Name: Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj technikę FRAP do badania dynamiki białek EGFP w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa szczura. Metoda ta pozwala określić frakcję ruchomą i nieruchomą białka w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez program wewnętrzny National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD).

1. Transfekcja neuronów
<ol>
	<li>Hodować neurony hipokampa szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) na naczyniach szklanych MatTek o średnicy 35 mm pokrytych poli-d-lizyną1. W dniach 16-18 in vitro (DIV) przeprowadzić transfekcję neuronów przy użyciu zestawu Clontech CalPhos Mammalian Transfection Kit. Najpierw, na 0,5 godziny przed transfekcją, zastąpić medium hodowlane 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</a> na każde naczynie o średnicy 35 mm. Oryginalne medium hodowlane zachować w sterylnej probówce 15 ml do późniejszego zastosowania (krok 1.6).</li>
	<li>Wymieszać 10 μg plazmidowego DNA pEGFP-N1 ze sterylną wodą H2O (Clontech) oraz 12,4 μl 2 M roztworu wapnia (Clontech) do uzyskania całkowitej objętości 100 μl.</li>
	<li>Mieszaninę z kroku 1.2 dodawać kroplami do 100 μl 2×HBS podczas mieszania 2×HBS w wirówce vorteksowej z umiarkowaną prędkością.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut, a następnie dodać końcową mieszaninę z kroku 1.3 do neuronów inkubowanych w DMEM.</li>
	<li>Przenieść neurony z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C na 1-1,5 godziny.</li>
	<li>Usunąć medium zawierające fosforan wapnia, a następnie trzykrotnie przemyć komórki podłożem DMEM. Przed ponownym umieszczeniem naczynia hodowlanego w inkubatorze, wymienić podłoże DMEM na oryginalne medium hodowlane.</li>
</ol>
2. Eksperyment FRAP na kolcu dendrytycznym
<ol>
	<li>Do eksperymentu FRAP wykorzystuje się neurony od dwóch do czterech dni po transfekcji.</li>
	<li>Wymień pożywkę w szalkach z szklanym dnem o średnicy 35 mm, dodając natychmiast uprzednio ogrzany roztwór Tyrode'a, który zawiera (w mM) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, glukozę 10, glicynę 0,005, CaCl2 2,6 oraz MgCl2 1,3 (pH dostosowane do 7,4 za pomocą NaOH).</li>
	<li>Do eksperymentu FRAP wykorzystuje się konfokalny mikroskop Zeiss LSM 710. System Zeiss TempModule służy do kontroli temperatury (37°C), wilgotności i stężenia CO2 (5%) w układzie roboczym. Upewnij się, że butla z CO2 jest podłączona, a butelka z wodą, służąca do stabilizacji wilgotności, jest pełna.</li>
	<li>Za pomocą obiektywu 100× (αplan-APOCHROMAT 100×/1,46 oil) zlokalizuj dojrzały,y transfekowany dendryt. Jeśli transfekowane komórki w szalce są rzadkie, wyszukaj odpowiednią komórkę za pomocą obiektywu 40× (plan-NEOFLUAR 40×/1,3 oil), a następnie przełącz na obiektyw 100× w celu wykonania obrazowania.</li>
	<li>Użyj 5-krotnego zoomu optycznego oraz rozdzielczości 256×256 pikseli, aby zobrazować krótki odcinek dendrytu z kilkoma kolcami. Do przechwytywania obrazów użyj prędkości nominalnej 9 (czas przebywania piksela 3,15 μsec), co pozwala na zakończenie skanowania w 0,5 sekundy. Pinhole ustawiono na 2μm w celu uzyskania silnej fluorescencji. Podczas obrazowania staraj się stosować niską transmisję lasera, np. 1-5%, aby uniknąć fotobleachingu całego obrazu.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię kolce. W naszym eksperymencie wybieramy kolce grzybowate o średnicy główki ok. 1 μm.</li>
	<li>Aby przeprowadzić eksperyment FRAP, wykonaj 5 obrazów kontrolnych przed wybielaniem, następnie wybiel wybrany kolce 10-krotnie przy nominalnej 100% transmisji lasera [moc lasera argonowego wynosi 30 mW, z czego 50% (15 mW) przypada na linię lasera 488, a do mikroskopu dociera około 3-4 mW przez linię lasera 488], a następnie wykonaj serię obrazów bezpośrednio po wybielaniu. W tym eksperymencie obrazy są przechwytywane co 1 sekundę przez 15 sekund po wybielaniu. Przedział czasowy należy dostosować do różnych białek docelowych i różnych projektów eksperymentalnych (Rys. 1).</li>
	<li>Zapisz obrazy.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz obrazy w programie ImageJ.</li>
	<li>Wyrównaj stos obrazów za pomocą narzędzia do wyrównywania ('plugins' →'stacks - shuffling' →'align slices in stack' →'translation' i/lub 'rigid body') w ImageJ, tak aby analizowana kolca nie „pływała”, innymi słowy – aby pozostawała w tej samej pozycji na obrazie.</li>
	<li>Zmierz względną intensywność fluorescencji analizowanej kolca (Fs), regionu przetransfekowanego, ale niewybielonego (kontrola) oraz regionu tła (Fb) na obrazach z serii czasowej, korzystając z narzędzia 'Intensity v Time Monitor' w ImageJ ('plugins' →'stacks - shuffling' →'Intensity v Time Monitor'). Region kontrolny może stanowić fragment dobrze ostrzonego dystalnego dendrytu. Region tła to obszar niefluorescencyjny.</li>
