Procedura w inżynierii płuc

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie tkanki płucnej w hodowli, która jest morfologicznie i fizjologicznie porównywalna z natywną tkanką płucną. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie serca i płuc od dorosłego szczura. Następnym krokiem jest kaniulacja tętnicy płucnej i tchawicy oraz połączenie kaniulowanych płuc z bioreaktorem w celu decelularyzacji.

Po decelularyzacji i płukaniu płuco przenosi się do sterylnego bioreaktora hodowlanego i przygotowuje do usadzenia. Ostatnim etapem zabiegu jest zasianie pożądanego przedziału płuc przygotowaną populacją komórek. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że zdecelularyzowana macierz zewnątrzkomórkowa skutecznie ponownie zasiedla komórki, które wyrażają regionalnie specyficzne markery płucne za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami hodowli komórek płuc in vitro jest to, że komórki utrzymują zróżnicowane fenotypy przez dłuższy czas, dzięki czemu można je badać przez kilka tygodni w trójwymiarowym substracie pochodzenia biologicznego. W celu decelularyzacji płuca są połączone z nasadką bioreaktora za pomocą kaniuli naczyniowej, a nasadka jest podłączona do aparatu decelularyzacyjnego. Szklana butelka nad płucami jest utrzymywana na miejscu przez stojak na pierścienie i dołączony zacisk.

W tym momencie materiał komórkowy może zostać usunięty w celu wytworzenia rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej, które można ponownie zapełnić materiałem komórkowym. Montaż bioreaktora do wysiewu i hodowli zmodyfikowanej tkanki płucnej pokazano na tym schemacie. Łącznik blokady przynęty kaniuli tchawicy łączy się z pętlą oddechową między zbiornikiem tchawicy a komorą główną.

Pętla oddechowa zawiera dwa zawory jednokierunkowe. Pozycje takie, że medium podąża inną ścieżką do i z płuca. Mały zbiornik jest tymczasowo włączony do linii perfuzyjnej w celu wysiewu komórek śródbłonka.

Pompa pulsacyjna służy do przenoszenia komórek ze zbiornika do przedziału naczyniowego płuc. Perfuzja naczyniowa odbywa się za pomocą pompy rolkowej. Pożywka jest perfundowana do tętnicy płucnej przez dołączoną kaniulę, przepływa przez układ naczyniowy płuc i wydostaje się żyłą płucną bezpośrednio do głównego bioreaktora, gdzie pożywka jest pobierana do perfuzji.

Nabłonek płucny osadza się przez wstrzyknięcie w pętli oddechowej. Główna komora zawierająca płuco i zbiornik tchawicy służą do długotrwałego posiewu płuc. Po usunięciu płuc i prawidłowym kaniulowaniu tętnicy i tchawicy, świeżo pobrane płuca powinny zatrzymywać powietrze bez wycieków.

Można to sprawdzić, nadmuchując je powietrzem, gdy są zanurzone w cieczy. Nie powinno być żadnych pęcherzyków wskazujących na wycieki powietrza. Aby rozpocząć protokół, płuca są napompowane PBS zawierającym stronę nitroprasową sodu, aż płuca będą pełne, ale nie nadmiernie napompowane, natychmiast zakryj kaniulę tchawicy, aby płuca pozostały napompowane.

Następnie perfuzjuj płuca PBS i SNP przez co najmniej 15 minut przy 15 milimetrach słupa rtęci. Następnie usuń korek z kaniuli tchawicy, aby umożliwić opróżnienie płuc. W razie potrzeby kontynuować perfuzję z PBS i SNP przez 15 do 30 minut.

Uzupełnij PBS i SNP, aby zapewnić utrzymanie ciśnienia obfitości na poziomie od 10 do 15 milimetrów słupa rtęci. Aby rozpocząć procedurę długiej decelularyzacji, nasadka bioreaktora jest podłączona do aparatu do decelularyzacji. Następnie płuca są połączone z nasadką.

