Name: Poklatkowe obrazowanie na żywo klonalnie powiązanych nerwowych komórek progenitorowych w rozwijającym się przodomózgowiu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji i poklatkowej mikroskopii konfokalnej do obrazowania klonalnie powiązanych komórek progenitorowych w rozwijającym się przodomózgowiu Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH NS042626. Dziękujemy Kurtowi Thornowi oraz centrum obrazowania UCSF Nikon Imaging center za pomoc w obrazowaniu.

1. Przygotowanie embrionów danio pręgowanego
<ol>
 <li>Na dwa dni przed elektroporacją przygotować klatki do krzyżowania ryb typu dzikiego, stosując przegrody oddzielające samce od samic.</li>
 <li>Na jeden dzień przed elektroporacją usunąć przegrody z klatek do krzyżowania przygotowanych poprzedniego dnia.</li>
 <li>Zebrać embriony i inkubować 50 zapłodnionych embrionów w 30 ml pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% fenylotiomocznika (PTU) w temperaturze 28,5°C.</li>
 <li>W dniu elektroporacji, gdy embriony osiągną stadium rozwojowe 22 hpf, przeprowadzić manualną dechorionację za pomocą precyzyjnej pęsety (Inox 5, Dumont Electronic, Szwajcaria). Następnie przenieść embriony do 10 ml roztworu Ringera do elektroporacji3 (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) zawierającego 0,003% PTU.</li>
 <li>Do 10 ml roztworu Ringera do elektroporacji dodać 420 μl roztworu zapasu trikainy (4 mg/ml), aby znieczulić embriony.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do elektroporacji
<ol>
 <li>Szklane igły do iniekcji zostały wyciągnięte z kapilar (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, z włóknem) za pomocą wyciągarki Flaming-Brown P897 (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). Końcówkę igły odłamano pęsetą, aby uzyskać ostry koniec, jak pokazano na rysunku 1D. Średnica końcówki powinna wynosić około 10 μm, a kąt zwężenia około 30 stopni.</li>
 <li>Przygotować 0,8% i 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (Shelton Scientific, Inc. katalog #IB70050) w roztworze Ringera do elektroporacji. Rozdzielić roztwór agarozy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Przechowywać alikwoty w bloku grzewczym w temperaturze ~37°C.</li>
 <li>System Gal4/UAS jest wykorzystywany do sterowania ekspresją genów w komórkach progenitorowych neuronów w elektroporowanych embrionach. Używa się dwóch plazmidów: plazmidu EF1α-GFF-PT2KXIG, w którym Gal4FF jest sterowany przez powszechny promotor EF1α, oraz plazmidu UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.</li>
 <li>Przygotować DNA plazmidowe EF1α-GFF-PT2KXIG oraz UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG, korzystając z zestawu GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).</li>
 <li>Następnie plazmidy są zagęszczane poprzez wytrącanie octanem sodu/etanolem do końcowego stężenia 1-2 μg/μl w 10 mM Tris·Cl (pH 8,5).</li>
 <li>Zmieszać oba plazmidy i rozcieńczyć wodą H2O wolną od nukleaz do końcowego stężenia 500 ng/μl dla każdego plazmidu. W celu wizualizacji dostarczenia zaleca się dodanie do roztworu czerwieni fenolowej (rozcieńczonej 1/10 całkowitej objętości). Roztwór DNA przechowywać w lodzie.</li>
 <li>Bezpośrednio przed elektroporacją napełnić igłę do iniekcji od tyłu 2 μl roztworu DNA i ustawić objętość iniekcji na 2 nl.</li>
</ol>
3. Elektroporacja
<ol>
 <li>Stereomikroskop sekcyjny (Zeiss Stemi 2000 z maksymalnym powiększeniem 50x), injektor pneumatyczny (mikroinjektor Narishige IM 300), dwa mikromanipulatory (WPI M3301R, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) oraz stymulator elektryczny (stymulator impulsów prostokątnych SD9, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) zostają ustawione zgodnie z rysunkiem 1A.</li>
