Name: Organotypowe kultury móżdżku: wyzwania apoptotyczne i wykrywanie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowych kultur móżdżku myszy i analizy apoptozy wywołanej fast ligand. Technika umożliwia badanie przeżywalności komórek w warunkach zachowanej struktury tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Fundację IPSEN. IMV jest profesorem biologii molekularnej w American Cancer Society i piastuje stanowisko Irwin and Joan Jacobs Chair in Exemplary Life Sciences. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH, Fundacji Leducq, Fundacji Meriaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen/Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation oraz Fundacji H.N. and Frances C. Berger. PAS jest finansowany przez McKnight Endowment Fund for Neuroscience oraz National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Autorzy chcieliby podziękować Markowi Schmittowi. Oprawa graficzna została opracowana przez Jamie T. Simona. Sponsoring został uprzejmie zapewniony przez firmę Invitrogen.

1. Organotypowe hodowle móżdżku:
<ol>
<li>Aby skutecznie wytworzyć organotypowe hodowle móżdżka, należy użyć myszy w wieku od P0-P3 lub P8-P12. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy myszy w przedziale P8-P12, ponieważ ten etap rozwojowy był bardziej odpowiedni dla naszego badania.</li>
<li>Przygotuj zestaw do sekcji oraz pożywkę hodowlaną:
<ol>
<li>Sekcję mózgu i przygotowanie skrawków przeprowadza się w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) o niskiej zawartości sodu, zawierającym 1mM chlorku wapnia, 10mM D-glukozy, 4mM chlorku potasu, 5mM chlorku magnezu, 26mM wodorowęglanu sodu, 246mM sacharozy oraz roztwór czerwieni fenolowej (1:100), pH 7,3. W celu sterylizacji roztworu należy przefiltrować go przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
<li>Skrawki móżdżka hoduje się w 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% inaktywowanym ciepłem surowicy konia, 25mM HEPES, 1mM glutaminy, 5mg/mL glukozy, penicyliny (10 U/mL) i streptomycyny (10 U/mL). Pożywkę należy przefiltrować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie.</li>
</ol>
</li>
<li>Przeprowadź sekcję mózgu w lodowatym medium ACSF, uprzednio napowietrzonym Karbogenem (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla). Należy pamiętać, że nasycenie Karbogenem zmieni pH roztworu, w wyniku czego jego kolor zmieni się z czerwonego na pomarańczowy. Sekcję należy przeprowadzić w jak najkrótszym czasie, uważając, aby nie uszkodzić struktury mózgu.</li>
<li>Przygotuj przekroje mózgu w płaszczyźnie strzałkowej o grubości 40 μm przy użyciu wibrotomu.
<ol>
<li>Wykonaj cięcie strzałkowe żyletką w jednej półkuli, starając się wyciąć jak najmniej z móżdżka; zapewni to płaską powierzchnię do krojenia. Kora służy jedynie jako podparcie w celu ułatwienia krojenia, ale ze względu na ograniczony czas wygodniej jest wyciąć przednią połowę kory żyletką.</li>
<li>Użyj cyjanoakrylanu (Superglue), aby ustabilizować pozycję mózgu na metalowej płytce wibrotomu. Ważne jest, aby schłodzić płytkę na lodzie przed dodaniem kleju i dobrze go rozprowadzić końcówką tubki, tworząc cienką warstwę adhezyjną. W przypadku nadmiaru Superglue, odklei się on od płytki w kontakcie z ACSF, co może doprowadzić do utraty próbki.</li>
<li>Po przymocowaniu mózgu do płytki wibrotomu, dodaj wystarczającą ilość medium ACSF, aby przykryć mózg, i umieść lód pod płytką, aby utrzymać niską temperaturę.</li>
<li>Wytnij skrawki o grubości 40 μm i przenieś je za pomocą plastikowej pipety Pasteura (odciąć końcówkę, aby ją poszerzyć i uniknąć uszkodzenia skrawków) do 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej ACSF na lodzie.</li>
<li>Oddziel móżdżek od reszty mózgu za pomocą dwóch strzykawek insulinowych (strzykawki z cienkimi igłami 28G) pod mikroskopem sekcyjnym. Niektóre skrawki mogą mieć przyczepiony do krawędzi Superglue: jest to moment, w którym należy spróbować go usunąć, ponieważ może on wpływać na żywotność skrawka. Operację tę należy przeprowadzić ostrożnie, aby nie uszkodzić struktury móżdżku.</li>
</ol>
</li>
