Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Nazywam się Allison Clavon. Jestem asystentką badawczą dr. Alexa Bishopa w Gree Children's Cancer Research Institute w UT Health Science Center w San Antonio w Teksasie. Dzisiaj zaprezentuję, jak przeprowadzić sekcję oka gryzonia w celu pozyskania pełnej ilości nabłonka pigmentowego siatkówki.

Tkanka ta jest istotna dla badań nad rozwojem i chorobami siatkówki, a także stanowi miejsce przeprowadzania testu naprawy DNA sterowanej przez homologię in vivo. Zatem zacznijmy. Oto oko przygotowane do sekcji.

Najpierw przyjrzyjmy się strukturom anatomicznym, które będą służyć jako punkty orientacyjne podczas całej procedury. To oko zwierzęcia poddanego utrwalaniu. Tutaj, z tyłu oka po przeciwnej stronie, znajduje się nerw wzrokowy.

To jest rogówka. Tęczówka jest widoczna przez rogówkę. Biała obszar z tyłu oka to twardówka.

Dlatego obszar ten nazywa się granicą rogówki i twardówki. Pierwszym krokiem preparatyki jest usunięcie tkanek zbędnych, takich jak tkanka łączna mięśni oraz nerw wzrokowy. Następnie należy usunąć rogówkę, wykonując cięcie okrężne.

W tym momencie można wyjąć soczewkę, co spowoduje powstanie pustej oczodołu. Następnie wykonuje się cztery cięcia od granicy rogówki i twardówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Powstała struktura przypomina czteropłatkowy kwiat.

Każdy z tych czterech płatków zostaje następnie przecięty wzdłuż środka, w wyniku czego powstaje struktura przypominająca kwiat o ośmiu płatkach. Na tym etapie materiał może się wygiąć w niektórych obszarach ze względu na jego sferyczny charakter. Aby temu zapobiec i uzyskać bardziej płaski uchwyt otworu, można wykonać osiem krótszych nacięć, przechodzących przez miejsca wygięcia.

Na stanowisku pracy należy przygotować zestaw materiałów, w tym pipetę o objętości 100 lub 200 µL wraz z odpowiednimi końcówkami, szalkę Petriego X-P-B-S-A o średnicy 35 mm, szkiełka i lamelki, 90% glicerol oraz bezbarwny lakier do paznokci do przygotowania preparatów, statyw do suszenia szkiełek, pudełko chusteczek Kim wipes oraz pojemnik na odpady. Oprócz tych podstawowych materiałów niezbędny będzie zestaw specjalistycznych narzędzi do mikrosekcji, w tym pęsetę prostą oraz pęsetę wygiętą pod kątem 45°, służące do podtrzymywania, obracania i ogólnej manipulacji gałką oczną podczas sekcji. Pęsety wygięte pod kątem 15° są skierowane ku górze i również służą do manipulowania gałką oczną.

Na koniec będą potrzebne nożyczki sprężynowe. Bardzo ważne jest użycie nożyczek sprężynowych zamiast nożyczek tradycyjnych. Przed rozpoczęciem tej sekcji upewnij się, że wysokość krzesła jest dostosowana w taki sposób, aby przy wyprostowanej sylwetce Twoje oczy znajdowały się na poziomie okularów.

Zgarbienie się przy mikroskopie powoduje ból barków i pleców oraz obniża jakość przeprowadzonych sekcji. Aby rozpocząć, wlej niewielką ilość XPBS do pokrywki szalki o średnicy 35 milimetrów. Następnie przenieś oczy przeznaczone do sekcji do szalki.

Jest to oko myszy szczepu C 57 black typu dzikiego. Można zauważyć, że jest ono bardzo małe, o średnicy około 3,5 mm. Nieprzezroczystość twardówki nadaje mu niebieskawy odcień.

Pierwszym krokiem sekcji jest usunięcie wszystkich zbędnych tkanek z okolic oka, takich jak tkanka łączna mięśni oraz nerw wzrokowy. W lewej ręce trzymam pęsetę pod kątem 45 stopni, a w prawej pęsetę pod kątem 15 stopni. Można użyć jednej pęsety do stabilizacji oka, podczas gdy drugą odciąga się tkankę.