 <li>Aby zamontować zarodki, zanurz 2 zarodki w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie niezwłocznie wyjmij zarodki z agarozy za pomocą szklanej pipety.</li>
 <li>Umieść zarodki na odwróconej plastikowej pokrywce szalki Petriego w oddzielnych kroplach agarozy. Przed zastygnięciem agarozy delikatnie ustaw zarodki za pomocą sondy światłowodowej w pozycji grzbietem do góry, tak aby przedmózgowie było dostępne dla elektrod i igły do mikroiniekcji (rysunek 1B). Zarodki muszą być zamocowane w oddzielnych kroplach agarozy.</li>
 <li>Manipuluj elektrodami za pomocą lewego mikromanipulatora. Wprowadź elektrody do agarozy, jak pokazano na rysunku 1B. Do elektroporacji używa się specjalnie wykonanych równoległych elektrod bipolarnych z platyny i irydu o średnicy 125 μm i odstępie 500 μm (FHC, nr katalogowy #PBSA0575).</li>
 <li>Wprowadź igłę do mikroiniekcji do komory przedmózgowia i wstrzyknij 4nl mieszanki DNA, obserwując przepływ czerwonego płynu oraz pęcznienie komory.</li>
 <li>Następnie ręcznie przyłóż jeden impuls o napięciu 28.5 V trwający 1 milisekundę. Potem zmień polaryzację i przyłóż kolejny impuls 28.5 V trwający 1 milisekundę. Doprowadzi to do bilateralnego mozaikowego znakowania komórek progenitorowych przedmózgowia.</li>
 <li>Po elektroporacji 10 zarodków dodaj 5ml pożywki embrionalnej, aby przykryć zarodki, a następnie odklej agarozę mikronóżem chirurgicznym, aby uwolnić zarodki.</li>
 <li>Przenieś elektroporowane zarodki do nowej szalki zawierającej 30 ml pożywki embrionalnej z 0.003% PTU i inkubuj w temperaturze 28.5°C.</li>
</ol>
4. Montowanie i obrazowanie live w trybie time-lapse
<ol>
 <li>Około 4 godziny po elektroporacji sygnał EGFP jest widoczny pod mikroskopem stereotypowym z epifluorescencją.</li>
 <li>Pięć godzin po elektroporacji należy wybrać zarodki z silną, choć wysoce mozaikową ekspresją EGFP w obszarze przedmózgowia.</li>
 <li>Wybrane zarodki należy przenieść do 10 ml pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% PTU.</li>
 <li>Do 10 ml pożywki embrionalnej należy dodać 420 μl roztworu tricainy (4 mg/ml) w celu znieczulenia zarodków.</li>
 <li>Aby zamocować zarodki, należy zanurzyć jeden zarodek w 0,8% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie należy niezwłocznie wyjąć zarodek z agarozy za pomocą szklanej pipety i umieścić go w centrum szklanej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm (MatTek corporation, Part# P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a>).</li>
 <li>Przed zastygnięciem agarozy należy delikatnie ustawić zarodki w pozycji grzbietem do góry za pomocą sondy światłowodowej.</li>
 <li>Szalkę należy odpowiednio umieścić na stoliku mikroskopu konfokalnego z kontrolą temperatury, jak pokazano na rysunku 1C (stosujemy spektralny mikroskop konfokalny Nikon C1 z obiektywami pionowymi). Temperaturę należy ustawić na 28,5°C.</li>
 <li>Należy dodać 3 ml podgrzanej do 28,5°C pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% PTU, aby przykryć zarodek. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.</li>
 <li>Należy przeprowadzić obrazowanie żywych tkanek w trybie time-lapse z ustalonym odstępem czasu, używając obiektywu zanurzeniowego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Na Rysunku 2 przedstawiono wybrane klatki z obrazowania konfokalnego na żywo w trybie poklatkowym zarodka poddanego elektroporacji EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP w 22 hpf.
<img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Układ mikroskopowy do pomiaru wzbudzenia optycznego; obejmuje jednostki sterujące, mikroskop i detektory." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ aparatury. (A) Zestaw urządzeń do elektroporacji: stymulator impulsów prostokątnych Grass SD9 (i), lewy mikromanipulator (ii), elektrody (iii), stereomikroskop Zeiss (iv), igła do iniekcji (v), prawy mikromanipulator (vi) oraz mikroinjektor Narishige IM 300 (vii). (B) Położenie względne elektrod (i), komory mózgu przedniego (ii) i igły do iniekcji (iii). Zauważmy, że do komory mózgu przedniego wstrzyknięto czerwony roztwór DNA. (C) Zestaw do obrazowania żywych tkanek na mikroskopie konfokalnym Nikon C1: kontroler temperatury (i), obiektyw z zanurzeniem w wodzie (ii) oraz poddany elektroporacji embrion zatopiony w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem (iii). (D) Obraz dociągniętej i odciętej igły do mikroiniekcji DNA.
<img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Sekwencja mikroskopii fluorescencyjnej podziału komórkowego, pokazująca etapy podziału jądra w czasie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wybrane klatki z 18-godzinnego obrazowania konfokalnego na żywo (time-lapse) zarodka poddanego elektroporacji EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP w 22 hpf. Powierzchnia komory znajduje się w dolnej części każdej klatki obrazu. Pasek skali odpowiada 10 μm.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym filmie prezentujemy metodę obrazowania live w trybie time-lapse komórek progenitorowych neuronów na poziomie klonalnym w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. Przetestowaliśmy i zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły elektroporacji4-6, aby genetycznie i fluorescencyjnie znakować pojedyncze komórki progenitorowe neuronów. Możliwe jest stworzenie drzewa linii komórkowej składającego się z klonalnie powiązanych komórek potomnych, ponieważ tylko nieliczne komórki zostały rzadko oznakowane p...

obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precyzyjne wzorce podziału, migracji i różnicowania neuralnych komórek progenitorowych są kluczowe dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu1,2. Aby zrozumieć zachowanie neuralnych komórek progenitorowych w złożonym środowisku in vivo, niezbędne jest obrazowanie czasu rzeczywistego (time-lapse) żywych neuralnych komórek progenitorowych w nienaruszonym mózgu. W niniejszym filmie wykorzystujemy unikalne cechy embrionów zebrafish do wizualizacji rozwoju neuralnych komórek progenitorowych przedmózgowia in vivo. Stosujemy elektroporację w celu genetycznego i rzadkiego znakowania pojedynczych neuralnych komórek progenitorowych. W skrócie, konstrukty DNA kodujące markery fluorescencyjne wstrzyknięto do komory przedmózgowia embrionów zebrafish w 22 godzinach po zapłodnieniu (hpf), a następnie natychmiast podano impulsy elektryczne. Sześć godzin później elektroporowane embriony zebrafish zamocowano w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w szalkach hodowlanych z szklanym dnem. Następnie fluorescencyjnie znakowane neuralne komórki progenitorowe obrazowano przez 36h w stałych odstępach czasu pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu obiektywu zanurzeniowego w wodzie. Przedstawiona metoda umożliwia uzyskanie wglądu w rozwój in vivo neuralnych komórek progenitorowych przedmózgowia i może być zastosowana do innych części ośrodkowego układu nerwowego embrionu zebrafish.

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Precyzyjne wzorce podziału, migracji i różnicowania neuralnych komórek progenitorowych są kluczowe dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu1,2. Aby ...

Celem następnego eksperymentu jest obserwacja rozwoju pojedynczych komórek progenitorowych przedmózgowia in vivo za pomocą obrazowania live-imaging w trybie time-lapse embrionów zebrafish. Osiąga się to poprzez elektroporację konstruktów DNA kodujących markery fluorescencyjne, które znakują rzadko rozmieszczone komórki progenitorowe przedmózgowia. Elektroporowane embriony są znieczulane, montowane w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii time-lapse.Wyniki ukazują rozwój in vivo konkretnej komórki progenitorowej neuronów przedmózgowia. Ta metoda może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju in vivo komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia. Może ona zostać zastosowana również w odniesieniu do innych obszarów ośrodkowego układu nerwowego, takich jak opona, mózg i rdzeń kręgowy.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie DNA lub RNA na etapie pojedynczej komórki, jest możliwość precyzyjnego celowania w interesy własne w dowolnym punkcie czasowym rozwoju. Niniejszy protokół rozpoczyna się dzień przed planowaną elektroporacją. Rano należy zebrać 50 zapłodnionych embrionów od sparowanych danio przebraske, a następnie zanurzyć embriony w medium embrionalnym zawierającym feniltioureas lub PTU. Zanurzone embriony należy inkubować przez 22 godziny w temperaturze 28,5 °C do następnego dnia.W 22. godzinie po zapłodnieniu embriony są gotowe do elektroporacji. Należy rozpocząć od ręcznego pokrycia embrionów warstwą ochronną za pomocą precyzyjnej pęsety. Następnie przenieść pokryte embriony do 10 ml roztworu Ringera do elektroporacji zawierającego PTU, aby znieczulić embriony.Do roztworu dodaj 420 µL zapasu Trica o stężeniu 4 mg/mL. Zarodki są teraz gotowe do elektroporacji; przygotuj igły wstrzykujące niezbędne do elektroporacji. Wyciągnij kapilary szklane i odłam ich końcówki pęsetą, aby uzyskać ostrą końcówkę 0,2 o niskiej temperaturze topnienia.Konieczne jest również przygotowanie roztworów agro, obejmujących roztwór 1% zawieszony w roztworze Ringera do elektroporacji oraz roztwór 0,8% w medium embrionalnym do montowania. Przenieś obie różne porcje roztworów agro do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów i utrzymuj je w bloku grzewczym w temperaturze około 37 °C. Niniejszy protokół wykorzystuje system GAL4 UAS do sterowania ekspresją genów w komórkach progenitorowych neuronów.Użyto dwóch plazmidów: jeden konstytutywnie ekspresuje GAL4, a drugi ekspresuje GFP w odpowiedzi na GAL4. Oba plazmidy przygotowano za pomocą zestawów do izolacji, a następnie skoncentrowano do poziomu od 1 do 2 µg/µL, wykorzystując wytrącanie octanem sodu i etanolem w roztworze 10 mM Tris-HCl. Po oznaczeniu stężenia plazmidów, oba plazmidy rozcieńczono w jednym roztworze wodą wolną od nukleaz do stężenia 500 ng/µL.Przy tym stężeniu zostaną one ocenione wspólnie w celu wizualizacji podania roztworu, zabarwionego czerwienią fenolową w ilości 10% całkowitej objętości roztworu. Roztwór jest teraz gotowy do elektroporacji i powinien zostać umieszczony w lodzie. Zestaw do elektroporacji składa się z mikroskopu stereoskopyjnego o maksymalnym powiększeniu 50 x.Zestaw jest wyposażony w wtryskiwacz ciśnienia powietrza, dwa mikromanipulatory oraz stymulator elektryczny. Elektroda na lewym mikromanipulatorze posiada niestandardowe równoległe elektrody bipolarne z platyny i irydu. Przed elektroporacją napełnij igłę wtryskową od tyłu dwiema mikrolitrami roztworu DNA i ustaw objętość wtrysku na 4 nanolitry. Od tego momentu protokół wymaga praktyki w celu opanowania techniki montażu: zanurz i natychmiast wyjmij dwa embriony z 1% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.Za pomocą szklanej pipety przenieś każdy z nich do osobistej kropli agros na platformie lub w szalce z kroplą. Użyj sondy światłowodowej, aby delikatnie ustawić embriony grzbietem do góry, zanim agros zastygnie. Dzięki