<li>Przenieś skrawki móżdżku do płytek 6-dołkowych zawierających wkładki do płytek hodowlanych o średnicy 30 mm z porami 0,4 μm. Do każdego dołka dodaj 1 mL pożywki hodowlanej, która została wcześniej przygotowana poprzez inkubację przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2 (w inkubatorze do hodowli komórek). Umieść wkładki na powierzchni pożywki, upewniając się, że pod nimi nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a następnie umieść na wkładkach skrawki móżdżku (1-3 na wkładkę), dbając o to, aby były całkowicie rozwinięte i nie były przykryte cieczą. W razie potrzeby odessaj nadmiar pożywki. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2, wymieniając pożywkę co 2 lub 3 dni. Zaleca się wymianę tylko części pożywki (np. ½ objętości) za jednym razem, ponieważ zużyte medium zawiera pochodne z tkanek czynniki troficzne, które są ważne dla przetrwania komórek.</li>
</ol>
2. Obróbka Fas i barwienie skrawków móżdżku:
<ol>
<li>W eksperymencie z wywoływaniem apoptozy najpierw hodujemy skrawki przez 5 dni, zmieniając medium w 3. dobie in vitro (DIV3). W dniu DIV5 hodowle traktujemy 0,5 μg/mL przeciwciała Jo2 (agonistą Fas), dodając je bezpośrednio do medium, aby uzyskać czyste tło śmierci komórkowej, ponieważ wymiana mediów może indukować pewną śmiertelność w hodowlach. Połowę dołków pozostawiamy niepotraktowanych jako kontrolę.</li>
<li>Po 24 godzinach usuwamy medium spod wkładkek za pomocą odsysania. Aby utrwalić skrawki, dodajemy 1 mL lodowatego 4% PFA pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki. Inkubujemy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po 10 minutach usuwamy PFA i krótko płuczemy zimnym PBS.</li>
<li>Następnie usuwamy PBS i dodajemy 1 mL pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki 20% lodowatego metanolu w PBS i inkubujemy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Ponownie płuczemy PBS i dodajemy 1 mL pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki 0,5% Triton-X-10 w PBS w celu permeabilizacji. Inkubujemy przez minimum 12 godzin w 4°C.</li>
<li>Po permeabilizacji blokujemy 20% BSA w PBS przez minimum 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C. Na tym etapie skrawki można przechowywać w roztworze blokującym przez co najmniej 3 dni w 4°C.</li>
<li>Aby zbarwić skrawki, ostrożnie wycinamy fragment membrany wkładki przytwierdzonej do skrawka móżdżka i przenosimy go na płytki 24-dołkowe zawierające PBS.</li>
<li>Immunobarwienie wykonuje się sekwencyjnie, najpierw odczynnikiem TUNEL przez jedną godzinę, a następnie przeciwciałem przeciwko kalbindynie przez noc.
<ol>
<li>Odsysamy PBS i dodajemy 250 μL odczynnika TUNEL do każdego dołka, upewniając się, że pokrywa on całą powierzchnię skrawka. Inkubujemy w 37°C przez jedną godzinę w ciemności.</li>
<li>Po godzinie usuwamy mieszankę TUNEL i płuczemy PBS trzy razy po 10 minut.</li>
<li>Po ostatnim płukaniu usuwamy PBS i dodajemy 250 μL rozcieńczenia 1/10 przeciwciała przeciwko kalbindynie w PBS i inkubujemy przez noc w 4°C w ciemności.</li>
<li>Usuwamy roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i płuczemy PBS trzy razy po 10 minut.</li>
<li>Dodajemy 250 μL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego 1/50 w PBS i inkubujemy przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Użyty przez nas zestaw TUNEL jest znakowany TMR red, dlatego nasze przeciwciało wtórne dla kalbindyny jest sprzężone z Alexa-48.</li>
<li>Płuczemy trzy razy po 10 minut PBS i montujemy skrawki na szklanym preparacie mikroskopowym, używając medium montażowego zawierającego DAPI.</li>
<li>Wykonujemy obrazowanie skrawków za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając długości fal wzbudzenia 48 nm dla kalbindyny i 561 nm dla TUNEL.</li>
</ol>
</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Głównym wyzwaniem w tym protokole jest możliwość wytworzenia zdrowych kultur przekrojów móżdżku, zwłaszcza że końcowym odczytem będzie śmierć komórkowa. Zdrowa kultura charakteryzuje się półprzezroczystą warstwą ciał komórkowych, co pozwala na obserwację liściastej struktury móżdżku pod mikroskopem (Rycina 1). Po kilku dniach hodowli przekroje zaczynają cieńczeć, a komórki nie-neuronalne mogą migrować poza krawędzie przekroju. Ciemne, okrągłe komórki (najprawdopodobniej makrofagi), które pokrywają przekroje po kilku dniach hodowli, ostatecznie zmniejszą swoją liczebność po 10-14 dniach in vitro (Rycina 2) 5. Ostatecznym dowodem żywotności przekrojów jest barwienie na różne markery komórkowe, takie jak kalbindyna dla komórek Purkinjego. Rycina 3 przedstawia reprezentatywny obraz z mikroskopu konfokalnego warstwy komórek Purkinjego z kilkoma jądrami dodatnimi w teście TUNEL.
Należy wziąć pod uwagę, że nawet jeśli niektóre skrawki poddano stymulacji apoptotycznej, ekspozycja trwała jedynie 24 godziny. Pozwoliło to na wystarczający czas do zaobserwowania fragmentacji DNA w obumierających komórkach za pomocą barwienia TUNEL, jednak wciąż obecna była wyraźna warstwa komórek Purkinjego. 
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Schemat morfologii kolonii bakteryjnych, szalka Petriego, wzrost mikroorganizmów, badania biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zdrowy skrawek móżdżku w 2. dobie in vitro (DIV2). Na tym obrazie widoczna jest półprzezroczysta warstwa ciał komórek oraz liściasta struktura móżdżku w zdrowym preparacie.
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Rozwój embrionalny, obraz mikroskopowy, wczesny embrion żaby, różnicowanie komórkowe, gastrulacja." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Zdrowy skrawek móżdżku w 7. dniu in vitro (DIV 7). Na tym obrazie wciąż można zaobserwować listkowatą strukturę móżdżku oraz ciemne ciała komórkowe.
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Analiza mikroskopowa, fluorescencja tkanki nerwowej, wizualizacja komórek, obraz mikroskopowy, badanie neurobiologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny obraz skrawka móżdżku poddanego działaniu Fas. Ten obraz konfokalny przedstawia komórki Purkinjego zabarwione kalbindyną (kolor zielony) oraz komórki apoptotyczne wykazujące pozytywny wynik w barwieniu TUNEL (kolor czerwony). Komórki Purkinjego nie tworzą pojedynczego rzędu, lecz są skupione, tworząc strukturę przypominającą listek móżdżku.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Wszystkie prace z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami ustalonymi przez IACUC. Instytut Salka jest placówką akredytowaną przez AAALAC.

Metoda ta opisuje jedno z wielu możliwych zastosowań neuronalnych kultur organotypowych i pozwoliła nam na zbadanie wpływu bodźców apoptotycznych w plastrach móżdżka typu dzikiego oraz mutantach.
Najbardziej krytyczną częścią tego eksperymentu jest zdolność do spójnego generowania zdrowych kultur plastrów móżdżku. Kluczowymi czynnikami są technika sekcji i krojenia oraz umiejętność przeprowadzenia protokołu w jak najkrótszym czasie, przy jednoczesnym zachowaniu ostrożności, aby nie uszkodzić plastrów. Innym kluczowym czynnikiem jest przygotowanie i skład pożywek hodowlanych; kultury te są bardzo wrażliwe, dlatego musieliśmy przetestować kilka receptur i marek pożywek. Nawet różne partie surowicy lub wszelkie inne składniki pożywek mogły wpłynąć na żywotność plastrów. Najlepsze wyniki uzyskaliśmy stosując Horse Serum firmy Invitrogen, partia nr 480116.
Po przygotowaniu skrawków móżdżku można badać rozwój móżdżku, elektrofizjologię, przeżywalność komórek samodzielnie lub w odpowiedzi na bodźce apoptotyczne, ekscytotoksyczność lub deprywację tlenu. Badania porównawcze z wykorzystaniem skrawków móżdżku typu dzikiego oraz mutantów dostarczyły cennych informacji na temat wielu aspektów funkcji i rozwoju móżdżku.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórek 6-dołkowe / 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do płytek hodowlanych 30 mm (pory 0,4-&amp;mu;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało chomikie anty-mysie CD95 (Jo2) NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do detekcji śmierci komórek &lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt;, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Kalbindyna D-28k</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało kozie anty-królicze IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypowe hodowle tkanki neuronalnej zostały po raz pierwszy wprowadzone przez Hogue'a w 1947 roku 1,2 i stanowiły przełom w dziedzinie neuronauki. Od tego czasu technika ta została dalej rozwinięta i obecnie istnieje wiele różnych sposobów przygotowywania hodowli organotypowych. Metoda zaprezentowana w niniejszym opracowaniu została zaadaptowana z protokołu opisanego przez Stoppini et al. w zakresie przygotowania skrawków oraz z metody Gogolla et al. w zakresie procedury barwienia 3,4.