Gdy oderwie się większy fragment tkanki, ostrożnie przetrzyj pęsetę chusteczką Kim. Należy jednak uważać, aby nie zmiażdżyć ani nie przebić oka. Jedną z zalet przeprowadzania tej sekcji w zawieszeniu jest możliwość łatwego zaobserwowania tkanki łącznej oddzielającej się od oka.

W końcu dojdziecie do momentu, w którym nie będziecie mogli usunąć więcej tkanki za pomocą pęsety. Zastąpcie pęsetę pod kątem 15 stopni nożyczkami sprężynowymi. Użyjcie nożyczek sprężynowych, aby odciąć nerw wzrokowy.

Użyj zewnętrznej krawędzi ostrza, aby przesunąć tkankę do przodu w stronę granicy rogówki i twardówki. Następnie przytnij i delikatnie przetrzyj nożyczki chusteczką Kimwipe. Przyjrzyjmy się temu jeszcze raz.

Gdy tkanka odstaje, przesuń ją do przodu w kierunku granicy rogówki i twardówki, używając zewnętrznej krawędzi nożyczek. Przytnij tkankę, kontynuuj przesuwanie jej fragmentów do przodu tępą krawędzią nożyczek, a następnie odcinaj je, aż do usunięcia wszystkich zbędnych tkanek. Na oku zazwyczaj znajdują się dwa pasma twardej tkanki.

Pierwszy punkt jest przymocowany w miejscu przejścia rogówki w twardówkę, a drugi jest w trakcie przycinania. To miejsce znajduje się mniej więcej w połowie drogi między przejściem rogówki w twardówkę a głową nerwu wzrokowego. Kolejnym krokiem sekcji jest usunięcie rogówki i soczewki.

Za pomocą pęsety pod kątem 45 stopni unieś niewielki fragment rogówki w jej mniej więcej środkowej części. Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe nacięcie u nasady uniesionego fragmentu. Wprowadź dolne ostrze nożyczek w nacięcie pod tęczówkę.

Wykonaj cięcie w kierunku granicy rogówki i twardówki, ale nie przecinaj jej. Teraz powoli obróć oko o 360 stopni, wykonując niewielkie cięcia wzdłuż całej obwodu. Staraj się prowadzić nożyczki pod tęczówką, przecinając jednocześnie rogówkę i tęczówkę.

Wymaga to wielu ćwiczeń, aby przeprowadzić tę czynność tak sprawnie, jak pokazuję to tutaj. Po usunięciu rogówki należy obrócić oko na bok i delikatnie nacisnąć jego zewnętrzną stronę, wypychając soczewkę. Pozostała struktura będzie miała kształt miseczki.

Gałkę oczną należy podzielić na cztery ćwiartki. W tym celu należy ułożyć oko na boku i wprowadzić dolne ostrze nożyczek sprężynowych. Wykonać cięcie podłużne w kierunku tarczy nerwu wzrokowego, nie docinając jednak do niej całkowicie.

Aby to zrobić, trzymaj ramiona wzdłuż ciała, a nożyczki przed sobą, mniej więcej prostopadle do ciała i nacięcia oka. Wykonaj drugie nacięcie bezpośrednio naprzeciwko pierwszego. Poświęć czas na odpowiednie ustawienie, aby nacięcie było gładkie.

Wykonanie wielu nacięć może spowodować poszarpanie krawędzi, ale przy starannym wyrównaniu nie są one zauważalne; zwróćcie uwagę, że jestem w stanie pracować zgodnie z sferycznym kształtem oka, a nie wbrew niemu, ponieważ oko zachowuje swój naturalny kształt. Po zawieszeniu w PBS reszta sekcji zostanie przeprowadzona na szkiełku przedmiotu. Chwyć oko pęsetą pod kątem 45 stopni i wyjmij je z PBS.

Umieść oko na nowym szkiełku przedmiotowym. Używając obu par pęset kątowych, ostrożnie rozprostuj oko. Zauważ, że wokół obwodu oka znajduje się niewielki margines rogówki i tęczówki, który ułatwia manipulację preparatem.

Następnie należy przeciąć każdy z czterech płatków na pół. Obróć oko tak, aby jeden z płatków znajdował się prostopadle do Twojego ciała. Chwyć róg płatka za pomocą pęsety wygiętej pod kątem 15 stopni.

Lekko unieś, a następnie wykonaj cięcie od miejsca połączenia rogówki z twardówką w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Cięcia te powinny być prostopadłe do stycznej. Styczna to linia prostopadła do średnicy.

Zatem cięcia powinny być zgodne z średnicą oka. Teraz obróć preparat tak, aby kolejny płatek był prostopadły do Twojego ciała i powtórz czynność. Chwyć róg płatka.

Lekko unieś i przetnij. Powtórz czynność, aż każdy z czterech dużych płatków zostanie przekrojony na pół. Biaława substancja to siatkówka neuronowa, która bezpośrednio pokrywa RPE.

Siatkówka nerwowa może chronić RPE, dlatego pozostaw ją nienaruszoną do momentu wykonania wszystkich cięć. Zauważ, że płatki są lekko zakrzywione. Nie próbuj przeciwdziałać temu naturalnemu kształtowi.

Poświęć odpowiednią ilość czasu na wyrównanie, aby móc wykonać jedno precyzyjne cięcie. Ze względu na okrągły kształt gałki ocznej istnieje tendencja do jej wybrzuszenia; aby temu zapobiec, można wykonać osiem nacięć pomocniczych.

Po jednym na każdym płatku. Zastosuj tę samą podstawową strategię, co w poprzedniej rundzie czterech cięć. Podnieś róg płatka i przetnij go, ale w tym przypadku wykonaj cięcie tylko do około połowy długości płatka.

Po wykonaniu wszystkich nacięć można usunąć siatkówkę neuronalną. W tym momencie dodaję kilka kropel 1xPBS do preparatu. Należy zapobiegać wysychaniu RPE.

Siatkówka nerwowa powinna być jedynie luźno związana z leżącym pod nią RPE. Widać, że oddziela się ona dość łatwo. Zazwyczaj pozostanie ona jednak przytwierdzona w miejscu przejścia rogówki w twardówkę, co wewnątrz oka stanowi wypukłą krawędź zwaną ciałem rzęskowym.

Grot pęsety pod kątem 15 stopni można wprowadzić do główki nerwu wzrokowego, aby przymocować preparat podczas oddzielania siatkówki neuronalnej. Ciało rzęskowe wyznacza krawędź RPE, czyli ciemno pigmentowanej tkanki, która została oddzielona. Tutaj widoczna jest tęczówka, a nie RPE.

Zalecam usunięcie jak największej części tęczówki, ponieważ jest ona bardzo lepka i może się zagiąć oraz przykleić do RPE, jeśli siatkówka neuronalna ulega złuszczeniu lub jeśli jej pozostałości pozostaną przyklejone do RPE. Prawdopodobnie wystąpił jeden z dwóch błędów: albo oczy nie zostały prawidłowo utrwalone (np. przez zbyt długi lub zbyt krótki czas), albo były przechowywane zbyt długo przed sekcją.

Pedał, który tutaj odsłaniam, nie posiada jeszcze swojego skrótu. Widać, że pedał znajduje się mniej więcej w jednej trzeciej odległości od krawędzi RPE. Właśnie dlatego zalecane jest wykonanie ośmiu skrótów.

Po usunięciu całej siatkówki neuronowej, kilkukrotnie przemyj RPE pipetą, używając od 100 do 200 µL PBS, aż do całkowitego usunięcia pyłu i zanieczyszczeń. Nanieś pipetą od 80 do 90 µL 90% glicerolu na nowe szkiełko przedmiotowe, formując prostokąt. Uwaga: jest to optymalna objętość glicerolu dla szkiełka cover glass o wymiarach 22 by 50 mm i powinna być odpowiednio dostosowana.

W przypadku innych rozmiarów szkiełek nakrywkowych, należy rozprowadzić glicerol za pomocą końcówki pipety. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do glicerolu. Jeśli pojawi się pęcherzyk, należy przesunąć go do krawędzi, gdzie pęknie.