Korzystając z połączeń zamka przynęty połączonych z kaniulą w kształcie litery YS, kaniula tętnicy płucnej powinna połączyć się z linią perfuzyjną, a kaniula tchawicy powinna swobodnie unosić się na wodzie. Aby zapewnić pełną decelularyzację tkanki, ważne jest, aby powietrze nie dostało się do systemu. Zastawki jednokierunkowe w kaniuli tętniczej i tchawicy pomagają usunąć pęcherzyki powietrza w przewodach, umożliwiając odwrócenie przepływu w przewodach.

Dlatego, umożliwiając usunięcie pęcherzyków powietrza za pomocą strzykawki, upewnij się, że wszystkie przewody są wolne od powietrza. Rozpocznij perfuzję od roztworu decelularyzacyjnego. Perfuzjowany roztworem decelularyzacyjnym.

Dopóki 500 mililitrów roztworu nie przeniknie przez płuca, optymalne ciśnienie wynosi mniej niż 15 milimetrów słupa rtęci. Zazwyczaj zajmuje to 2,5 godziny. Natężenie przepływu jest zazwyczaj początkowo bardzo wolne i gwałtownie wzrasta w ciągu drugiej godziny do około jednego mililitra na minutę lub więcej.

Podczas perfuzji okresowo usuwano, zużyto płyn decelularyczny z bioreaktora, zapewniając jednocześnie wystarczającą ilość płynu, aby podeprzeć płuca i kaniulę tchawicy. Po zakończeniu perfuzji płynem decelularyzacyjnym przenieś płuca i bioreaktor do okapu do hodowli tkankowej. Aby rozpocząć płukanie narządów, wyjmij 500-mililitrowy słoik zawierający płyn decelularyzacyjny i zastąp go sterylnym słoikiem zawierającym do jednego litra sterylnego PBS.

Użyj ssania próżniowego lub strzykawki, aby upewnić się, że przewody są wolne od powietrza, przeprowadź PBS przez naczynia krwionośne przy 10 do 15 milimetrach rtęci w ten sam sposób. Jeśli chodzi o decelularyzację, przy użyciu sterylnych technik należy okresowo usuwać odpady PBS z bioreaktora i wymieniać lub ponownie napełniać słoik PBS. W przypadku świeżego, sterylnego PBS kontynuuj płukanie, aż co najmniej 2,5 litra sterylnego PBS przeniknie do płuc.

Zwykle zajmuje to dwa dni od rozpoczęcia procesu decelularyzacji po zakończeniu płukania. Przenieś płuca do nowego sterylnego systemu bioreaktora zawierającego świeży PBS plus 10% FBS plus 10% paciorkowca Pen, upewnij się, że zarówno cała pętla perfuzyjna, jak i całe linie dróg oddechowych są wypełnione płynem. Od tego momentu pompa pulsacyjna będzie używana do perfuzji płuc z prędkością pięciu milimetrów na minutę.

Wysterylizuj rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej płuc przez nocną perfuzję PBS, który zawiera 10% FBS i 10% streptomycyny penicyliny. Po wykonaniu tego kroku przenieś płuca do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę lub do momentu, gdy temperatura się zrównoważy. W ramach przygotowań do leczenia preparatem Ben Nase, kolejnym krokiem jest leczenie płuc preparatem Ben Nase.

Aby usunąć resztki DNA z każdego płuca, najpierw napełnij jedną 10-mililitrową strzykawkę tylko buforem Prewarm Ben Nase, a drugą 10-mililitrową strzykawkę 90 jednostkami na mililitr. Ben Nase rozcieńczony w buforze Ben Nase. Zatrzymać perfuzję płuc.

Następnie napełnij drogi oddechowe buforem Ben Nase, unikając wstrzykiwania powietrza do płuc. Pozwól płucu opróżnić się przez jedną minutę. Następnie napompuj płuca roztworem Ben Nase.

Ponownie, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do płuc po napompowaniu Ben Nase. Pozwól płucom siedzieć bez perfuzji i wentylacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Pod koniec jednej godziny wznowić perfuzję z PBS plus 10% FBS 10% penicyliny streptomycyny, która jest już w bioreaktorze, i kontynuować perfuzję przez noc następnego dnia.