Wyjątkową cechą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie różnych części mózgu, takich jak hipokamp czy móżdżek, w ich oryginalnej strukturze, co stanowi znaczną zaletę w porównaniu z kulturami dysocjowanymi, w których cała organizacja komórkowa i sieci neuronalne zostają zaburzone. W przypadku móżdżku jest to jeszcze bardziej korzystne, ponieważ umożliwia badanie komórek Purkinjego, które są niezwykle trudne do uzyskania w formie dysocjowanej kultury pierwotnej. Metoda ta może być stosowana do badania określonych cech rozwojowych móżdżku in vitro, a także do eksperymentów elektrofizjologicznych i farmakologicznych zarówno u myszy typu dzikiego, jak i mutantów.
Opisana tutaj metoda została opracowana w celu zbadania wpływu bodźców apoptotycznych, takich jak ligand Fas, w rozwijającym się móżdżku, z wykorzystaniem barwienia TUNEL do pomiaru apoptycznej śmierci komórek. Jeśli barwienie TUNEL zostanie połączone z markerami specyficznymi dla danego typu komórek, takimi jak kalbindyna dla komórek Purkinjego, możliwe jest ocenienie śmierci komórek w sposób specyficzny dla danej populacji komórkowej. Barwienie na kalbindynę służy również do oceny jakości kultur móżdżku.

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Hodowle organotypowe tkanki neuronalnej zostały po raz pierwszy wprowadzone przez Hogue'a w 1947 roku 1,2 i stanowiły przełom w dziedzinie neuronauki. ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wpływu bodźca apoptotycznego fast ligand w rozwijającym się móżdżku myszy typu dzikiego oraz mutantów. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadzono sekcję mózgu myszy typu dzikiego i knockout w okresie od 8. do 12. dnia po urodzeniu. W drugim kroku mózgi pocięto na plastry o grubości 400 µm, a następnie z każdego plastra wyizolowano móżdżek.Trzecim krokiem jest hodowla skrawków móżdżku przez pięć dni, aby upewnić się, że są one zdrowe przed indukcją śmierci komórkowej za pomocą fast ligand. Ostatnim etapem procedury jest analiza wpływu fast ligand na różne populacje komórek móżdżku u myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem, w oparciu o barwienie immunofluorescencyjne dla markera apoptozy TUNEL, w połączeniu z markerami specyficznymi dla typów komórek, takimi jak kalbindyna dla komórek koszyczkowych. Główną zaletą hodowli skrawków móżdżku jest to, że pozwala ona na zachowanie regionalnej struktury móżdżku, w przeciwieństwie do pierwotnych hodowli dysocjowanych, w których sieci neuronalne i organizacja cellularna zostają zaburzone.Dzięki temu możliwe będzie udzielenie odpowiedzi na kilka kluczowych pytań z zakresu neuronauk, zwłaszcza że dysponuje się myszą typu dzikiego oraz mutantem. Pozwala to na prowadzenie badań nad rozwojem porównawczym, fizjologią, a także elektrofizjologią i farmakologią. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji fast ligand w przeżywalności komórek móżdżku, może być ona również wykorzystana do badania efektów działania fast ligand w korze mózgu i hipokampie.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ aby uzyskać zdrowe lizaty móżdżku, kluczowe jest poddanie ich hodowli tak szybko, jak to możliwe, bez naruszania ich integralności. Dlatego przed przystąpieniem do całego procesu ważne jest opanowanie umiejętności precyzyjnej sekcji i slice'owania tkanek, tam gdzie jest to możliwe.Kroki poniższej procedury należy wykonać w dygestorium do hodowli tkanek przed przystąpieniem do sekcji. Przygotuj pożywkę A CSF do sekcji mózgu i przygotowania skrawków oraz pożywkę do hodowli skrawków zgodnie z protokołem pisemnym i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w dniu sekcji. Przygotuj płytki do hodowli tkanek do hodowli skrawków móżdżku.Do każdego dołka płytki sześciodołkowej dodaj 1 mL pożywki do hodowli skrawków tkankowych. Następnie, używając sterylnej pęsety, umieść wkładki do płytek hodowlanych w każdym dołku. Upewnij się, że pod wkładką nie pozostały pęcherzyki powietrza.Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej dwie godziny, aby wstępnie przygotować medium. Następnie napowietrz lodowate medium CSF gazem carbogenem. Nasycenie medium carbogenem zmienia pH roztworu, co powoduje zmianę koloru z czerwonego na pomarańczowy.Nalać niewielką ilość schłodzonego do temperatury 0°C napowietrzonego medium A CSF do sterylnej szalki Petriego oraz do płytki 6-dołkowej. Umieścić je na lodzie wraz z płytką wibratomu, który będzie wykorzystywany do krojenia mózgu. Szalka Petriego zawierająca napowietrzone, schłodzone do temperatury 0°C medium A CSF będzie służyć do wypreparowania mózgu z mysiego embrionu w wieku od P8 do P12 po przeprowadzeniu sekcji.Za pomocą żyletki wykonaj cięcie strzałkowe w jednej półkuli, aby uzyskać płaską powierzchnię do zamocowania na płytce wibracyjnej. Można również odciąć część rostralną kory. Osusz schłodzoną płytkę wibracyjną za pomocą ręcznika papierowego.Następnie nanieś niewielką ilość superkleju na stoлик i rozprowadź go zygzakiem za pomocą końcówki tubki. Aby utworzyć cienką warstwę kleju, użyj szpatułki, by przenieść mózg na stolik wibratomu, tak aby spłaszczona strona stykała się z superklejem. Po przymocowaniu mózgu do płytki wibratomu, dodaj wystarczającą ilość pożywki A CSF, aby przykryła ona tkankę, a pod płytką umieść lód w celu utrzymania niskiej temperatury.Przetnij mózg na plastry o grubości 400 µm. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, przenieś plastry do płytki 6-dołkowej zawierającej pożywkę A CSF na lodzie, używając do tego plastikowej pipety Pasteura z przyciętym, poszerzonym końcem.Użyj dwóch strzykawek insulinowych z igłami o małej średnicy (rozmiar 28 G), aby oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Jeśli na krawędziach któregokolwiek z plasterków znajduje się superglue, użyj igieł obu strzykawek, aby usunąć klej z plasterka. Użyj plastikowej pipety Pasteura z odciętym i rozszerzonym końcem, aby przenieść plasterki na wierzch filtrów.Dodanie od jednego do trzech plastrów na wkładkę zapewnia, że są one w pełni rozprostowane i nie są przykryte cieczą. W razie potrzeby należy odessać nadmiar medium za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide przez 48 godzin. Po 48 godzinach należy wymienić połowę objętości medium na świeże, upewniając się, że pod wkładką nie uwięzione są pęcherzyki powietrza.Pozostała oryginalna pożywka zawiera wydzielone czynniki troficzne, które są istotne dla przeżycia komórek. Wyzwanie apoptotyczne przeprowadza się po pięciu dniach hodowli. Do pożywki hodowlanej w studzienkach przeznaczonych do traktowania należy dodać szybki przeciwciało agonistyczne JO two.Połowę dołków pozostaw niepoddanych działaniu czynników jako kontrolę. Po upływie 24 godzin odessać pożywkę spod dołków. Następnie utrwalić skrawki, pipetując jeden mililitr lodowatej, 4% paraformaldehidu pod insert oraz jeden mililitr PFA na wierzch insertu.Pozostaw plastry do utrwalenia w PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessaj PFA i krótko przemyj, dodając pipetą dwa mililitry zimnego PBS: jeden mililitr na wkładkę oraz jeden mililitr pod wkładkę.Następnie odessać PBS i nanieść pipetą 1 mL 20% lodowatego metanolu w PBS pod wkładkę oraz 1 mL powyżej wkładki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać 20% metanol z dołka i przemyć przekrój oraz dołek D za pomocą PBS. Podobnie jak wcześniej, nanieść pipetą 1 mL 0,5% Triton X 100 w PBS na górę wkładki oraz kolejny 1 mL pod wkładkę.Inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 4 °C w celu permeabilizacji przekrojów po procesie permeabilizacji. Odessać 0,5% Triton X 100 w PBS i nanieść pipetą 1 ml 20% BSA w PBS na górną powierzchnię przekroju oraz 1 ml pod przekrój. Blokować przekroje przez co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu blokowania, używając czystych nożyczek, ostrożnie wytnij fragment wkładki membranowej przymocowanej do skrawka móżdżku. Następnie za pomocą czystej pęsety przenieś fragment membrany do płytki 24-dołkowej zawierającej PBS, odessij PBS i dodaj 250 µL odczynnika TUNEL do każdego dołka. Upewnij się, że odczynnik pokrywa całą powierzchnię skrawka.Inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę w ciemności. Po upływie godziny odessać odczynnik z dołków i zastąpić go 500 µL PBS. Chronić płytkę przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu przemycia.Powtórz ten proces dwukrotnie po ostatnim płukaniu. Odessaj PBS i dodaj 250 