Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Ogólnym celem tej procedury jest określenie ruchliwości wzmocnionego białka zielonej fluorescencji poprzez pomiar frapu białka w obszarze zainteresowania. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję wektora EGFP w hodowanych neuronach hipokampa szczura. Następnie zapis Fre jest wykonywany w interesującym nas kręgosłupie za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss seven 10.

Szybkość fotowybielania można następnie obliczyć za pomocą oprogramowania Image J i GraphPad Prism. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ruchliwość EGFP w kręgosłupie z hodowanego neuronu hipokampa za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten został opracowany przez Chazena we współpracy ze mną, Ronaldem Petem, a także Ya, Wang Bahar Kisha i starszym autorem oryginalnego artykułu, Robertem Olem, który zmarł w październiku 2009 roku.

Ten film dedykujemy jego pamięci. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dynamiki białek, takie jak tempo obrotu białka będącego przedmiotem zainteresowania w badanym regionie. Rozpocznij tę procedurę od hodowli embrionalnych neuronów hipokampa szczura dnia 18 na pokrytych poli de lizyną 35-milimetrowych szklanych naczyniach dolnych przez 16 do 18 dni in vitro neuronów transfekcyjnych przy użyciu zestawu do transfekcji ssaków Cal Foss technologii klonowania przed rozpoczęciem transfekcji.

Zachowaj oryginalną pożywkę hodowlaną w sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów do późniejszego wykorzystania. Napełnij każdą 35-milimetrową naczynie 1,5 mililitra zmodyfikowanego podłoża orła DOL eco 30 minut przed transfekcją. Następnie połącz 10 mikrogramów P-E-G-F-P-N jednego DNA osocza z 12,4 mikrolitrami dwóch molowych roztworów wapnia i doprowadź całkowitą objętość do 100 mikrolitrów sterylną wodą.

Dodaj mieszaninę DNA DROPWISE do 100 mikrolitrów dwóch x sterty buforowanej soli fizjologicznej. Wirowanie buforu po dodaniu każdej kropli. Po pozostawieniu końcowej mieszaniny w temperaturze pokojowej na 20 minut, dodaj roztwór buforu DNA do inkubowanych neuronów DMEM.

Inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do półtorej godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę zawierającą fosforan wapnia z szalek hodowlanych i umyć komórki DMEM. Powtórzenie mycia DMEM w sumie trzy razy.

Zamień pożywkę DMEM na oryginalną pożywkę hodowlaną przed powrotem do inkubatora. Neurony są wykorzystywane w eksperymencie z frackingiem dwa do czterech dni po transfekcji. Na początek natychmiast zastąp pożywkę hodowlaną w naczyniu ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów roztworem Prewarm Tyro.

Do eksperymentu z frackingiem użyto mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM seven 10. System modułów temperaturowych Zeiss utrzymuje temperaturę, wilgotność i procentową zawartość dwutlenku węgla w systemie roboczym. Upewnij się, że zbiornik na dwutlenek węgla jest podłączony, a butelka na wodę, która służy do równoważenia wilgotności, jest napełniona wodą.

Po ustawieniu mikroskopu znajdź transfekowany, dojrzały dendryt z obiektywem 100x. Jeśli transfekowane komórki w naczyniu są rzadkie, poszukaj żądanej komórki za pomocą obiektywu 40 x. Następnie przełącz się na obiektyw 100 x.

Aby robić zdjęcia, użyj pięciokrotnego zoomu optycznego i rozdzielczości 2 56 na 2 56 pikseli. Aby sfotografować krótki kawałek dendrytu z kilkoma kolcami. Aby przechwytywać obrazy, użyj prędkości nominalnej dziewięć, co zajmuje 0,5 sekundy.

Aby zakończyć skanowanie, ustaw otwór na dwa mikrometry, aby uzyskać silną fluorescencję. Podczas robienia zdjęć staraj się używać niskiej transmisji laserowej, na przykład od jednego do 5%, aby uniknąć fotowybielania całego obrazu. Następnie wybierz grzbiet, który Cię interesuje w tym eksperymencie.

Kolce grzybów o średnicy głowy grzbietu około jednego mikrometra są wybierane do przeprowadzenia eksperymentu z zawijaniem. Wykonaj pięć zdjęć kontrolnych przed wybielaniem, a następnie wybiel interesujący nas kręgosłup 10 razy przy nominalnej 100% transmisji laserowej, uchwyć serię obrazów natychmiast po wybielaniu. Przedział czasu powinien być dostosowany do różnych białek docelowych i różnych schematów eksperymentalnych.

W tym eksperymencie obrazy są rejestrowane co sekundę przez 15 sekund po wybielaniu. Następnie zapisz obrazy, aby przeanalizować dane. Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania Image J, wyrównaj stos obrazów za pomocą narzędzia wyrównanego, tak aby interesujący nas grzbiet nie unosił się i pozostał w tej samej pozycji.

Na obrazie zmierz względną intensywność fluorescencji interesującego nas kręgosłupa, który jest transfekowanym, ale niebielonym obszarem. Zmierz obszar tła na obrazach poklatkowych za pomocą narzędzia do monitorowania intensywności w funkcji czasu na obrazie J. Użyj obszaru niefluorescencyjnego, ponieważ krzywa obszaru tła dopasuj do intensywności fluorescencji za pomocą jednofazowego równania wykładniczego w oprogramowaniu GraphPad Prism lub innym podobnym oprogramowaniu. Na koniec oblicz procentową ruchomą i nieruchomą frakcję fluorescencji. Pokazano.

Oto pomiary szczelinowania fluorescencji EGFP w kręgosłupie z hodowanego neuronu hipokampa. Obszar kontroli grzbietu i tła jest zaznaczony, a czerwony grot strzałki wskazuje czas wybielania zdjęć. Zdjęcia tego samego obszaru zostały wykonane przed i w 0, 1, 5, 10 i 15 sekundzie po wybielaniu zdjęć.

Krzywe FRA fluorescencji EGFP są pokazane w okresie 15 sekund, z kropkami na krzywych reprezentującymi FRA w każdej sekundzie. Krzywe zostały dopasowane za pomocą jednofazowych równań wykładniczych. Średnia fluorescencja przed fotowybielaniem została policzona jako 100%W tym eksperymencie frakcja ruchoma wynosi 87%, a frakcja nieruchoma 13%A.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć ruchliwość białka znakowanego GFP za pomocą techniki FRAPPE.