temu przedmózgie będzie dostępne zarówno dla elektrod, jak i igły do mikroiniekcji.Powtarzaj ten proces, aż wszystkie 10 kropli zostanie załadowanych wszystkimi przygotowanymi zarodkami. Wprowadź elektrody do aerosów, a igłę do mikroiniekcji wprowadź do komory brzusznej przedmózgowia. Następnie wstrzyknij cztery nanolitry mieszaniny DNA.Zwróć uwagę na przepływ i obserwuj obrzęk komory. Natychmiast po zauważeniu obrzęku przyłóż dwa z 4 27 impulsów o napięciu 0,5 V, trwających jeden milisekund każdy. Te cztery impulsy muszą zostać podane w przeciwnej polaryzacji.Wynikiem jest obustronne mozaikowe znakowanie czterech komórek progenitorowych neuronów mózgu. Teraz należy usunąć igłę do iniekcji z przedmózgowia i przesunąć stolik do kolejnego zarodka. Powtórzyć proces iniekcji i elektroporacji dla każdego pozostałego zarodka.Po przeprowadzeniu elektroporacji wszystkich 10 embrionów, wlej pięć mililitrów medium embrionalnego na embriony, aby umożliwić ich przeniesienie. Odlep je za pomocą noża mikrochirurgicznego i przenieś do nowej szalki zawierającej 30 mililitrów medium embrionalnego. Przed obrazowaniem inkubuj embriony w temperaturze 28.5 °C przez około cztery godziny po elektroporacji.Sygnał EGFP jest widoczny. Jeśli obserwacja pod epifluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym zostanie przeprowadzona w kolejnej godzinie lub pięć godzin po elektroporacji, należy wybrać zarodki wykazujące silną, lecz silnie mozaikową ekspresję EGFP w regionie brainin. Wybrane zarodki należy przenieść do 10 ml medium i znieczulić, dodając 420 µL zapasu trica o stężeniu 4 mg/mL.Obrazowanie zostanie przeprowadzone na stole z kontrolą temperatury mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w obiektywy pionowe. Przygotowano mikroskop, ustawiając temperaturę stołu na 28.5 °C. Należy również podgrzać pożywkę embrionalną do 28.5 °C.Aby zamontować zarodek, należy za pomocą szklanej pipety krótko zanurzyć go w agarozie, a następnie umieścić w centrum szklanego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. Używając sondy światłowodowej, należy delikatnie ustawić zarodki grzbietem do góry przed zastygnięciem agarozy, a następnie przykryć je trzema mililitrami podgrzanego medium. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania live w trybie time-lapse w stałych odstępach czasu przy użyciu obiektywu zanurzanego w wodzie; przedstawione tutaj obrazy z konfokalnego mikroskopu time-lapse ukazują jedną komórkę progenitorową neuronów.Stosując tę metodę, możemy obserwować migrację tej komórki oraz jej dwa podziały w czasie od 28,5 do 41,5 godziny po zapłodnieniu. Dzięki minimalizacji mocy lasera i uzupełnianiu pożywki w embrionie, obrazy mogą być rejestrowane przez okres do 60 godzin po zapłodnieniu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania elektroporacji genetycznie znakowanych neuroprogenitorowych komórek oraz zasad postępowania z elektroporowanymi embrionami.W przypadku konfokalnego obrazowania TimeLapse w poziomie, po opanowaniu techniki, elektroporacja ta może zostać przeprowadzona w mniej niż jedną godzinę, jeśli jest wykonana prawidłowo.

time-lapse-live-imaging-clonally-related-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przestrzenna analiza czasowa powiązanych klonalnie komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przodomózgiu larw rybki zebra

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Przedstawiamy tutaj protokół przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniej mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj metodę elektroporacji i poklatkowej mikroskopii konfokalnej do obrazowania klonalnie powiązanych komórek progenitorowych w rozwijającym się przodomózgowiu Danio rerio.

Poklatkowe obrazowanie na żywo klonalnie powiązanych nerwowych komórek progenitorowych w rozwijającym się przodomózgowiu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów