jest usunięcie wszystkich zbędnych tkanek z okolic oka, takich jak tkanka łączna mięśni oraz nerw wzrokowy. W lewej ręce trzymam pęsetę pod kątem 45 stopni, a w prawej pęsetę pod kątem 15 stopni. Można użyć jednej pęsety do stabilizacji oka, podczas gdy drugą odciąga się tkankę.Gdy oderwie się większy fragment tkanki, ostrożnie przetrzyj pęsetę chusteczką Kim. Należy jednak uważać, aby nie zmiażdżyć ani nie przebić oka. Jedną z zalet przeprowadzania tej sekcji w zawieszeniu jest możliwość łatwego zaobserwowania tkanki łącznej oddzielającej się od oka.W końcu dojdziecie do momentu, w którym nie będziecie mogli usunąć więcej tkanki za pomocą pęsety. Zastąpcie pęsetę pod kątem 15 stopni nożyczkami sprężynowymi. Użyjcie nożyczek sprężynowych, aby odciąć nerw wzrokowy.Użyj zewnętrznej krawędzi ostrza, aby przesunąć tkankę do przodu w stronę granicy rogówki i twardówki. Następnie przytnij i delikatnie przetrzyj nożyczki chusteczką Kimwipe. Przyjrzyjmy się temu jeszcze raz.Gdy tkanka odstaje, przesuń ją do przodu w kierunku granicy rogówki i twardówki, używając zewnętrznej krawędzi nożyczek. Przytnij tkankę, kontynuuj przesuwanie jej fragmentów do przodu tępą krawędzią nożyczek, a następnie odcinaj je, aż do usunięcia wszystkich zbędnych tkanek. Na oku zazwyczaj znajdują się dwa pasma twardej tkanki.Pierwszy punkt jest przymocowany w miejscu przejścia rogówki w twardówkę, a drugi jest w trakcie przycinania. To miejsce znajduje się mniej więcej w połowie drogi między przejściem rogówki w twardówkę a głową nerwu wzrokowego. Kolejnym krokiem sekcji jest usunięcie rogówki i soczewki.Za pomocą pęsety pod kątem 45 stopni unieś niewielki fragment rogówki w jej mniej więcej środkowej części. Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe nacięcie u nasady uniesionego fragmentu. Wprowadź dolne ostrze nożyczek w nacięcie pod tęczówkę.Wykonaj cięcie w kierunku granicy rogówki i twardówki, ale nie przecinaj jej. Teraz powoli obróć oko o 360 stopni, wykonując niewielkie cięcia wzdłuż całej obwodu. Staraj się prowadzić nożyczki pod tęczówką, przecinając jednocześnie rogówkę i tęczówkę.Wymaga to wielu ćwiczeń, aby przeprowadzić tę czynność tak sprawnie, jak pokazuję to tutaj. Po usunięciu rogówki należy obrócić oko na bok i delikatnie nacisnąć jego zewnętrzną stronę, wypychając soczewkę. Pozostała struktura będzie miała kształt miseczki.Gałkę oczną należy podzielić na cztery ćwiartki. W tym celu należy ułożyć oko na boku i wprowadzić dolne ostrze nożyczek sprężynowych. Wykonać cięcie podłużne w kierunku tarczy nerwu wzrokowego, nie docinając jednak do niej całkowicie.Aby to zrobić, trzymaj ramiona wzdłuż ciała, a nożyczki przed sobą, mniej więcej prostopadle do ciała i nacięcia oka. Wykonaj drugie nacięcie bezpośrednio naprzeciwko pierwszego. Poświęć czas na odpowiednie ustawienie, aby nacięcie było gładkie.Wykonanie wielu nacięć może spowodować poszarpanie krawędzi, ale przy starannym wyrównaniu nie są one zauważalne; zwróćcie uwagę, że jestem w stanie pracować zgodnie z sferycznym kształtem oka, a nie wbrew niemu, ponieważ oko zachowuje swój naturalny kształt. Po zawieszeniu w PBS reszta sekcji zostanie przeprowadzona na szkiełku przedmiotu. Chwyć oko pęsetą pod kątem 45 stopni i wyjmij je z PBS.Umieść oko na nowym szkiełku przedmiotowym. Używając obu par pęset kątowych, ostrożnie rozprostuj oko. Zauważ, że wokół obwodu oka znajduje się niewielki margines rogówki i tęczówki, który ułatwia manipulację preparatem.Następnie należy przeciąć każdy z czterech płatków na pół. Obróć oko tak, aby jeden z płatków znajdował się prostopadle do Twojego ciała. Chwyć róg płatka za pomocą pęsety wygiętej pod kątem 15 stopni.Lekko