	<li>Oblicz szybkość fotowybielania (r), porównując fluorescencję regionu kontrolnego przed (Fc0) i po (Fc) fotowybielaniu. 
	r = Fc/Fc0.</li>
	<li>Znormalizuj intensywność fluorescencji docelowej kolca (F) w następujący sposób: 
	F = (Fs - Fb) / r.</li>
	<li>Dopasuj krzywą intensywności fluorescencji docelowej kolca za pomocą jednofazowego równania wykładniczego w programie Graphpad Prism (Rys. 2) lub innym podobnym oprogramowaniu.</li>
	<li>Oblicz frakcję mobilną (fm) i frakcję niemobilną (fi) za pomocą następujących równań: 
	fm = F∞/ F0, 
	gdzie F∞ to intensywność fluorescencji po pełnym powrocie, a F0 to intensywność fluorescencji przed fotowybielaniem. 
	fi = 1 - fm. </li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszym badaniu przeprowadzamy eksperyment FRAP na dojrzałych neuronach hipokampa. W 18-22 DIV utworzone są już kolce grzybiaste. Dzięki zastosowaniu naszej metody można rejestrować dynamiczne zmiany natężenia fluorescencji w małym obszarze, takim jak kolce dendrytyczne.
Aby przeanalizować proces odzyskiwania fluorescencji EGFP, wykonujemy 5 obrazów kontrolnych przed wybielaniem, a następnie 1 obraz co 1 sekundę bezpośrednio po wybielaniu przez 15 sekund. Rozdzielczość obrazu jest wystarczająca do analizy ilościowej. Profile odzyskiwania fluorescencji znakowanych białek fluorescencyjnych są wysoce powtarzalne.
Krótko przedstawiamy również sposób określania frakcji mobilnej i niemobilnej białka fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania ImageJ oraz Graphpad Prism. Metoda FRAP i analiza zaprezentowana w tym materiale mogą znaleźć szerokie zastosowanie w neuronauce, biologii komórki oraz innych badaniach.
<img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse pokazująca dynamiczne procesy komórkowe w odstępach 15-sekundowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Pomiary FRAP fluorescencji EGFP w kolcu hodowanego neuronu hipokampa. Czerwone groty strzałek wskazują czas fotobleakingu. Zdjęcia przedstawiają ten sam obszar przed (Pre) oraz w 0, 1, 5, 10, 15 sekundach po fotobleakingu. Obszar kolca, kontrola i tło są oznaczone odpowiednio literami S, C i B. Neurony były utrzymywane w temperaturze 37°C podczas eksperymentu. Pasek skali, 1 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Wykres analizy FRAP przedstawiający powrót fluorescencji w czasie z porównaniem danych znormalizowanych i oryginalnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Krzywe FRAP fluorescencji EGFP w okresie 15 sekund. Linia zielona przedstawia krzywą oryginalną; linia czerwona przedstawia krzywą znormalizowaną. Punkty na krzywych wskazują pomiary FRAP co 1 s. Krzywe zostały dopasowane za pomocą jednofazowych równań wykładniczych. Średnią fluorescencję przed fotowybielaniem przyjęto za 100%. W tym doświadczeniu frakcja ruchoma (MF) wynosi 94%, a frakcja nieruchoma (IF) 6%.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Analiza FRAP jest szeroko stosowana w badaniach in vivo oraz in vitro1-2. Technika ta powszechnie wykorzystuje <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Białka fuzyjne">białka fuzyjne</a> GFP, choć mogą być również stosowane białka fuzyjne z czerwonych alg3. Analiza ta jest czuła i może być wykorzystana do charakteryzowania mobilności białek znakowanych GFP.
Aby uzyskać wiarygodną analizę FRAP, należy unikać niepotrzebnego fotoblaknięcia przed i w trakcie eksperymentu FRAP. Można to osiągnąć na dwa sposoby. Po pierwsze, proces wyszukiwania i obserwacji badanego neuronu powinien być szybki. W szczególności długotrwała obserwacja neuronów przy użyciu obiektywu 100X powoduje znaczne wyblaknięcie fluorescencji. Po drugie, wysoka moc lasera oraz częste skanowanie często zwiększają prawdopodobieństwo fotoblaknięcia. W związku z tym konieczne będzie obliczenie szybkości fotoblaknięcia w obszarze kontrolnym, a następnie normalizacja krzywej FRAP w obszarze badawczym. Metoda normalizacji została opisana w protokole (szczegóły w krokach 3.3-3.5).
Etap fotowybielania jest również krytyczny dla zapewnienia dobrych wyników FRAP. W tym eksperymencie wybielamy interesującą nas kolbę dendrytyczną 10 razy przy 100% transmitancji lasera. Warunek ten jest wystarczający, aby wybielić fluorescencję kolby do poziomu tła w preparacie utrwalonym. W związku z tym ustawiamy intensywność fluorescencji na tę samą wartość, co tło w 0 sekundach po fotowybielaniu. W zależności od prędkości pierwszego skanu, w przypadku białek o wysokiej mobilności, może zostać wykryty już znaczny stopień powrotu fluorescencji.
W celu badania dynamiki białek za pomocą techniki FRAP opracowano wiele fluorescencyjnych sond białkowych. Podejściem komplementarnym jest na przykład zastosowanie fotoaktywnego białka GFP (PA-GFP) lub jego fotokonwertowalnych wariantów. Wraz z techniką FRAP narzędzia te stają się niezastąpione w badaniach obrazowania żywych komórek4-6.

<table><tbody><tr><td>szalki z szklanym dnem 35 mm</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji ssaczych CalPhos Mammalian Transfection Kit</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pEGFP-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>konfokalny mikroskop Zeiss</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>system Zeiss TempModule</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Graphpad Prism</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (frap) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Metoda FRAP jest wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych GFP. Przy użyciu silnego lasera wzbudzającego dochodzi do wybielenia fluorescencji białka znakowanego GFP w obszarze zainteresowania. Fluorescencja w tym obszarze powraca, gdy niezawybielone białko znakowane GFP z zewnątrz dyfunduje do obszaru zainteresowania. Mobilność białka jest następnie analizowana poprzez pomiar szybkości powrotu fluorescencji. Technika ta może być stosowana do charakteryzacji mobilności białek oraz szybkości ich wymiany.
W niniejszym badaniu wykazujemy ekspresję wektora (ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego) EGFP w hodowlach neuronów hipokampa. Przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss 710 przeprowadzamy fotowybielanie sygnału fluorescencji białka GFP w pojedynczym kolcu dendrytycznym, a następnie wykonujemy obrazy w odstępach czasowych (time-lapse), aby zarejestrować powrót fluorescencji po fotowybielaniu. Na koniec szacujemy procentowy udział frakcji mobilnej i nieruchomej GFP w kolcach, analizując dane obrazowe za pomocą oprogramowania ImageJ oraz Graphpad.
Niniejszy protokół FRAP przedstawia sposób przeprowadzenia podstawowego eksperymentu FRAP, a także metodę analizy uzyskanych danych.