Wsuń dolne ramię pęsety o kącie 15 stopni pod RPE i ostrożnie unieś tkankę, a następnie powoli opuść RPE do glicerolu. RPE będzie unosić się na powierzchni glicerolu i może się nieco zwijać lub skręcać. Użyj pęsety, aby wyprostować RPE i rozprowadzić glicerol po jego powierzchni.

Jeśli powstaną pęcherzyki powietrza, przesunij je krawędzią, trzymając szkiełko nakrywowe pod kątem około 45 stopni, aż pękną. Przysuń je do krawędzi glicerolu.

Następnie przesuń go w stronę krawędzi szkiełka przedmiotowego. Przytrzymaj dół szkiełka cover glass kciukiem i palcem wskazującym, a przeciwległą krawędź podeprzyj pęsetą 15 stopni. Bardzo powoli opuść szkiełko cover glass w kierunku szkiełka przedmiotowego, aż do momentu nawiązania kontaktu.

Gdy szkło zakrywkowe dotknie RPE, należy zaprzestać opuszczania, pozwalając glicerynie na rozprzestrzenienie się, a następnie kontynuować powolne opuszczanie szkła zakrywkowego. Zbyt szybkie opuszczenie szkła zakrywkowego spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza na preparacie. Będę powoli opuszczać szkło zakrywkowe w momencie kontaktu z RPE, aby umożliwić migrację gliceryny.

Widać, że gdy zbyt szybko puszczam szkiełko nakrywki, powstają pęcherzyki powietrza. Użyj sporej ilości bezbarwnego lakieru do paznokci, aby przymocować krawędź szkiełka nakrywki do preparatu, prowadząc lakier wzdłuż całego obwodu.

Jest to typowy RPE myszy C 57 black. Widoczne naczynia krwionośne w tle, wskazane tutaj, są prawidłowe. Normalne są również pewne różnice w pigmentacji, takie jak obszary wydające się mniej pigmentowane.

Jednakże przejrzyste plamy, takie jak ta, są prawdopodobnie wynikiem uszkodzeń fizycznych RPE oraz leżącej pod nim naczyniówki. Ponieważ naczyniówka oka jest również pigmentowana, uszkodzenie czarnego RPE może pozostać niezauważalne, jeśli naczyniówka nie zostanie naruszona.

Jest to typowy RPE pochodzący od myszy o rozcieńczonym umaszczeniu. Jak wskazano, widoczne będzie unaczynienie oraz wystąpią pewne różnice w pigmentacji, takie jak ciemniejsze i jaśniejsze plamy. Jednakże, dostrzeżenie uszkodzeń na RPE myszy o rozcieńczonym umaszczeniu jest niemal niemożliwe.

Czy te małe plamki to uszkodzenia, czy normalne wariacje pigmentacji? Sugeruję wykonanie barwienia i analizę w celu rozstrzygnięcia tej kwestii. Pozwoli to ocenić, czy nie obchodzą się Państwo zbyt szorstko z próbkami.

Barwienie wyraźnie obrysowuje błony komórkowe, co uwidacznia uszkodzone miejsca, jednak w rzeczywistości RPE jest dość odporne i jeśli trzyma się gałkę oczną za rogówkę, mało prawdopodobne jest spowodowanie uszkodzeń. Oto preparat całego organu z licznymi problemami, z których najmniej istotnym wskazanym tutaj jest zbyt szeroki margines rogówki, co może prowadzić do wypaczania się i fałdowania pofalowanego materiału. Widać tutaj również ogromną ilość pozostałej tkanki obcej z tyłu oka.

Ten płatek jest częściowo złożony, a tutaj widać, że RPE zostało częściowo rozerwane. Kolejnym problemem jest to, że oko to ma wygląd przypominający wiatraczek. Tutaj zaznaczyłem kąty nacięć.

Tak właśnie powinny one wyglądać. Pamiętajcie, że nacięcia powinny być prostopadłe do stycznej i zgodne z linią średnicy. Właśnie zaprezentowałem, jak przeprowadzić sekcję oka myszy w celu przygotowania preparatu całego pigmentu siatkówki.

Nabłonek, najważniejsze jest zachowanie prawidłowej postawy, ale należy starać się pozostać rozluźnionym. Mam nadzieję, że ten film okazał się pomocny i życzę powodzenia w przyszłych eksperymentach.