Organotypowe kultury móżdżku: wyzwania apoptotyczne i wykrywanie

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu liganda szybkiego bodźca apoptotycznego na rozwijający się móżdżek myszy typu dzikiego i zmutowanego. Osiąga się to poprzez pierwszą sekcję mózgu myszy typu dzikiego i myszy z nokautem między ósmym a dwunastym dniem po urodzeniu. Drugim krokiem jest pokrojenie mózgów na plastry o grubości 400 mikrometrów i wyizolowanie móżdżku z każdego plasterka.

Trzecim krokiem jest hodowla wycinków móżdżku przez pięć dni, aby upewnić się, że są zdrowe przed wywołaniem śmierci komórki za pomocą szybkiego ligandu. Ostatnim etapem procedury jest analiza wpływu szybkiego liganda w różnych populacjach komórek móżdżku myszy typu dzikiego i myszy z nokautem w oparciu o barwienie immunofluorescencyjne tunelu markera apoptotycznego, w połączeniu z markerami specyficznymi dla typu komórki, takimi jak kalbindyna dla komórek bikini. Główną zaletą kultur życia móżdżku jest to, że pozwala na styl regionalnej struktury móżdżku i jak pierwotne kultury zdysocjowane, w których sieci neuronalne i kilka organizacji są zakłócone.

Tak więc ta sprawa pozwoli odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w neuronaukach, zwłaszcza że mamy do czynienia z typem dzikim i zmutowaną myszą. Można więc studiować rozwój porównawczy, można studiować fizjologię, a także elektrofizjologię i farmakologię. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji szybkiego liganda w przeżyciu móżdżku lub komórki, może być również stosowana w działaniu szybkiego liganda w korze i hipokampie.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ aby uzyskać zdrową lizę móżdżku, bardzo ważne jest, aby jak najszybciej wprowadzić je do hodowli bez narażania ich integralności. Dlatego ważne jest, aby mieć dobre umiejętności preparowania i krojenia przed przystąpieniem do całego procesu. Tam, gdzie to możliwe.

Etapy poniższej procedury należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej przed preparacją. Przygotuj pożywkę płynu mózgowo-rdzeniowego do sekcji mózgu i przygotowania plastrów, a także pożywkę hodowlaną zgodnie z pisemnym protokołem i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w dniu sekcji. Przygotuj płytki do hodowli tkankowych do hodowli plastrów móżdżku.

Dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej w plasterkach do każdego dołka na płytce sześciodołkowej. Następnie użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić wkładki płytki hodowlanej w każdym z nich. Upewnij się, że pod wkładką nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych Ustaw na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na co najmniej dwie godziny, aby wstępnie przygotować pożywkę. Następnie bąbelkuj na zimno. Pożywka płynu mózgowo-rdzeniowego z nasyceniem pożywki karbogenem w postaci gazu karbonowego zmienia pH roztworu i powoduje zmianę koloru z czerwonego na pomarańczowy.

Wlej trochę lodowato zimnego, bąbelkowego podłoża A CSF do sterylnej szalki Petriego i płytki z sześcioma dołkami. Umieść je na lodzie razem z płytką vibrato, która będzie używana do krojenia mózgu. Szalka Petriego zawierająca bąbelkowe, lodowato zimne podłoże A CSF zostanie użyte do wypreparowania mózgu od szczeniaka myszy od P 8 do P 12 po sekcji.

Użyj żyletki, aby wykonać strzałkowe cięcie na jednej półkuli, aby zapewnić płaską powierzchnię do montażu na płycie vibram. Rostralna część kory mózgowej może również zostać przecięta. Osusz schłodzoną płytkę vibram ręcznikiem papierowym.

Następnie dodaj trochę super kleju na scenę i rozprowadź go zygzakiem końcówką tubki super kleju. Aby utworzyć cienką warstwę kleju, użyj szpatułki, aby przenieść mózg do etapu vibrato ze spłaszczoną stroną stykającą się z super klejem. Gdy mózg zostanie przymocowany do płytki vibram, dodaj wystarczającą ilość pożywki A CSF, aby przykryć mózg i dodaj lód poniżej płytki, aby utrzymać go w chłodzie.

Pokrój mózg na plastry o grubości 400 mikrometrów. Następnie użyj plastikowej pipety do makaronu z nacięciem. Poszerzony koniec do przenoszenia plastrów na sześciodołkową płytkę zawierającą pożywkę A CSF na lodzie pracującym pod mikroskopem preparacyjnym.

Użyj dwóch strzykawek insulinowych z igłami o małej średnicy 28 rozmiarów, aby oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Jeśli którykolwiek z plasterków ma super klej na krawędzi, użyj dwóch igieł strzykawki, aby usunąć klej z plasterka. Użyj plastikowej pipety do makaronu z wyciętym, poszerzonym końcem, aby przenieść plastry na wierzch filtrów.

