Name: Rozwarstwienie i obrazowanie 2-fotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Poznaj technikę rozwarstwienia i obrazowania 2-fotonowego węzłów chłonnych u myszy. Metoda umożliwia wizualizację ruchliwości komórek T CD4+ w układzie limfatycznym in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Rebeccie Paquette za pomoc w przygotowaniu odczynników. MPM jest wspierany przez stypendium przeddoktoranckie Ruth L. Kirchstein z National Institutes of Health oraz wsparcie z grantów GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP), również z National Institutes of Health.

1. Adopcyjny transfer komórek:
Wstrzykiwanie do żyły ogonowej lub do wnętrza oka to odpowiednie metody wprowadzania limfocytów znakowanych trackerem komórkowym lub wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. W niniejszym filmie prezentujemy adoptywny transfer komórek poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.
a. Materiały
Komórki T CD4+ znakuje się 1,4 μM CFSE przez 30 minut w temperaturze 37ºC, płucze dwukrotnie i zawiesza ponownie w 100 μL RPMI-1640. Komórki nanosi się do sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28G w celu iniekcji. Liczba użytych komórek zależy od rodzaju prowadzonego eksperymentu. Zazwyczaj 5 milionów komórek T&nbsp;jest wystarczających do prostej wizualizacji komórek T. Aby zapobiec zranieniu zwierzęcia&nbsp;oraz&nbsp;operatora, konieczne jest zastosowanie ograniczacza ruchów dla myszy.
b. Unieruchomienie zwierzęcia
Myszy unieruchamia się do transferu adopcyjnego, powoli wprowadzając zwierzę tyłem do ograniczacza dla gryzoni (patrz wideo) i zamykając otwarty koniec rurki poprzez delikatne dociśnięcie tłoka. Podczas tego procesu nie należy puszczać ogona myszy, ponieważ niektóre mniejsze zwierzęta mogą obrócić się wewnątrz ograniczacza. Metoda ta zapobiega zranieniu się zwierzęcia oraz jego przemieszczaniu się podczas wstrzykiwania. Podczas ustawiania ograniczacza dla gryzoni nie należy wsuwać tłoka głębiej, niż jest to konieczne, aby zapobiec wyskoczeniu zwierzęcia do przodu. Ponadto,&nbsp;nie należy dociskać tłoka do zwierzęcia ani pozostawiać zwierzęcia w ograniczaczu przez dłuższy czas.
c. Wizualizacja żyły ogonowej
Delikatnie pociągnij ogon w swoją stronę, tak aby lekko owinął się wokół palca wskazującego i został dociśnięty do wewnętrznej strony palca kciukiem. Zlokalizuj żyły ogonowe znajdujące się po obu stronach wyprostowanego ogona. Wizualizację ułatwia ogrzanie ogona ciepłą wodą, a następnie przetarcie go etanolem.
d. Iniekcja komórek
Po zlokalizowaniu żyły wprowadź strzykawkę skośną stroną do góry pod płytym kątem, równolegle do żyły. Po wprowadzeniu do żyły delikatnie przeciśnij tłok; jeśli igła znajduje się w naczyniu, nie powinno być żadnego oporu podczas wstrzykiwania. W przypadku wystąpienia jakiegokolwiek oporu wyjmij strzykawkę i spróbuj ponownie w innym miejscu.
Jeśli igła znajduje się w naczyniu, powoli naciskaj tłok, aż do zakończenia iniekcji. Ogon nie powinien nabrzmiewać podczas wstrzykiwania. Jeśli tak się stanie, oznacza to, że igła nie znajduje się w żyle. Możliwe jest „zgubienie” żyły w trakcie iniekcji. W takim przypadku wyjmij igłę i spróbuj wykonać wstrzyknięcie w innym miejscu. Jeśli konieczna jest próba wykonania więcej niż jednej iniekcji, najlepiej przesuwać się z pierwotnego miejsca wstrzyknięcia w górę ogona, w stronę ciała myszy.&nbsp;Zaplanuj taką możliwość, zaczynając od części dystalnej ogona, aby zostawić sobie miejsce na kolejną próbę transferu adopcyjnego.
e. Uwagi po iniekcji
Po zakończeniu wstrzyknięcia wystąpi niewielki cofanie się krwi z żyły. Delikatnie uciskaj miejsce wstrzyknięcia czystym gazikiem, aż krwawienie ustanie. Wyjmij tłok i pozwól zwierzęciu wyjść naprzód z ograniczacza, delikatnie trzymając je za ogon.
Zawsze konsultuj się z komisją ds. opieki nad zwierzętami oraz sprawdź protokoły wykorzystania zwierząt, aby upewnić się, że działasz zgodnie z przepisami. Przed przystąpieniem do właściwego eksperymentu ważne jest, aby kilkakrotnie przećwiczyć tę technikę.
2. Izolacja węzłów chłonnych
Izolacja węzłów chłonnych do obrazowania dwufotonowego wymaga ostrożnego usunięcia odpowiedniego węzła chłonnego z otaczającej go tkanki.
a. Wybór i lokalizacja obwodowych węzłów chłonnych
Wybór węzłów chłonnych do obrazowania zależy od celów eksperymentalnych. Należy uwzględnić obecność miejscowych infekcji lub węzłów chłonnych drenujących miejsce iniekcji i wybrać odpowiedni węzeł do obrazowania. Artykuł Van den Broeck i wsp. szczegółowo opisuje lokalizację i morfologię węzłów chłonnych myszy3. W niniejszym filmie prezentujemy wycięcie sześciu dużych obwodowych węzłów chłonnych, które nadają się do izolacji komórek lub obrazowania.
b. Usunięcie węzła chłonnego:
Podczas usuwania węzłów chłonnych należy dbać o zachowanie integralności tkanki. Należy uważać, aby nie przerwać torebki ani w żaden sposób nie uszkodzić struktury węzła chłonnego. Utrata integralności strukturalnej węzła chłonnego wpłynie negatywnie na wynik eksperymentu. W razie potrzeby tłuszcz z powierzchni węzła chłonnego należy usunąć za pomocą precyzyjnej pęsety do sekcji (#5 Dumont) pod mikroskopem stereoskopowym. Na powierzchni węzła nie powinno pozostać żadnych złogów tłuszczu, ponieważ spowodowałoby to rozproszenie światła i utrudniło obrazowanie.
Prawidłowe wycięcie węzłów chłonnych to kolejna ważna technika, którą należy przećwiczyć przed pierwszym właściwym eksperymentem.
3. Konfiguracja i uwagi dotyczące obrazowania węzłów chłonnych
Węzeł chłonny należy przymocować do stołu obrazującego, który&nbsp;w tym przypadku składa się z wgłębnej komory. Ogrzane, natlenione podłoże jest pompowane do komory z jednej strony za pomocą pompy perystaltycznej i grzałki przepływowej, a następnie odpływa przez kanał o nachyleniu w dół do komory zbiorczej z rurką próżniową prowadzącą do kolby na odpady. W naszym systemie węzeł chłonny jest zanurzony w podłożu o temperaturze 37°C i superperfundowany karbogenem klasy medycznej (5% CO2, 95% O2). Temperaturę podłoża perfuzyjnego należy rejestrować jak najbliżej węzła chłonnego. Konkretny system może wymagać modyfikacji szybkości przepływu podłoża oraz konstrukcji stołu, aby dostosować go do stołu i obiektywu mikroskopu.
a. Konfiguracja obrazowania węzłów chłonnych:
Jak pokazano na filmie, unieruchamiamy węzeł chłonny, przyklejając go najpierw stroną rdzeniową do dołu (aby obrazować strefy komórek T lub B przy użyciu mikroskopu pionowego) do plastikowej laminki dociętej do odpowiedniego rozmiaru. Ważne jest zastosowanie nietoksycznego kleju tkankowego (my stosujemy VetBond™ firmy 3M Corporation).
Kryszalkę mocuje się w przepływających mediach, nakładając niewielką ilość smaru silikonowego na jej dolną powierzchnię, a następnie przytwierdzając ją do szklanej podstawy komory obrazowania.
b. Uwagi dotyczące obrazowania dwufotonowego:
Kilka czynników może spowodować zahamowanie ruchu limfocytów: zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura, nadmierna moc lasera, ucisk lub inne uszkodzenia węzła chłonnego oraz brak tlenu. Uszkodzenia spowodowane nadmierną mocą lasera lub temperaturami &gt; ~39°C są nieodwracalne.
Jeśli komórki są słabo widoczne, zazwyczaj lepiej jest zwiększyć wzmocnienie detektora lub zoptymalizować protokół znakowania komórek, zamiast stosować większą moc lasera w celu ich wizualizacji. Może być konieczna optymalizacja znakowania lub ekspresji białek fluorescencyjnych, aby podnieść poziom fluorescencji powyżej poziomu autofluorescencji tła. Przy rozsądnych ustawieniach wzmocnienia i mocy lasera, przesunięcie fluorescencji o około dwa rzędy wielkości powyżej linii bazowej (mierzone za pomocą cytometrii przepływowej) jest wystarczające do wizualizacji komórek.
W przypadku laserów dwufotonowych z regulowaną długością fali, długość fali wykorzystywana do wzbudzenia powinna być nieco mniejsza niż dwukrotność maksimum wzbudzenia jednofotonowego fluoroforu poddawanego obrazowaniu. W eksperymentach dwufotonowych z wykorzystaniem więcej niż jednego znacznika lub białka fluorescencyjnego może być konieczne przeprowadzenie prób z różnymi długościami fali wzbudzenia w celu znalezienia optymalnych ustawień dla obu znaczników. Wzbudzenie dwufotonowe może być również wykorzystane do obrazowania endogennych struktur kolagenowych dzięki wykorzystaniu wewnętrznej niebieskiej generacji drugiej harmonicznej. Generacja drugiej harmonicznej (SHG) zachodzi, gdy dwa fotony łączą się wewnątrz materiału i emitują pojedynczy foton o częstotliwości dwukrotnie większej od fotonów pierwotnych. W tkankach wzbudzenie dwufotonowe występuje, gdy padające światło laserowe jest prostopadłe do wysoko uporządkowanej struktury białkowej, takiej jak kolagen.
Praktyczne kwestie dotyczące obrazowania dwufotonowego zostały omówione w poprzednich przeglądach4, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

W niniejszym protokole wideo przedstawiamy procedury adoptywnego transferu komórek oraz izolacji i przygotowania węzłów chłonnych niezbędne do obrazowania ruchliwości limfocytów w obwodowym węźle chłonnym. Obrazowanie dwufotonowe posiada kilka zalet w stosunku do obrazowania konfokalnego, zarówno w przypadku tkanek eksplantowanych (pokazanych tutaj), jak i w preparatach intravitalnych. W szczególności zastosowanie wzbudzania w podczerwieni minimalizuje rozpraszanie światła i pozwala na obrazowanie na głębokości ~300 µm pod torebką węzła chłonnego, a w niektórych tkankach jeszcze głębiej4. Ponadto wzbudzanie wielofotonowe ogranicza się do punktu ogniskowego obiektywu, co minimalizuje fotowybielanie i uszkodzenia tkanek poza płaszczyzną ogniskowania. Jednak podobnie jak w przypadku każdej nowej techniki, obrazowanie dwufotonowe nie jest panaceum i należy pamiętać o jego ograniczeniach oraz potencjalnych pułapkach5. Należą do nich wymagania, zgodnie z którymi – z wyjątkiem sygnałów endogennych, takich jak generowanie drugiej harmonicznej przez kolagen – komórki będące przedmiotem zainteresowania muszą być znakowane fluorescencyjnie za pomocą sond zewnętrznych lub poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych. Powstaje zatem wrażenie, że znakowane komórki pływają w czarnej próżni, podczas gdy w rzeczywistości są one zanurzone w złożonym środowisku elementów strukturalnych i niezliczonych innych nieznakowanych, niewidocznych komórek i wchodzą z nimi w interakcje.

W ciągu sześciu lat od wprowadzenia obrazowania dwufotonowego do immunologii technika ta pozwoliła badaczom odpowiedzieć na nurtujące od dawna pytania poprzez bezpośrednią wizualizację w nienaruszonych żywych tkankach procesów takich jak oddziaływania międzykomórkowe, motywność i lokalizacja komórek, szlaki sygnalizacji komórkowej oraz zdarzenia cytotoksycznego zabijania komórek. Dziedzina ta szybko ewoluowała poza wstępne opisy fenomenologiczne, a analizy ilościowe wraz z modelowaniem i symulacjami komputerowymi zaczynają teraz wyjaśniać, w jaki sposób pozornie chaotyczne ruchy i oddziaływania komórkowe w węzłach chłonnych prowadzą do wydajnej odpowiedzi immunologicznej. Postęp ten został szczegółowo omówiony w niedawnej publikacji1, w której wymieniono ponad 100 prac opisujących zastosowanie mikroskopii dwufotonowej w obrazowaniu immunologicznym.

disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Obrazowanie dwufotonowe ujawniło precyzyjną choreografię ruchliwości i oddziaływań komórkowych wewnątrz węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz w momencie inicjacji odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy przedstawiamy metody adoptywnego transferu znakowanych limfocytów T, izolacji węzłów chłonnych oraz obrazowania ruchliwości limfocytów T CD4+ w wyekscyzyjnym węźle chłonnym, zgodnie z opisem z 2002 roku 2. Obrazowanie dwufotonowe komórek odpornościowych wymaga, aby komórki były znakowane fluorescencyjnie, albo poprzez barwienie barwnikiem śledzącym komórki, albo poprzez ekspresję białka fluorescencyjnego. Prezentujemy procedurę adoptywnego transferu polegającą na wstrzyknięciu komórek pochodzących od myszy dawcy do żyły ogonowej zwierzęcia biorcy, skąd w ciągu około 15-30 min migrują one do organów limfatycznych. Ilustrujemy proces izolacji węzła chłonnego i opisujemy metody zapewniające prawidłowe zamocowanie wyciętego węzła. Omówiono również inne kwestie, takie jak odpowiednie natlenienie perfundowanego medium, temperatura oraz moc lasera. Na koniec przedstawiamy trójwymiarowe nagrania wideo naiwnych limfocytów T CD4+ wykazujących ruchliwość w stanie spoczynku w temperaturze 37°C.

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Obrazowanie dwufotonowe ujawniło kunsztowną choreografię ruchliwości i interakcji komórkowych wewnątrz węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas...

Witam, nazywam się Melanie Matthew. Pracuję w laboratorium Micah Helen na University of California Irvine. Dzisiaj wyizolujemy węzły chłonne z myszy w celu przeprowadzenia obrazowania in situ do fotonów.Procedura ta obejmuje usunięcie węzłów chłonnych pachwinowych, pachowych oraz szyjnych. Sześć obwodowych węzłów chłonnych u myszy jest łatwo dostępnych. Aby wprowadzić komórki fluorescencyjne do węzłów chłonnych myszy i umożliwić obrazowanie za pomocą systemu Two-Photon Imaging, w pierwszej kolejności należy przeprowadzić adoptywny transfer komórek znakowanych fluorescencyjnie.W tym doświadczeniu przedstawię najpierw proces transferu adopcyjnego. Oto nasza strzykawka insulinowa o rozmiarze 28G. Napełnię ją komórkami.Najpierw chcę udrożnić strzykawkę, aby tłok przesuwał się lekko. Następnie ostrożnie pobiorę komórki. Dołożę wszelkich starań, aby nie dotykać ścianek probówki igłą strzykawki insulinowej, ponieważ mogłoby to stępić igłę i utrudnić wykonanie wstrzyknięcia do ogonowej żyły myszy.Jeśli pojawiły się pęcherzyki powietrza, należy je usunąć, delikatnie je odpychając. Opukaj naczynie, aby je przesunąć. I gotowe.Teraz jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia tych komórek do żyły ogonowej. Oto nasza mysz szczepu C 57 black six. Będziemy ją powoli i delikatnie wprowadzać do wstrzykiwacza do żyły ogonowej.Wiele myszy nie lubi tego zabiegu, ale zapobiega on ich skakaniu podczas właściwej iniekcji, co chroni zwierzęta przed dodatkowymi obrażeniami, a badacza przed możliwym ukłuciem igłą. Należy zatem bardzo powoli unieruchomić mysz wewnątrz. Następnie szuka się żyły ogonowej wzdłuż boków ogona myszy.Duża tętnica biegnie wzdłuż górnej części. Następnie po obu stronach ogona myszy znajdują się dwie długie żyły. Przesuń się aż do samego końca.Należy wziąć igłę i zacząć od dolnej części ogona, szukając żyły. Tutaj widzę żyłę. Zwilżę ją delikatnie etanolem, co może sprawić, że będzie ona nieco lepiej widoczna.W porządku, teraz wykonamy iniekcję do żyły ogonowej; ważne jest, aby otwór igły był skierowany ku górze. Oznacza to, że ścięta końcówka igły powinna być skierowana do góry. Igłę należy prowadzić niemal równolegle do ogona.Należy unikać wprowadzania igły pod kątem, ponieważ żyły znajdują się bezpośrednio pod powierzchnią skóry. Igłę należy bardzo powoli wsunąć do żyły ogonowej. Z większym doświadczeniem powinni Państwo być w stanie wyczuć moment wprowadzenia igły.Jednak za pierwszymi dwoma razami należy spróbować wypchnąć płyn, aby sprawdzić, czy występuje jakikolwiek opór. Jeśli nie ma oporu, oznacza to, że igła znajduje się w żyle ogonowej i można wykonać szybki, łatwy wstrzyknięcie, tak jak właśnie zrobiłem. Następnie można powoli wyciągnąć igłę.Kolejnym potwierdzeniem prawidłowego wprowadzenia igły do naczynia jest pojawienie się niewielkiej kropli krwi wskutek cofnięcia tłoka. Widoczny niewielki cofnięty strumień krwi w miejscu wstrzyknięcia potwierdza, że igła znajduje się w żyle ogonowej. Krwawienie u myszy powinno ustać krótko po wykonaniu zastrzyku.Oto nasza mysz szczepu BLK6. Usuniemy z niej węzły chłonne z pachwin, które znajdują się tutaj, oraz z okolic pach, gdzie znajdują się węzły pachy dokładnie tutaj i po drugiej stronie. Następnie usuniemy powierzchowne węzły szyjne, które znajdują się tutaj, w obrębie gardła, po jednej stronie na każdy bok.Witajcie. Jesteśmy teraz gotowi do przeprowadzenia sekcji myszy. Zacznę od przypięcia zwierzęcia do deski sekcyjnej. Przystępuję teraz do przypinania myszy. Tak.Należy upewnić się, że zwierzę jest stabilnie przymocowane. Pozwoli nam to na lepszą ekspozycję obwodowych węzłów chłonnych, dlatego zazwyczaj przytwierdzam wszystkie cztery łapy.Nie przejmuję się ogonem. Niektórzy wolą go również przypiąć. Następnie, aby zapobiec przedostawaniu się futra do obszaru sekcji oraz jego osadzaniu się na węzłach chłonnych i instrumentach, spryskujemy mysz 70% etanolem.A teraz, gdy mysz została znieczulona etanolem, wykonam nacięcie w linii środkowej. Robię to, odsuwając futro od ciała. Jak widać, mogę unieść skórę, tworząc w ten sposób niewielki namiot.Dzięki temu unikną się przerwania ciągłości otrzewnej, czego w tym przypadku chcemy uniknąć. Dobrze, zacznę od nacięcia w linii środkowej tutaj. Wykonuję małe nacięcie, upewniając się, że nie uszkodziłem otrzewnej.Widać, że pod spodem znajduje się otrzewna. Wsuwam nożyczki pod nacięcie i powoli oddzielam skórę od otrzewnej, wykonując po drodze małe nacięcia, ponieważ będziemy pobierać węzły chłonne szyjne. Będę przecinać tkankę aż do linii żuchwy myszy, robiąc to bardzo ostrożnie i powoli, aby upewnić się, że nie uszkodzę żadnych głównych naczyń krwionośnych.Następnie, ponieważ pobieramy węzły chłonne pachwinowe, które znajdują się w dolnej części płata skóry, wykonam cięcie w linii środkowej aż do poziomu ogona, do jego nasady. Gotowe. Takie cięcie w linii środkowej będzie odpowiednie.Teraz oddzielę skórę od otrzewnej. Będę robić to delikatnie za pomocą pęsety, odsuwając skórę od otrzewnej w miarę postępu prac. W ten sposób odsłaniam pierwszy węzeł chłonny, który będziemy preparować.To jest węzeł chłonny pachwinowy znajdujący się tutaj, w dolnym płacie skóry. Po odsunięciu płata skóry od głównego ciała myszy, przypnę go, aby odsłonić węzeł chłonny pachwinowy. Dzięki temu węzeł chłonny pachwinowy jest lepiej wyeksponowany, co pozwoli nam na jego precyzyjne wypreparowanie.Oto odsłonięty węzeł chłonny pachwinowy po przyszpileniu. Zazwyczaj znajduje się on w płacie skórnym, tuż nad nogą. Można go zlokalizować, szukając rozgałęzienia naczyń krwionośnych w kształcie litery Y, które przebiegają nad nim.I oto jest. Znajduje się tam, otoczony niewielką ilością tkanki tłuszczowej, z naczyniami krwionośnymi przebiegającymi po wierzchu. Dobrze, teraz usunę węzeł chłonny pachwinowy.Przesuwam pęsetę wzdłuż obu stron węzła chłonnego, aby oddzielić go od tkanki tłuszczowej. Musimy całkowicie usunąć tłuszcz, ponieważ podczas obrazowania dwufotonowego utrudniłby on penetrację laserową tkanki.Sprawdźmy. Ważne jest, aby usunąć cały tłuszcz wokół węzła chłonnego, a jednocześnie zachować nienaruszoną korę węzła chłonnego. Dobrze, gotowe.Oto nasz węzeł chłonny z pachwiny. Umieszczę go w pożywce; dobrym sposobem na sprawdzenie, czy usunięto całą tkankę tłuszczową, jest obserwacja, czy węzeł chłonny tonie. Po umieszczeniu w pożywce powinien on opaść bezpośrednio na dno.Jeśli obecna jest tkanka tłuszczowa, będzie ona pływać. Dobrze, teraz wyekstraktuję pomocniczy węzeł chłonny. Znajduje się on w pachwinie myszy, bezpośrednio wzdłuż dużego naczynia krwionośnego.Czasami może to być problematyczne, ponieważ może wystąpić obfite krwawienie, które przesłoni węzeł. Pokażę jednak, jak ja to robię i miejmy nadzieję, że tym razem nie pojawi się żadne krwawienie. Najpierw odchylam płat skóry, a właściwie odchylam ten fragment przedramienia obok węzła, który chcę pobrać.Pozwala mi to na bardziej zręczne odsuniecie skóry za pomocą palców i uchwycenie tego mięśnia przebiegającego nad pachą, co powinno spowodować wysunięcie się węzła chłonnego pachy przy delikatnym pociąganiu. Poszukam go teraz. I oto jest.Znajduje się ono dokładnie tam, w pachwinie, wzdłuż głównego naczynia krwionośnego. Teraz wypreparuję węzeł chłonny pachowy; skórę można ponownie przypiąć szpilką lub przytrzymać palcami, zależnie od tego, co jest wygodniejsze. Ja jednak wolę pracować tutaj ostrożnie.Wokół tego węzła chłonnego znajduje się bardzo mało tkanki tłuszczowej, co ułatwia obrazowanie, jednak znajduje się on obok dużego naczynia krwionośnego, więc przy braku ostrożności można go przeoczyć. W przypadku węzła pachowego chwytam tkankę łączną wokół niego i powoli oddzielam go od naczyń krwionośnych. I gotowe.Oto nasz węzeł chłonny pachowy. Znajduje się on właśnie tutaj. Jest to ładny, długi i płaski węzeł chłonny.Chwytam niewielki fragment pozostałej z boku węzła tkanki łącznej, aby nie uszkodzić samego węzła. Będziemy obrazować próbki, aby utrzymać uwodnienie węzłów chłonnych. Przed wykonaniem obrazowania w naszym instytucie umieszczamy je w pożywce niezależnej od CO2 w oddzielnych komorach, abyśmy mogli śledzić węzły chłonne pachwinowe, pachowe i szyjne.Prawidłowo przygotowany węzeł chłonny można rozpoznać po tym, że po wypreparowaniu opadnie on na dno. Oznacza to, że w węźle chłonnym znajduje się bardzo mało tłuszczu. Teraz usunę szyjny węzeł chłonny, powierzchowny szyjny.W ten sposób zaczynam od ponownego założenia klamerek z momentu, gdy usuwałem węzeł chłonny pachowy, aby nieco lepiej odsłonić tkankę szyjną. Węzły chłonne szyjne znajdują się w pobliżu mięśni żuchwy myszy, a konkretnie wzdłuż boku.Są to te same węzły chłonne, które można wyczuć podczas choroby. To właśnie te, których lekarz szuka podczas badania palpacyjnego w przypadku przeziębienia. Aby to zrobić, zazwyczaj wkładam palec pod tkankę, aby nieco ją wysunąć do przodu, przesuwając pęsetą wzdłuż boku.Powinienem zobaczyć wystający węzeł chłonny. O, jest. Znajduje się tam, w tkance.Oto on. Widoczny jest powierzchowny węzeł chłonny szyjny. Należy uważać, aby nie usunąć gruczołów ślinowych.W gruczołach ślinowych nie znajdziecie żadnych limfocytów T. Natomiast w tych konkretnych węzłach chłonnych znajdują się limfocyty T CD4+, znakowane CFSE. Pokażemy Wam teraz kilka filmów in situ przedstawiających ruch tych limfocytów T w tkance.Teraz przykleję węzeł chłonny do niełamliwego plastikowego szkiełka nakrywki, abyśmy mogli przymocować go do dna stołu do obrazowania in situ. Dzięki temu unikniemy przemieszczania się tkanki lub jej dryfu podczas obrazowania limfocytów T. Mam tutaj moje niełamliwe plastikowe szkiełka nakrywkowe.W pierwszej kolejności dotnę jeden z nich do odpowiedniego rozmiaru dla naszego węzła chłonnego. Używam do tego nożyczek i wycinam tutaj mały kwadrat. Dobrze, teraz naniosę na niego klej.Nanieś niewielką ilość kleju. Rozprowadź go na wyciętym fragmencie szkiełka. Następnie za pomocą chusteczki Kimwipe usuń nadmiar kleju.Jest to klej, który pokryje węzeł. Chcemy nałożyć bardzo cienką warstwę, aby nie zasłoniła ona obrazowania. Następnie wyjmę węzeł chłonny z roztworu.Zaczniemy od pierwszego węzła chłonnego, wyjmując go z medium. Należy robić to delikatnie, aby nie uszkodzić kory węzła.Chwycę tylko róg i przykleję go do szkiełka, najpierw delikatnie dotykając szkiełka rogiem węzła chłonnego, a następnie przesuwając węzeł po szkiełku, aby go unieruchomić. W tym celu wykorzystałem niewielką ilość tłuszczu, która pozostała na krawędzi węzła chłonnego. Dzięki temu nie uszkadzam kory węzła.Następnie biorę węzeł chłonny i aby utrwalić klej, zanurzam go w tej samej studzience, z której go wyjęłam. Odwracam go do góry dnem i delikatnie zanurzam w medium zawierającym klej. Usuwam niewielką ilość utwardzonego kleju exo.Gotowe. Teraz mamy węzeł chłonny przygotowany do obrazowania dwufotonowego. W ten sposób przygotowuje się węzły chłonne do obrazowania dwufotonowego in situ.Teraz przeniesiemy je pod mikroskop, przygotujemy go i wykonamy wysokiej jakości obrazy adoptywnie przeniesionych limfocytów T. Tutaj widzimy oznakowane CFSE limfocyty T poruszające się wewnątrz węzła chłonnego pachwinowego. Ten film został przyspieszony około 500 razy i można zauważyć, że komórki wykazują wysoką ruchliwość.Są one powiększone około 20 x za pomocą naszego obiektywu imersyjnego w wodzie 20 x. Jest to jedynie przykład ruchu samych limfocytów T. Nie zastosowaliśmy żadnego barwienia komórek otaczających.Zazwyczaj w bardziej zaawansowanych eksperymentach z wykorzystaniem dwóch kanałów fluorescencji można obserwować barwione komórki dendrytyczne, barwione limfocyty B i T wchodzące w interakcje z barwionymi komórkami NK. Można znakować niemal każdy typ komórek, który spodziewalibyśmy się znaleźć w węźle chłonnym, a następnie przeprowadzić obrazowanie. To wszystko w ramach naszego instytutowego protokołu obrazowania węzłów chłonnych.

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja i 2-fotonowe obrazowanie węzłów chłonnych obwodowych u myszy

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film demonstruje technikę preparacji w celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanowe z tylnych nóg myszy. Węzły chłonne odgrywają kluczową rolę w łączeniu odporności wrodzonej i nabytej, a pobieranie nienaruszonych węzłów chłonnych – z zachowaną strukturą tkankową i żywotnością komórek – może pomóc w badaniu miejscowych i ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.

Metoda preparacji w celu pobrania mysich węzłów chłonnych drenujących podkolanowe do obrazowania ex vivo

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Przedstawiono protokół łączący oczyszczanie tkanek z mikroskopią fluorescencyjną (LSFM) w celu uzyskania trójwymiarowych i komórkowych obrazów naczyń limfatycznych i węzłów chłonnych (LN) zbierających płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i płyn zewnątrzoponowy rdzeniowy.

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Praca pokazuje innowacyjną metodę in vivo badania kurczliwości naczyń limfatycznych szyjnych i przepływu limfy u myszy w celu przetestowania różnych funkcji fizjologicznych naczyń limfatycznych szyi (cLV) oraz strategii terapeutycznych dotyczących modulacyjnych mechanizmów regulacji limfatycznej odpływu i oczyszczania mózgu.

Możliwość odtworzenia ustawień dla in vivo dwufotonowego obrazowania kurczliwości naczyń chłonnych szyjnych i przepływu limfy u myszy

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Poznaj technikę rozwarstwienia i obrazowania 2-fotonowego węzłów chłonnych u myszy. Metoda umożliwia wizualizację ruchliwości komórek T CD4+ w układzie limfatycznym in vivo.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Przeglądaj więcej filmów