µL przeciwciała przeciwko kalbindynie w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności. Następnego dnia.Odssać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć PBS 3 razy przez 10 minut. Następnie dodać 250 µL przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego 1:500 w PBS. Przykryć płytkę folią aluminiową, aby chronić przed światłem, i inkubować przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej.Przemyj plastry trzykrotnie przez 10 minut w PBS, a następnie użyj medium montażowego zawierającego DAPI. Zamontuj plastry na szkiełku przedmiotowym i nakrywce mikroskopowej. Wykonaj obrazowanie plastrów za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykorzystując długości fal wzbudzenia 488 nanometrów i 561 nanometrów odpowiednio dla kale, bendin i tunnel.Na obrazie przedstawiono zdrowy skrawek móżdżku. Po dwóch dniach in vitro warstwa ciał komórkowych wydaje się półprzezroczysta, a liściasta struktura móżdżku jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem. Po siedmiu dniach in vitro liściasta struktura zdrowego skrawka móżdżku jest nadal widoczna.Dodatkowo, ciemne ciała komórek, prawdopodobnie makrofagi, zazwyczaj pokrywają skrawek. Przedstawiony tutaj obraz konfokalny jest reprezentatywny dla szybko traktowanego skrawka móżdżku. Komórki bikini wykazują zielone barwienie po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie przeciwciała wtórnego sprzężonego z Alexa 4 88.Komórki apoptotyczne wykazujące pozytywny wynik barwienia TUNEL są czerwone, ponieważ zastosowany zestaw TUNEL jest znakowany TMR. Czerwone komórki nie układają się w pojedynczy rząd, lecz tworzą skupiska o strukturze przypominającej klastry. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w dygestorium do hodowli tkankowych, whenever possible, oraz o minimalizowaniu czasu ekspozycji tkanki mózgu na potencjalne zanieczyszczenia, takie jak bakterie lub grzyby.Stosując tę procedurę, do otrzymanych skrawków można zastosować inne metody, w tym analizy biochemiczne i elektrofizjologiczne, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat zawartości białek oraz pobudliwości neuronów. Technika ta została pierwotnie opracowana w celu badania wpływu szybkiej śmierci komórkowej w komórkach Purkinjego wykazujących mutacje wpływające na szybką ścieżkę. Komórki Purkinjeg rzadko przeżywają w kulturze pierwotnej.Niniejsza procedura okazała się najlepszym podejściem eksperymentalnym. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli jasne wyobrażenie o tym, jak przygotować przekroje mózgu oraz jak można badać bodźce apatyczne i ich wpływ na różne typy komórek mózgowych.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kultury Móżdżku Organotypowe: Wyzwania Apoptotyczne i Wykrywanie

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Ten film ilustruje technikę uzyskiwania organotypowych wycinków móżdżku z mózgu szczeniaka myszy i hodowania tych wycinków w pożywkach uzupełnionych składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój móżdżku in vitro. Dodatkowo określone wycinki móżdżku są traktowane badanym związkiem, a zdolność neuroprotekcyjna związku jest analizowana przy użyciu techniki barwienia immunofluorescencyjnego.

Analiza przeżywalności komórek Purkiniego w organotypowych kulturach warstwowych móżdżku

Ten film demonstruje metodę identyfikacji neuronów z mieszanej kultury ziarnistych neuronów móżdżku i komórek glejowych za pomocą podwójnego barwienia dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI), gdzie żywe neurony wydają się zielone, a martwe neurony czerwone.

Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Ten protokół opisuje, jak dokładnie mierzyć żywotność neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) w hodowanych ziarnistych neuronach móżdżku, pierwotnej hodowli neuronalnej używanej jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych.

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Poznaj metodę hodowli organotypowych kultur móżdżku myszy i analizy apoptozy wywołanej fast ligand. Technika umożliwia badanie przeżywalności komórek w warunkach zachowanej struktury tkanek.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Przeglądaj więcej filmów