unieś, a następnie wykonaj cięcie od miejsca połączenia rogówki z twardówką w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Cięcia te powinny być prostopadłe do stycznej. Styczna to linia prostopadła do średnicy.Zatem cięcia powinny być zgodne z średnicą oka. Teraz obróć preparat tak, aby kolejny płatek był prostopadły do Twojego ciała i powtórz czynność. Chwyć róg płatka.Lekko unieś i przetnij. Powtórz czynność, aż każdy z czterech dużych płatków zostanie przekrojony na pół. Biaława substancja to siatkówka neuronowa, która bezpośrednio pokrywa RPE.Siatkówka nerwowa może chronić RPE, dlatego pozostaw ją nienaruszoną do momentu wykonania wszystkich cięć. Zauważ, że płatki są lekko zakrzywione. Nie próbuj przeciwdziałać temu naturalnemu kształtowi.Poświęć odpowiednią ilość czasu na wyrównanie, aby móc wykonać jedno precyzyjne cięcie. Ze względu na okrągły kształt gałki ocznej istnieje tendencja do jej wybrzuszenia; aby temu zapobiec, można wykonać osiem nacięć pomocniczych.Po jednym na każdym płatku. Zastosuj tę samą podstawową strategię, co w poprzedniej rundzie czterech cięć. Podnieś róg płatka i przetnij go, ale w tym przypadku wykonaj cięcie tylko do około połowy długości płatka.Po wykonaniu wszystkich nacięć można usunąć siatkówkę neuronalną. W tym momencie dodaję kilka kropel 1xPBS do preparatu. Należy zapobiegać wysychaniu RPE.Siatkówka nerwowa powinna być jedynie luźno związana z leżącym pod nią RPE. Widać, że oddziela się ona dość łatwo. Zazwyczaj pozostanie ona jednak przytwierdzona w miejscu przejścia rogówki w twardówkę, co wewnątrz oka stanowi wypukłą krawędź zwaną ciałem rzęskowym.Grot pęsety pod kątem 15 stopni można wprowadzić do główki nerwu wzrokowego, aby przymocować preparat podczas oddzielania siatkówki neuronalnej. Ciało rzęskowe wyznacza krawędź RPE, czyli ciemno pigmentowanej tkanki, która została oddzielona. Tutaj widoczna jest tęczówka, a nie RPE.Zalecam usunięcie jak największej części tęczówki, ponieważ jest ona bardzo lepka i może się zagiąć oraz przykleić do RPE, jeśli siatkówka neuronalna ulega złuszczeniu lub jeśli jej pozostałości pozostaną przyklejone do RPE. Prawdopodobnie wystąpił jeden z dwóch błędów: albo oczy nie zostały prawidłowo utrwalone (np. przez zbyt długi lub zbyt krótki czas), albo były przechowywane zbyt długo przed sekcją.Pedał, który tutaj odsłaniam, nie posiada jeszcze swojego skrótu. Widać, że pedał znajduje się mniej więcej w jednej trzeciej odległości od krawędzi RPE. Właśnie dlatego zalecane jest wykonanie ośmiu skrótów.Po usunięciu całej siatkówki neuronowej, kilkukrotnie przemyj RPE pipetą, używając od 100 do 200 µL PBS, aż do całkowitego usunięcia pyłu i zanieczyszczeń. Nanieś pipetą od 80 do 90 µL 90% glicerolu na nowe szkiełko przedmiotowe, formując prostokąt. Uwaga: jest to optymalna objętość glicerolu dla szkiełka cover glass o wymiarach 22 by 50 mm i powinna być odpowiednio dostosowana.W przypadku innych rozmiarów szkiełek nakrywkowych, należy rozprowadzić glicerol za pomocą końcówki pipety. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do glicerolu. Jeśli pojawi się pęcherzyk, należy przesunąć go do krawędzi, gdzie pęknie.Wsuń dolne ramię pęsety o kącie 15 stopni pod RPE i ostrożnie unieś tkankę, a następnie powoli opuść RPE do glicerolu. RPE będzie unosić się na powierzchni glicerolu i może się nieco zwijać lub skręcać. Użyj pęsety, aby wyprostować RPE i rozprowadzić glicerol po jego powierzchni.Jeśli powstaną pęcherzyki powietrza, przesunij je krawędzią, trzymając szkiełko nakrywowe pod kątem około 45 stopni, aż pękną. Przysuń je do krawędzi glicerolu.Następnie przesuń go w stronę krawędzi szkiełka przedmiotowego. Przytrzymaj dół szkiełka cover glass kciukiem i palcem wskazującym, a przeciwległą krawędź podeprzyj pęsetą 15 stopni. Bardzo powoli opuść szkiełko cover glass w kierunku szkiełka przedmiotowego, aż do momentu nawiązania kontaktu.Gdy szkło zakrywkowe dotknie RPE, należy zaprzestać opuszczania, pozwalając glicerynie na rozprzestrzenienie się, a następnie kontynuować powolne opuszczanie szkła zakrywkowego. Zbyt szybkie opuszczenie szkła zakrywkowego spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza na preparacie. Będę powoli opuszczać szkło zakrywkowe w momencie kontaktu z RPE, aby umożliwić migrację gliceryny.Widać, że gdy zbyt szybko puszczam szkiełko nakrywki, powstają pęcherzyki powietrza. Użyj sporej ilości bezbarwnego lakieru do paznokci, aby przymocować krawędź szkiełka nakrywki do preparatu, prowadząc lakier wzdłuż całego obwodu.Jest to typowy RPE myszy C 57 black. Widoczne naczynia krwionośne w tle, wskazane tutaj, są prawidłowe. Normalne są również pewne różnice w pigmentacji, takie jak obszary wydające się mniej pigmentowane.Jednakże przejrzyste plamy, takie jak ta, są prawdopodobnie wynikiem uszkodzeń fizycznych RPE oraz leżącej pod nim naczyniówki. Ponieważ naczyniówka oka jest również pigmentowana, uszkodzenie czarnego RPE może pozostać niezauważalne, jeśli naczyniówka nie zostanie naruszona.Jest to typowy RPE pochodzący od myszy o rozcieńczonym umaszczeniu. Jak wskazano, widoczne będzie unaczynienie oraz wystąpią pewne różnice w pigmentacji, takie jak ciemniejsze i jaśniejsze plamy. Jednakże, dostrzeżenie uszkodzeń na RPE myszy o rozcieńczonym umaszczeniu jest niemal niemożliwe.Czy te małe plamki to uszkodzenia, czy normalne wariacje pigmentacji? Sugeruję wykonanie barwienia i analizę w celu rozstrzygnięcia tej kwestii. Pozwoli to ocenić, czy nie obchodzą się Państwo zbyt szorstko z próbkami.Barwienie wyraźnie obrysowuje błony komórkowe, co uwidacznia uszkodzone miejsca, jednak w rzeczywistości RPE jest dość odporne i jeśli trzyma się gałkę oczną za rogówkę, mało prawdopodobne jest spowodowanie uszkodzeń. Oto preparat całego organu z licznymi problemami, z których najmniej istotnym wskazanym tutaj jest zbyt szeroki margines rogówki, co może prowadzić do wypaczania się i fałdowania pofalowanego materiału. Widać tutaj również ogromną ilość pozostałej tkanki obcej z tyłu oka.Ten płatek jest częściowo złożony, a tutaj widać, że RPE zostało częściowo rozerwane. Kolejnym problemem jest to, że oko to ma wygląd przypominający wiatraczek. Tutaj zaznaczyłem kąty nacięć.Tak właśnie powinny one wyglądać. Pamiętajcie, że nacięcia powinny być prostopadłe do stycznej i zgodne z linią średnicy. Właśnie zaprezentowałem, jak przeprowadzić sekcję oka myszy w celu przygotowania preparatu całego pigmentu siatkówki.Nabłonek, najważniejsze jest zachowanie prawidłowej postawy, ale należy starać się pozostać rozluźnionym. Mam nadzieję, że ten film okazał się pomocny i życzę powodzenia w przyszłych eksperymentach.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja oka myszy w celu uzyskania pełnego zdjęcia nabłonka barwnikowego siatkówki

Technika sekcji ilustruje proces usuwania ciała szklistego, siatkówki oraz soczewki z oka myszy, ich rozdzielenie za pomocą wirowania oraz charakterystykę z wykorzystaniem analiz białkowych.

Ewisceracja ciała szklistego i siatkówki myszy do analiz proteomicznych

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj technikę sekcji oka myszy w celu uzyskania całego wierzchowca nabłonka barwnikowego siatkówki. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju siatkówki i chorób wzroku.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Przeglądaj więcej filmów