Metoda FRAP była wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych zieloną białko fluorescencyjnym (GFP) w hodowlach komórkowych. Zbadaliśmy frakcje mobilne i niemobilne GFP, analizując procent odzysku fluorescencji po fotowybielaniu. W niniejszym badaniu FRAP przeprowadzono w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Metodę FRAP stosowano do ilościowego określania mobilności białek znakowanych GFP. Przy użyciu silnego lasera wzbudzającego fluorescencja białka znakowanego GFP zostaje wygaszona...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie mobilności ulepszonego białka zielonej fluorescencji poprzez pomiar FRAP tego białka w wybranym obszarze zainteresowania. Jest to realizowane poprzez uprzednią transfekcję wektora EGFP w hodowlanych neuronach hipokampa szczura. Następnie przeprowadzono pomiar FRAP w wybranym kolcu dendrytycznym przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710.Szybkość fotoblaknięcia można następnie obliczyć przy użyciu oprogramowania Image J oraz GraphPad Prism. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące mobilność EGFP w kolcu hodowanego neuronu hipokampa za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten został opracowany przez Chazena we współpracy ze mną, Ronaldem Petem, a także z Ya, Wang Bahar Kishą oraz głównym autorem oryginalnej publikacji, Robertem Olem, który zmarł w październiku 2009 roku.Poświęcamy to wideo jego pamięci. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny dynamiki białek, takie jak tempo wymiany interesującego białka w wybranym obszarze. Rozpocznij tę procedurę od hodowli neuronów hipokampa szczura w 18. dniu embrionalnym na szalkach Mattec z dnem szklanym o średnicy 35 milimetrów pokrytych poli-L-lizyną; w 16. do 18. dnia in vitro przetransfekuj neurony, używając zestawu do transfekcji ssaczych komórek Clone Tech CalFOSS przed rozpoczęciem transfekcji.Oryginalną pożywkę hodowlaną należy przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 ml do późniejszego wykorzystania. Na 30 minut przed transfekcją każdą szalkę 35 mm należy napełnić 1,5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle od DOL eco. Następnie 10 µg plazmidowego DNA P-E-G-F-P-N należy połączyć z 12,4 µl 2 M roztworu chlorku wapnia i uzupełnić całkowitą objętość do 100 µl wodą sterylną.Dodawać mieszaninę DNA KROPLOWO do 100 µL dwukrotnego roztworu PBS (phosphate buffered saline). Po dodaniu każdej kropli należy wymieszać bufor za pomocą vortexa. Po pozostawieniu końcowej mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 20 minut, dodać roztwór DNA w buforze do neuronów inkubowanych w DMEM.Inkubować neurony w temperaturze 37 °C przez jedną do półtorej godziny. Po inkubacji usunąć z naczyń hodowlanych pożywkę zawierającą fosforan wapnia i przemyć komórki medium DMEM. Powtórzyć przemywanie DMEM łącznie trzy razy.Przed powrotem do inkubatora wymień podłoże DMEM na oryginalne podłoże hodowlane. Neurony są wykorzystywane do eksperymentu z frakcjonowaniem od dwóch do czterech dni po transfekcji. Na początek natychmiast zastąp podłoże hodowlane w szklanej naczyniowej płytce o średnicy 35 mm podgrzanym wcześniej roztworem Tyro.Do eksperymentu wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM 710. System modułów temperaturowych Zeiss utrzymuje temperaturę, wilgotność oraz procentową zawartość dwutlenku węgla w układzie roboczym. Należy upewnić się, że butla z dwutlenkiem węgla jest podłączona, a butelka z wodą, służąca do regulacji wilgotności, jest napełniona wodą.Po przygotowaniu mikroskopu, za pomocą obiektywu 100x należy odnaleźć dojrzały, przetransfekowany dendryt. Jeśli przetransfekowane komórki w naczyniu są rzadkie, należy wyszukać odpowiednią komórkę za pomocą obiektywu 40x, a następnie przełączyć na obiektyw 100x.Aby zarejestrować obrazy, należy zastosować pięciokrotny zoom optyczny i rozdzielczość 256 na 256 pikseli. Służy to do obrazowania krótkiego fragmentu dendrytu z kilkoma kolcami. Do rejestracji obrazów należy użyć nominalnej prędkości dziewięć, co zajmuje 0,5 sekundy.Aby zakończyć skanowanie, ustaw otwór pinhole na 2 µm w celu uzyskania silnej fluorescencji. Podczas wykonywania obrazów staraj się używać niskiej transmisji lasera, na przykład od 1 do 5%, aby uniknąć fotowybielania całego obrazu. Następnie wybierz kolcem interesujący w tym eksperymencie.Do przeprowadzenia eksperymentu z owinięciem (wrap experiment) wybrano kolce grzybiastych o średnicach główek wynoszących około 1 µm. Przed wybielaniem należy wykonać pięć obrazów kontrolnych, a następnie wybielić wybrany kolec 10 razy przy nominalnej transmisji lasera 100%, rejestrując serię obrazów bezpośrednio po wybielaniu. Odstępy czasu powinny być dostosowane do różnych białek docelowych oraz różnych schematów doświadczalnych.W tym doświadczeniu obrazy są rejestrowane co sekundę przez 15 sekund po wybieleniu. Następnie należy zapisać obrazy w celu analizy danych. Otwórz obrazy w oprogramowaniu Image J i wyrównaj stos obrazów za pomocą narzędzia do wyrównywania (align), tak aby analizowany rdzeń nie przemieszczał się i pozostawał w tej samej pozycji.Na obrazie zmierz względną intensywność fluorescencji kolca, który jest obszarem przetransfekowanym, ale nie wybielonym. Zmierz region tła na obrazach time-lapse, korzystając z narzędzia monitorowania intensywności w czasie w programie ImageJ. Jako region tła wykorzystaj obszar niewykazujący fluorescencji. Dopasuj intensywność fluorescencji za pomocą jednofazowego równania wykładniczego w oprogramowaniu GraphPad Prism lub innym podobnym programie. Na koniec oblicz procentową frakcję mobilną i niemobilną fluorescencji. Przedstawiono.Poniżej przedstawiono pomiary FRAP fluorescencji EGFP w kolcu dendrytycznym hodowanego neuronu hipokampa. Oznaczone są obszary kontrolne kolca oraz tła, a czerwona strzałka wskazuje moment fotowybielania. Zdjęcia tego samego obszaru wykonano przed oraz w 0, 1, 5, 10 i 15 sekundach po fotowybielaniu.Krzywe FRA fluorescencji EGFP przedstawiono w okresie 15 sekund, przy czym kropki na krzywych reprezentują FRA w każdej sekundzie. Krzywe dopasowano za pomocą jednofazowych równań wykładniczych. Średnią fluorescencję przed fotoblaknięciem przyjęto za 100%. W tym eksperymencie frakcja mobilna wynosi 87%, a frakcja nieruchoma 13%A.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru mobilności białka znakowanego GFP przy użyciu techniki FRAPPE.