Po wypłukaniu i sterylizacji długie rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej można przygotować do ponownego zasiedlenia komórek. Zastąp roztwór benzo P-B-S-F-B-S roztworem 250 mililitrów kultury. Pożywkę należy przepuszczać przez co najmniej godzinę przed wprowadzeniem komórek i zastąpić świeżą pożywką hodowlaną bezpośrednio przed wysiewem komórek.

Wiele źródeł komórek można wykorzystać do cofania się narządów. Tutaj zostanie zademonstrowane siedzenie z populacją komórek nabłonkowych. Najpierw przygotuj strzykawkę zawierającą 15 mililitrów zawiesiny komórkowej pożądanej populacji komórek nabłonka.

Następnie napełnij zbiornik dróg oddechowych 80 mililitrami pożywki hodowlanej i upewnij się, że wszystkie przewody wentylacyjne są wolne od powietrza. Następnie umieść bioreaktor w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i podłącz pompę strzykawkową do wentylacji. Zasiać komórki do płuc za pomocą pojedynczego szybkiego bolusa, wstrzykując 15-mililitrową zawiesinę komórek do kaniuli tchawicy.

Upewnij się, że filtry powietrza w głównym bioreaktorze są zaślepione. Następnie natychmiast rozpocznij pojedynczy powolny oddech za pomocą pompy strzykawkowej, aby pobrać 60 mililitrów powietrza z głównego bioreaktora z prędkością trzech mililitrów na minutę. Potrwa to około 20 minut.

A pozwól płucom siedzieć statycznie przez około 18 godzin po tym. Rozpocznij powolną perfuzję naczyniową z prędkością około 0,5 mililitra na minutę. Podczas hodowli narządów perfuzja jest zwykle wykonywana z prędkością od jednego do trzech mililitrów na minutę.

Używając pompy rolkowej podczas hodowli nabłonka, wentylacja jest zwykle zapewniana z ciągłą szybkością jednego oddechu na minutę i objętością oddechową od pięciu do 10 mililitrów. Za pomocą pompy strzykawkowej powietrze jest cyklicznie pobierane i wstrzykiwane do bioreaktora, aby wpływać na oddychanie poprzez naprzemienne podciśnienie i ciśnienie atmosferyczne wewnątrz głównej komory. Ze względu na konieczność utrzymania szczelności bioreaktora podczas wentylacji, wentylacja powinna być codziennie przerywana, a powietrze w komorze głównej powinno być wymieniane.

Ponadto podłoże należy zmieniać mniej więcej co trzy do czterech dni. Podczas hodowli około połowa całkowitej objętości powinna być za każdym razem wymieniana poprzez hodowlę nabłonka płucnego i śródbłonka naczyniowego. W rusztowaniu zamontowanym na bioreaktorze jesteśmy w stanie wytworzyć tkankę płucną, która jest w stanie uczestniczyć w wymianie gazowej w krótkich odstępach czasu.

Standardowe barwienie hematów, toiny i eoiny rodzimego płuca szczura pokazano tutaj dla porównania z barwieniem H i e pozbawionego komórek płuca szczura. Ostateczna zdecellular macierz zewnątrzkomórkowa powinna być całkowicie pozbawiona materiału komórkowego i zachować grube, mikroskopijne i ultrastrukturalne cechy natywnych płuc. Barwienie h i e umożliwi uwidocznienie wszelkich resztek DNA, przyklejających się do rusztowania w wyniku niedostatecznej decelularyzacji lub wypłukania optymalnych warunków do wysiewu komórek i późniejszej hodowli płuc.

Bioreaktor powinien dawać dobrze rozmieszczone komórki we wszystkich pięciu płatach płuc i powinien pokrywać około 70% rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej. Obrazy te porównują płuca natywne z płucami ponownie zasiedlonymi po zabarwieniu immunofluorescencyjnym. W przypadku kluczowych markerów płucnych wyhodowana populacja komórek jest dodatnia dla białka wydzielniczego komórek Clara pro białka wydzielniczego C i akwaporyny piątej.

Interesujące nas markery są pokazane na czerwono, a jądra barwione DAPI są na niebiesko we wszystkich panelach. Po opanowaniu tej procedury od decelularyzacji do cofania się, można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.