Dodanie od jednego do trzech plasterków na wkładkę upewnia się, że plastry są całkowicie rozciągnięte i że nie pokrywa ich płyn. W razie potrzeby odessać nadmiar pożywki za pomocą pipety inkubowanej, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Po 48 godzinach wymień połowę objętości nośnika na nowy, upewniając się, że pod wkładką nie utknęły pęcherzyki powietrza.

Pozostała oryginalna pożywka zawiera pokrojone w plastry pochodzące czynniki troficzne, które są ważne dla przeżycia komórki. Prowokacja apoptotyczna jest wykonywana po pięciu dniach hodowli. Dodać szybkie agonistyczne przeciwciało JO dwa do pożywki do hodowli komórkowych w studzienkach, które mają być poddane obróbce.

Pozostaw połowę studzienek nietraktowanych jako kontrole. Po upływie 24 godzin odessać pożywkę spod studzienek. Następnie utrwal plastry, pipetując jeden mililitr lodowatego, 4% paraldehydu pod wkładką i jeden mililitr PFA na wierzchu wkładki.

Pozwól plasterkom utrwalić się w PFA, 10 minut temperatury pokojowej po 10 minutach. Odessać PFA i krótko przemyć dwoma mililitrami zimnego pipetowania PBS. Jeden mililitr na górze wkładki i jeden mililitr poniżej wkładki.

Następnie odessać PBS i odpipetować jeden mililitr 20% lodowatego metanolu w PBS pod wkładką i jeden mililitr powyżej wkładki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie odessać 20% metanol ze studzienki i dobrze umyć plasterek i D PBS. Tak jak poprzednio, odpipetuj jeden mililitr 0,5% Triton X 100 w PBS na wierzchu wkładki, a drugi mililitr pod wkładką.

Inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby plastry po przesiąknięciu były permetyczne. Zassać 0,5% Triton X 100 w PBS i odpipetować jeden mililitr 20% BSA w PBS na wierzchu plasterka i jeden mililitr pod plasterkiem. Zablokuj plastry na co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu blokowania użyj czystych nożyczek, aby ostrożnie odciąć kawałek wkładki membranowej przymocowanej do plastra móżdżku. Następnie za pomocą czystych kleszczyków przenieś kawałek membrany do 24-dołkowej płytki zawierającej PBS, odessaj PBS i dodaj 250 mikrolitrów odczynnika tunelowego do każdej studzienki. Upewnij się, że odczynnik pokrywa całą powierzchnię plastra.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w ciemności po upływie godziny. Odessać odczynnik tunelowy ze studzienek i zastąpić 500 mikrolitrami PBS. Chroń płytkę przed światłem i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu umycia.

Powtórz ten proces dwa razy po ostatnim praniu. Odessać PBS i dodać 250 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała kalbindyny w proporcji jeden do 1000 w PBS i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnego dnia.

Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przemywać PB S3 razy przez 10 minut. Następnie dodaj 250 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego jeden do 500 w PBS. Przykryj płytkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubuj przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Umyj plastry trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS i używając podłoża montażowego zawierającego dappy. Zamontuj plastry na szklanym mikroskopie, szkiełku podstawowym i szkiełku nakrywkowym. Zobrazuj plasterki za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając długości fal wzbudzenia 488 nanometrów i 561 nanometrów odpowiednio dla jarmużu, bendina i tunelu.

Ten obraz przedstawia zdrowy wycinek móżdżku. Po dwóch dniach in vitro warstwa ciała komórki wydaje się półprzezroczysta, a ulistniona struktura móżdżku jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem. Po siedmiu dniach in vitro foliowana struktura zdrowego wycinka móżdżku jest nadal widoczna.

Ponadto ciemne ciała komórkowe, prawdopodobnie makrofagi, zwykle pokrywają plasterek. Widoczny tutaj obraz konfokalny jest reprezentatywny dla szybko leczonego wycinka móżdżku. Komórki bikini stają się zielone po zabarwieniu przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym Alexa 4 88.

Komórki apoptotyczne dodatnie pod kątem barwienia tunelowego wydają się czerwone, ponieważ używany zestaw tunelowy jest oznaczony TMR. Czerwone komórki bikini nie pojawiają się w jednym rzędzie, ale w grupie, tworząc podobną strukturę podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o pracy w kapturze do hodowli tkankowej, gdy tylko jest to możliwe, i zminimalizować czas, w którym tkanka mózgowa jest narażona na możliwe zanieczyszczenia, takie jak bakterie lub grzyby.

Korzystając z tej procedury, można zastosować inne metody do tych wycinków, w tym biochemię i analizy elektrofizjologiczne, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat zawartości białka, a także pobudliwości neuronów. Technika ta została pierwotnie opracowana w celu zbadania wpływu szybkiej śmierci komórki w komórkach Perkina przenoszących mutacje, które wpływają na szybki szlak. Komórki okołokończynowe rzadko przeżywają w hodowli pierwotnej.

Tak więc ta procedura była najlepszym podejściem eksperymentalnym. Mam więc nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobry pomysł, jak zrobić plastry beczki cere i jak można badać bodźce apatyczne i ich wpływ na różne typy komórek mózgowych.