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Odzyskiwanie fluorescencji po fotobielczeniu (FRAP) białek oznaczonych fluorescencją w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampu

W niniejszym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji z wykorzystaniem wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Rozpoczniemy od ustawienia lasera wzdłuż drogi optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie przejdziemy do generowania i wreszcie dopasowywania krzywych odzyskiwania fluorescencji.

Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Autofluorescencja tła próbek biologicznych często komplikuje techniki obrazowania oparte na fluorescencji, szczególnie w starszych ludzkich tkankach postmitotycznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób autofluorescencja z tych próbek może być skutecznie usunięta za pomocą dostępnego na rynku źródła światła z diodą elektroluminescencyjną do fotowybielania próbki przed barwieniem immunologicznym.

Prosta eliminacja fluorescencji tła w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej formaliną do mikroskopii immunofluorescencyjnej

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Opisujemy kompleksowy i praktyczny protokół odzyskiwania fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem na żywych komórkach. Chociaż protokół został wykorzystany do pomiaru ruchliwości p62 znakowanego żółtym białkiem fluorescencyjnym w strukturach indukowanych agresomem, można go zastosować do różnych systemów mikroskopowych i białek fluorescencyjnych.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego Oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami

Poznaj technikę FRAP do badania dynamiki białek EGFP w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa szczura. Metoda ta pozwala określić frakcję ruchomą i nieruchomą białka w żywych komórkach.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów