Name: Indukcja swoistej dla alloantygenu anergii w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenu z kostymulacyjną blokadą sygnału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę indukcji anergii swoistej dla alloantygenu w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej poprzez blokadę kostymulacji CD28. Technika ta generuje nieraktywne allo komórki T z zachowaną odpornością na patogeny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez National Institutes of Health (U19 CA100625 oraz R21 CA137645). JKD otrzymał wsparcie od Leukemia &amp; Lymphoma Society oraz American Society of Blood and Marrow Transplantation/Otsuka New Investigator Award.

1. Przygotowanie PBMC
<ol>
	<li>Podczas przeprowadzania niniejszego protokołu należy przestrzegać zasad właściwej techniki aseptycznej oraz środków ostrożności uniwersalnych.</li>
	<li>Wyizolować PBMC od zdrowych ochotników poprzez wirowanie w gradiencie gęstości z użyciem Ficoll-Hypaque. Alternatywnie można wykorzystać rozmrożone PBMC kriokonserwowane.</li>
	<li>Policzyć żywe PBMC po barwieniu błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru. Resuspender PBMC w pełnej pożywce hodowlanej (CM) do stężenia 1 milion żywych komórek/mL w probówce Falcon o pojemności 15mL.</li>
</ol>
2. Przygotowanie masowej ko-kultury alloanergyzującej
<ol>
	<li>Do przygotowania kultur alloanergizacji potrzebne są PBMC od dwóch oddzielnych dawców. Komórki od jednego dawcy będą pełnić rolę respondenta, a komórki od innego dawcy będą pełnić rolę stymulatora (zwanego stymulatorem Pierwszej Strony).</li>
	<li>Przenieść 10 milionów PBMC stymulatora w stężeniu 1 milion/ml do probówki Falcon 15 mL i dodać 100mg przeciwciał anty-B7.1 oraz 100mg przeciwciał anty-B7.2 w celu zablokowania kostymulacji. Delikatnie wymieszać zawartość probówki i inkubować przez 30 minut. Warunki inkubacji dla tego oraz wszystkich kolejnych kroków to 37°C/5% CO2/80% wilgotności</li>
	<li>Naświetlić PBMC stymulatora (33 Gy) i przenieść do kolby hodowlanej T-25 50cm3 z nakrętką przepuszczalną dla gazów. Oznaczyć kolbę jako „Masowa kokultura alloanergizująca”.</li>
	<li>Do kolby dodać 10mL PBMC respondenta (w stężeniu 1 milion/ml w CM).</li>
	<li>Dodać kolejne 100mg przeciwciał anty-B7.1 oraz 100mg przeciwciał anty-B7.2 i delikatnie wymieszać przed umieszczeniem kolby w pozycji pionowej w inkubatorze na 72 godziny</li>
</ol>
3. Przygotowanie masowej ko-kultury kontrolnej
<ol>
	<li>Umieścić 10 milionów stymulujących PBMC (w stężeniu 1 milion/ml) w probówce Falcon 15mL.</li>
	<li>Naświetlić 10 milionów stymulujących PBMC (33 Gy) i przenieść je do kolby hodowlanej 50cm3. Oznaczyć jako „Bulk control co-culture”.</li>
	<li>Dodać do kolby 10mL odpowiadających PBMC w stężeniu 1 milion/ml w CM i delikatnie wymieszać przed ustawieniem kolby pionowo w inkubatorze na 72 godziny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie podstawowej reakcji mieszanych limfocytów (MLR) w celu pomiaru skuteczności blokady kostymulującej
<ol>
	<li>Skuteczność blokady kostymulującej mierzy się w pierwotnej reakcji mieszanej leukocytów (MLR), którą przygotowuje się z wykorzystaniem PBMC z masowych kokultur alloanergizujących oraz kontrolnych</li>
	<li>Pierwotną MLR przygotowuje się w tym samym dniu, w którym utworzono kultury masowe</li>
	<li>Najpierw należy opisać jedną płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U jako „Primary MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych (dzień 4, 5 i 6 po przygotowaniu płytek).</li>
	<li>Przelać 5 mL z każdej z masowych kokultur kontrolnych i alloanergizujących do probówek typu Falcon o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Pipetować 200 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w dołkach na każdej płytce. Dołki z komórkami z masowych kokultur kontrolnych należy opisać jako „no costimulatory blockade (CSB)”, a dołki z komórkami z masowych kokultur alloanergizujących jako „CSB”</li>
	<li>Do 6 dołków na każdej płytce dodać 200 µL CM jako kontrole negatywne. Do wszystkich pustych dołków należy dodać 200 µL PBS w celu ograniczenia parowania. Płytki umieścić w inkubatorze.</li>
</ol>
5. Przygotowanie wtórnego MLR w celu pomiaru skuteczności alloanergizacji
<ol>
	<li>72 godziny po przygotowaniu zbiorczych kokultur, resztkowe odpowiedzi allogeniczne w alloanergizowanych PBMC są mierzone w wtórnej reakcji MLR. W wtórnej MLR PBMC zarówno ze zbiorczej alloanergizującej kokultury, jak i ze zbiorczej kokultury kontrolnej są płukane i restymulowane napromieniowanymi PBMC allostymulującymi</li>
	<li>Aby przygotować wtórną MLR, należy opisać płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U jako „Secondary MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych (dzień 3, 5 i 7 po przygotowaniu).</li>
	<li>Należy pobrać 5mL z każdej ze zbiorczych kokultur kontrolnej i alloanergizującej, przenieść je do probótek Falcon 15mL i wirować przez 5-10 minut przy 2000 rpm. Ostrożnie odessać nadosad, rozbić pellet, dodać 10mL CM i ponownie odwirować komórki. Powtórzyć ten etap płukania.</li>
	<li>Komórki resuspendować w 1mL CM. Policzyć żywe komórki przy użyciu barwienia błękitem trypanu i dostosować stężenie komórek do 1 miliona żywych komórek responderów/mL.</li>
	<li>Pipetować 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w każdym dołku na każdej płytce. Oznaczyć te dołki jako „First Party (FP) allorestimulation”</li>
	<li>Pipetować 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do kolejnych 3 dołków na każdej płytce i oznaczyć te dołki jako „CD3/28 stimulation”</li>
	<li>Aby przygotować komórki stymulujące do wtórnej MLR, należy wyizolować PBMC ze świeżej krwi (lub zregenerować kriokonserwowane PBMC) od tego samego zdrowego dawcy, z którego pobrano stymulujące PBMC pierwszej strony do kultur alloanergizujących i kontrolnych.</li>
	<li>Suspendować PBMC od dawcy FP w stężeniu 1 milion/mL i napromieniować (33Gy)</li>
	<li>Dodać 100mL napromieniowanych komórek stymulujących do dołków oznaczonych jako „FP allorestimulation”</li>
	<li>W przypadku kontroli pozytywnych, dodać po 1 mL przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD28 oraz 98mL CM do dołków oznaczonych jako „CD3/28 stimulation”. Dodać 200 mL CM do 6 dołków na każdej płytce jako kontrolę negatywną oraz 200mL PBS do pustych dołków. Umieścić płytki w inkubatorze.</li>
</ol>
6. Pomiar specyficzności alloanergizacji
<ol>
	<li>Specyficzność aloanergizacji określa się poprzez porównanie proliferacji komórek responderów pobranych z zakończonych kokultur aloanergizujących i kontrolnych po stymulacji napromieniowanymi PBMC otrzymanymi od zdrowego dawcy „trzeciej strony” (tj. innego dawcy niż Pierwsza Strona) w wtórnej reakcji MLR.</li>
	<li>Oznacz trzy płytki 96-dołkowe jako „Wtórna specyficzność MLR” Dzień 3, 5 i 7.</li>
	<li>Pobierz 5mL z każdej z masowych kokultur kontrolnej i aloanergizującej, przenieś do probówek Falcon 15mL i wiruj przez 5-10 minut przy 2000 rpm. Ostrożnie odessij nadsącz, rozbij pellet, dodaj 10mL CM i ponownie odwiruj komórki. Powtórz ten etap płukania.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w 1mL CM. Policz je za pomocą barwienia błękitem trypanu i dostosuj stężenie komórek do 1 miliona żywych komórek responderów/mL.</li>
	<li>Aby przygotować komórki stymulatora trzeciej strony do wtórnej reakcji MLR, wyizoluj PBMC ze świeżej krwi (lub zregeneruj kriokonserwowane PBMC) od nowego zdrowego dawcy. Pipetuj 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w dołkach każdej płytki. Oznacz te dołki jako „TP allostimulation”</li>
	<li>Zawieś PBMC od dawcy TP w stężeniu 1 milion/mL i napromieniuj (33 Gy)</li>
	<li>Dodaj 200mL napromieniowanych komórek stymulatora TP do dołków oznaczonych jako „TP allostimulation”</li>
	<li>Specyficzność aloanergizacji można również określić poprzez porównanie proliferacji komórek responderów pobranych z zakończonych kokultur aloanergizujących i kontrolnych po stymulacji patogenem zakaźnym, takim jak CMV. Na tym etapie niezbędne jest użycie PBMC responderów od dawców z wcześniej wykazanymi odpowiedziami proliferacyjnymi na lizat CMV.</li>
	<li>Oznacz trzy płytki 96-dołkowe jako „Wtórna MLR CMV” Dzień 3, 5 i 7.</li>
	<li>Aby przygotować komórki responderów do wtórnej reakcji MLR w celu pomiaru odpowiedzi na CMV, przenieś 5 ml z każdej z masowych kokultur kontrolnej i aloanergizującej do probówek 15 ml i wypłucz, policz oraz resuspenduj w stężeniu 1 milion komórek/ml w CM, jak opisano wcześniej. Pipetuj 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do 3 dołków na każdej płytce.</li>
	<li>Dodaj do dołków 0,1 mL lizatu CMV w 100ul CM</li>
	<li>Dodaj 200 mL CM do 6 dołków na wszystkich płytkach jako kontrolę negatywną i dodaj 200mL PBS do pustych dołków. Umieść płytki w inkubatorze.</li>
</ol>
7. Pomiar proliferacji w pierwotnych i wtórnych MLR
<ol>
	<li>Proliferację komórek respondera mierzy się za pomocą testu wbudowywania tymidyny w pierwotnych i wtórnych MLR. Proliferację ocenia się w 4., 5. i 6. dniu po przygotowaniu płytek do pierwotnego MLR oraz w 3., 5. i 7. dniu po przygotowaniu płytek do wtórnego MLR.</li>
	<li>Na 16 godzin przed zbiorem do studni dodaje się 1mCi tymidyny trytowanej</li>
	<li>Po dodaniu tymidyny trytowanej płytkę inkubuje się przez kolejne 16 godzin, a następnie materiał zbiera się na matę filtracyjną przy użyciu harvestera Tomtec (lub podobnego urządzenia). Matę filtracyjną suszy się na powietrzu przez jedną godzinę, następnie umieszcza w woreczku na próbki, dodaje 5 mL płynu scyntylacyjnego i szczelnie zamyka. Płytkę odczytuje się w liczniku scyntylacyjnym Wallac Micro beta lub podobnym urządzeniu.</li>
</ol>
8. Obliczanie skuteczności blokady kostymulującej w pierwotnej reakcji MLR
<ol>
	<li>Procent hamowania (PI) pierwotnych odpowiedzi allogenicznych oblicza się jako 100 x [średnie cpm w studzienkach allostymulacji (masowa ko-kultura PBMC w stanie aloanergi) - średnie cpm w studzienkach allostymulacji (masowa ko-kultura kontrolna PBMC)} 
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Wzór na indeks proliferacji komórek; PI=100-{100*cpm(pierwotne MLR+CSB)/cpm(pierwotne MLR bez CSB)}" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
9. Obliczanie skuteczności alloanergizacji w wtórnej reakcji MLR
Wskaźnik PI wtórnych odpowiedzi allogenicznych jest obliczany jako 
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Wzór na wskaźnik proliferacji, równanie PI w immunologii, obliczanie szybkości proliferacji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2">
10. Obliczanie swoistości aloanergyzacji w wtórnej reakcji MLR
<ol>
	<li>Po ponownej stymulacji komórek za pomocą CD3 i CD28, allostymulatorów TP lub antygenu CMV, można również obliczyć PI odpowiedzi na te bodźce, korzystając z powyższego wzoru. Pozwala to na określenie swoistości procesu alloanergizacji</li>
</ol>
11. Generowanie alloanergicznych PBMC od dawcy do zastosowań klinicznych po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)
<ol>
	<li>Alloanergizowane PBMC dawcy do użytku klinicznego można wygenerować po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwi obwodowej (HSCT) z niedopasowaniem HLA, stosując opisany powyżej protokół</li>
	<li>Podczas generowania komórek do użytku klinicznego, PBMC respondenta pozyskuje się od dawcy HSCT, a PBMC stymulatora od biorcy HSCT przed transplantacją.</li>
	<li>Przy generowaniu PBMC do użytku klinicznego wszystkie etapy są wykonywane zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) w akredytowanych ośrodkach przetwarzania komórek macierzystych.</li>
	<li>Przed dopuszczeniem komórek do użytku klinicznego przeprowadza się dodatkowe testy kontroli jakości, w tym testy na obecność endotoksyn, barwienie metodą Grama oraz posiewy, aby spełnić kryteria bezpieczeństwa</li>
</ol>
12. Reprezentatywne wyniki
Przy użyciu PBMC stymulatora i respondenta niedopasowanych pod względem HLA, obecność blokady kostymulującej w pierwotnej reakcji MLR redukuje średnią alloproliferację PBMC respondenta w 5. dniu do około 30% (+/- 10%, średnia +/- odchylenie standardowe) wartości obserwowanej w kontrolnej pierwotnej reakcji MLR bez blokady kostymulującej. Odpowiada to średniemu zahamowaniu pierwotnej alloproliferacji na poziomie około 70% (+/- 10%) w D5, Rycina 1 A i B.
W wtórnej reakcji MLR w 5. dniu, alloproliferacja FP alloanergetycznych PBMC wynosi zazwyczaj 10-15% (+/- 10%) wartości obserwowanej dla kontrolnych PBMC, co odpowiada średniemu zahamowaniu proliferacji na poziomie 85-90% (+/- 10%), Rysunek 2A i B. Dowodzi to, że alloanergetyczne PBMC są hiporeaktywne na allostymulatory FP.
W przeciwieństwie do tego, alloanergiczne PBMC zazwyczaj zachowują 70-100% swojej zdolności do proliferacji w odpowiedzi na mitogeny (przeciwciała CD3/CD28), allostymulatory TP oraz lizat CMV (u dawców reaktywnych na CMV). Dowodzi to, że hiporeaktywność alloanergicznych PBMC jest specyficzna dla alloantygenów FP.
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Efekt blokady kostymulującej na proliferację komórek: wykres liczby zliczeń/minutę w funkcji dni, dane dotyczące inhibicji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A.Proliferacja (oznaczona poprzez wbudowywanie tymidyny) w pierwotnej reakcji limfocytów mieszanych (MLR) z wykorzystaniem niedopasowanych pod kątem HLA komórek mononuklearnych krwi obwodowej (PBMC) stymulatora i respondenta w obecności lub przy braku blokady kostymulującej z użyciem humanizowanych przeciwciał monoklonalnych anty-B7.1 i -B7.2. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 reprezentatywnych eksperymentów z użyciem unikalnych par stymulator-respondent. B. Procentowa inhibicja alloproliferacji w pierwotnych MLR przeprowadzonych w obecności blokady kostymulującej z użyciem humanizowanych przeciwciał monoklonalnych anty-B7.1 i -B7.2. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla tych samych 8 unikalnych par stymulator-respondent przedstawionych na Rycinie 1A.
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Wykres proliferacji i inhibicji PBMC; wykresy dwuliniowe; liczba komórek w funkcji dnia; procent w funkcji dnia; badanie immunologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. A. Proliferacja (oznaczona poprzez wbudowywanie tymidyny) w wtórnych reakcjach MLR, w których PBMC odpowiadające z pierwotnych MLR przeprowadzonych wobec braku (PBMC kontrolne) lub obecności blokady kostymulującej (PBMC alloanergiczne) są restymulowane napromieniowanymi stymulatorami pierwszej strony. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 unikalnych par stymulator-responder przedstawionych na Rysunku 1. B. Procentowa inhibicja alloproliferacji pierwszej strony w wtórnych reakcjach MLR, w których PBMC odpowiadające z pierwotnych MLR przeprowadzonych wobec braku (PBMC kontrolne) lub obecności blokady kostymulującej (PBMC alloanergiczne) są restymulowane napromieniowanymi stymulatorami pierwszej strony. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 unikalnych par stymulator-responder przedstawionych na Rysunku 1 oraz Rysunku 2A.

<ol><li>Ferrara, J. L., Levy, R., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologic+mechanisms+of+acute+graft-vs.-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologic mechanisms of acute graft-vs.-host disease.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 5, 347-356 (1999).</li>
<li>Keever, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reconstitution+following+bone+marrow+transplantation%3A++Comparison+of+recipients+of+T-cell+depleted+marrow+with+recipients+of+conventional+marrow+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immune reconstitution following bone marrow transplantation: Comparison of recipients of T-cell depleted marrow with recipients of conventional marrow grafts.</a> Blood. 73, 1340-1350 (1989).</li>
<li>Bacigalupo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+leukemia+relapse+with+high-dose+cyclosporine+A+after+allogeneic+marrow+transplantation+for+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased risk of leukemia relapse with high-dose cyclosporine A after allogeneic marrow transplantation for acute leukemia.</a> Blood. 77, 1423-1428 (1991).</li>
<li>Horowitz, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-leukemia+reactions+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-leukemia reactions after bone marrow transplantation.</a> Blood. 75, 555-562 (1990).</li>
<li>Andre-Schmutz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reconstitution+without+graft-versus-host+disease+after+haemopoietic+stem-cell+transplantation%3A+a+phase+1%2F2+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Immune reconstitution without graft-versus-host disease after haemopoietic stem-cell transplantation: a phase 1/2 study.</a> Lancet. 360, 130-137 (2002).</li>
<li>Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+with+allodepleted+donor+T-cells+improves+immune+reconstitution+after+haploidentical+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy with allodepleted donor T-cells improves immune reconstitution after haploidentical stem cell transplantation.</a> Blood. 108, 1797-1808 (2006).</li>
<li>Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+donor+alloreactive+T+cells+without+loss+of+antiviral+or+antileukemic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of donor alloreactive T cells without loss of antiviral or antileukemic responses.</a> Blood. 102, 2292-2299 (2003).</li>
<li>Perruccio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+purging+of+alloreactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Photodynamic purging of alloreactive T cells for adoptive immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation.</a> Blood Cells Mol Dis. 40, 76-83 (2008).</li>
<li>Mielke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+FOXP3%2B+regulatory+T+cells+%28Tregs%29+after+CD25-depleted+allotransplantation+in+elderly+patients+and+association+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of FOXP3+ regulatory T cells (Tregs) after CD25-depleted allotransplantation in elderly patients and association with acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 110, 1689-1697 (2007).</li>
<li>Gribben, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+blockade+of+B7+family-mediated+costimulation+is+necessary+to+induce+human+alloantigen-specific+anergy%3A+a+method+to+ameliorate+graft-versus-host+disease+and+extend+the+donor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Complete blockade of B7 family-mediated costimulation is necessary to induce human alloantigen-specific anergy: a method to ameliorate graft-versus-host disease and extend the donor pool.</a> Blood. 87, 4887-4893 (1996).</li>
<li>Davies, J. K., Yuk, D., Nadler, L. M., Guinan, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alloanergy+in+human+donor+T+cells+without+loss+of+pathogen+or+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Induction of alloanergy in human donor T cells without loss of pathogen or tumor immunity.</a> Transplantation. 86, 854-864 (2008).</li>
<li>Davies, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+alloanergized+haploidentical+bone+marrow+transplantation+after+ex+vivo+costimulatory+blockade%3A+results+of+2+phase+1+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Outcome of alloanergized haploidentical bone marrow transplantation after ex vivo costimulatory blockade: results of 2 phase 1 studies.</a> Blood. 112, 2232-2241 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Indukcja hiporeaktywności specyficznej dla alloantygenu, czyli anergii, w PBMC dawcy poprzez alostymulację w obecności blokady kostymulacyjnej jest prostą techniką generowania PBMC dawcy o zredukowanej aloreaktywności. Opracowaliśmy ten proces w laboratorium i obecnie stosujemy tę strategię w praktyce klinicznej w celu uzyskania PBMC dawcy o zredukowanej aloreaktywności do infuzji po allogenicznym HSCT z niedopasowaniem HLA. Celem zastosowania takiej terapii jest poprawa reconstitucji immunologicznej bez nadmiernej toksyczności. Choć nasze obecne kliniczne zastosowanie tej strategii ogranicza się do kontekstu allogenicznego HSCT, podejście to mogłoby zostać zastosowane w innych sytuacjach, w których uszkodzenia tkanek są powodowane przez niepożądane odpowiedzi limfocytów T, takich jak odrzucanie transplantacji narządów stałych czy schorzenia autoimmunologiczne.
Do blokowania sygnałów kostymulujących zależnych od CD28 podczas procesu współhodowli w alloanergizacji można zastosować kilka odczynników. W niniejszej procedurze opisujemy nasz aktualny protokół z wykorzystaniem humanizowanych mysich przeciwciał monoklonalnych klasy klinicznej skierowanych przeciwko ligandom CD28 (B7.1 i B7.2). Mysie przeciwciała antyludzkie B7.1 i B7.2 klasy nieklinicznej są dostępne komercyjnie u kilku producentów. Alternatywnie, do blokowania kostymulacji CD28 podczas procesu alloanergizacji można użyć białka fuzyjnego CTLA4-Ig (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4-Immunoglobulin). CTLA4-Ig, składający się z części zewnątrzkomórkowej cząsteczki CTLA4 połączonej z receptorem Fc gamma IgG, wiąże się z wysokim powinowactwem do B7.1 i B7.2. Zastosowanie CTLA4-Ig skutkuje podobną skutecznością i specyficznością alloanergizacji ludzkich PBMC.
Technika alloanergetyzacji jest prosta w wykonaniu. Do procesu można wykorzystać świeże lub wcześniej kriokonserwowane PBMC stymulatora bez istotnych różnic w końcowym wyniku. Wymaganie jedynie jednego, stosunkowo krótkiego etapu inkubacji ex vivo, bez konieczności stosowania procedur sortowania komórek, minimalizuje ryzyko śmierci komórek oraz ich kontaminacji bakteryjnej przed infuzją, co sprawia, że strategia ta jest stosunkowo łatwa do zastosowania w skali klinicznej.
Jednym z ograniczeń opisywanego przez nas podejścia (oraz innych metod selektywnego zmniejszania alloreaktywności komórek ludzkich) jest brak testu w czasie rzeczywistym pozwalającego określić pozostałą alloreaktywność. Testy proliferacji wymagają od 3 do 5 dni w celu potwierdzenia zmniejszenia alloreaktywności, a komórki przygotowane do zastosowania klinicznego muszą zostać przetoczone, zanim wyniki tych testów będą dostępne. Co więcej, pomiar proliferacji PBMC poprzez wbudowywanie tymidyny, choć jest łatwy do wykonania, mierzy proliferację limfocytów B oraz innych podzbiorów komórek oprócz proliferacji limfocytów T. Jako alternatywny test można zastosować rozcieńczanie barwnika CFSE w odpowiadających PBMC, co pozwala na oznaczenie alloproliferacji specyficznej dla podzbiorów limfocytów T. Jednym ze sposobów poprawy zastosowania klinicznego naszej strategii byłoby opracowanie i walidacja testu alloreaktywności, którego wykonanie zajmuje zaledwie kilka godzin, co umożliwiłoby jego przeprowadzenie przed zwolnieniem alloanergizowanych komórek do użytku klinicznego.
Oprócz wykazania skuteczności strategii, istotne jest również potwierdzenie swoistości procesu alloanergizacji. Można to łatwo przeprowadzić poprzez oznaczenie względnego zachowania alloresponsi swoistych dla allostymulatorów pochodzących od osób trzecich, a w przypadku alloanergizacji komórek donora reaktywnych na CMV – poprzez zachowanie odpowiedzi proliferacyjnej na CMV

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Hypaque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB (inaktywowana ciepłem)</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-512</td><td>Stosować partie zwalidowane</td></tr><tr><td>Pełna pożywka hodowlana (500ml)</td><td></td><td></td><td>440ml RPMI 1640, 50ml surowicy AB, 5ml Hepesu, 5 ml glutaminy, 167µL gentamycyny</td></tr><tr><td>Naświetlacz</td><td>GammaCell 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flaski do hodowli komórkowych T-25 z nakrętkami przepuszczającymi gazy</td><td>Corning</td><td>3056</td><td></td></tr><tr><td>Humanizowane przeciwciała monoklonalne anty-B7.1 i anty B7.2</td><td></td><td></td><td>Patrz w tekście protokołu</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki hodowlane o dnie w kształcie litery U</td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0178</td><td>Rekonstytuować w 200ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD28</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM1376</td><td>Rekonstytuować w 200ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>Antygen CMV klasy 2</td><td>Microbix</td><td>EL-01-02</td><td></td></tr><tr><td>Trytyzowana tymydyna</td><td>NEN</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1205-440</td><td></td></tr><tr><td>Harvester (zbieracz)</td><td>Tomtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukarka do filtrów Filtermat A</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Worek na filtry</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1450-432</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny 1450 MicroBeta TriLux</td><td>Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">null</td></tr></tbody></table>

indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeniczne przeszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych (AHSCT) daje największą szansę na wyleczenie wielu pacjentów z wrodzonymi i nabytymi chorobami hematologicznymi. Niestety, przeszczepienie alloreaktywnych limfocytów T dawcy, które rozpoznają i uszkadzają zdrowe tkanki pacjenta, może prowadzić do choroby przeszczep kontra gospodarz (GvHD)1. Jednym z wyzwań w skutecznym AHSCT jest zapobieganie GvHD bez jednoczesnego upośledzenia korzystnych efektów limfocytów T dawcy, w szczególności odbudowy odporności i zapobiegania nawrotom choroby. Można zapobiegać GvHD poprzez nieswoistą deplecję limfocytów T dawcy z graftów komórek macierzystych lub poprzez stosowanie farmakologicznej immunosupresji. Niestety, podejścia te zwiększają ryzyko infekcji i nawrotu choroby2-4. Alternatywną strategią jest selektywna deplecja alloreaktywnych limfocytów T dawcy po allostymulacji przez antygenprezentujące komórki (APC) biorcy przed przeszczepem. Wczesne badania kliniczne tych strategii allodeplecji poprawiły odbudowę odporności po HSCT z niezgodnością HLA bez nadmiernego występowania GvHD5, 6. Jednak niektóre techniki allodeplecji wymagają specjalistycznej produkcji APC biorcy6, 7, a niektóre podejścia mogą wywoływać efekty pozatarczasowe, w tym deplecję specyficznych dla patogenów limfocytów T dawcy8 oraz regulatorowych limfocytów T CD49. Jednym z alternatywnych podejść jest inaktywacja alloreaktywnych limfocytów T dawcy poprzez indukcję hiporeaktywności specyficznej dla alloantygenu. Osiąga się to poprzez stymulowanie komórek dawcy za pomocą APC biorcy przy jednoczesnej blokadzie sygnałów kostymulacji zależnych od CD2810. To podejście „alloanergyzacji” redukuje alloreaktywność o 1-2 rzędy wielkości, zachowując in vitro odpowiedzi limfocytów T na antygeny związane z patogenami i guzami11. Strategia ta została z powodzeniem zastosowana w 2 zakończonych i 1 trwającym pilotażowym badaniu klinicznym, w których alloanergyzowane limfocyty T dawcy były infundowane w trakcie lub po HSCT z niezgodnością HLA, co skutkowało szybką odbudową odporności, niewielką liczbą infekcji oraz mniej nasiloną ostrą i przewlekłą postacią GvHD w porównaniu do historycznych grup kontrolnych biorców po niezmodyfikowanym przeszczepie z niezgodnością HLA12. W niniejszym opracowaniu opisujemy nasz aktualny protokół generowania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC), które zostały poddane alloanergyzacji względem niezgodnych pod względem HLA PBMC stymulatora od niespokrewnionego dawcy. Alloanergyzację osiąga się poprzez allostymulację w obecności przeciwciał monoklonalnych przeciwko ligandom B7.1 i B7.2 w celu zablokowania kostymulacji zależnej od CD28. Technika ta nie wymaga produkcji specjalistycznych APC stymulatora i jest prosta w wykonaniu, wymagając jedynie jednego, stosunkowo krótkiego etapu inkubacji ex vivo. W związku z tym podejście to można łatwo zestandaryzować do użytku klinicznego w celu generowania limfocytów T dawcy o zredukowanej alloreaktywności, ale zachowującej specyficzną dla patogenów odporność, do transferu adoptywnego w ramach AHSCT, aby poprawić odbudowę odporności bez nadmiernego GvHD.

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Allogeniczna transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych (AHSCT) daje największą szansę na wyleczenie wielu pacjentów z wrodzonymi i nabytymi schorzeniami hematologicznymi ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest aktywacja allospecyficznych limfocytów T dawcy przez stymulację ex vivo antygenami allo biorcy w obecności przeciwciał blokujących kostymulację limfocytów T przez komórki prezentujące antygen za pośrednictwem receptora CD 28. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wyizolowanie PBMC od dwóch różnych zdrowych dawców. Następnie tworzona jest masowa kokultura aktywująca allo poprzez inkubację populacji PBMC niedopasowanych pod względem HLA w obecności przeciwciał monoklonalnych przeciwko ligandom B 7.1 i B 7.2 w celu zablokowania stymulacji CD 28.Następnie skuteczność allo-energizacji jest mierzona za pomocą pierwotnych i wtórnych reakcji mieszanych limfocytów (MLR). Na koniec swoistość allo-energizacji jest oceniana poprzez oznaczenie odpowiedzi specyficznych dla CMV oraz dla osób trzecich. Uzyskane wyniki wykazują, że limfocyty T dawcy stają się hiporeaktywne na późniejszą stymulację alloantygenową, podczas gdy limfocyty T dawcy niereaktywne w sposób allo pozostają nienaruszone i funkcjonalne.Z sukcesem zastosowaliśmy tę strategię w poprzednich i trwających pilotażowych badaniach klinicznych dotyczących infuzji allostymulowanych komórek T dawcy podczas i po transplantacji komórek macierzystych przy niezgodności HLA, obserwując poprawę reconstitucji odporności, mniejszą liczbę infekcji oraz mniej nasilone ostre i przewlekłe reakcje przeszczep przeciwko gospodarzowi w porównaniu z historyczną grupą kontrolną biorców niezmodyfikowanych przeszczepów przy niezgodności HLA. Główną zaletą strategii allostymulacji jest minimalizacja efektów poza celowych, ponieważ technika ta nie redukuje odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla patogenów lub antygenów związanych z nowotworem ani nie eliminuje regulacyjnych komórek T CD4 z puli limfocytów T dawcy. Procedurę zaprezentuje Christine Vin, naukowiec w naszym laboratorium. Pierwszym krokiem jest pobranie krwi od dwóch zdrowych ochotników będących dawcami.Komórki od jednego dawcy będą służyć jako komórki odpowiadające, a komórki od innego dawcy jako komórki stymulujące. Następnie wyizoluj PBMC z krwi metodą wirowania w gradiencie gęstości przy użyciu fial pac. Barw niewielką ilość komórek błękitem trypanowym i policz żywe PBMC za pomocą hemo cytometer reus.Rozdziel PBMC od każdego dawcy w objętości 10 mililitrów pełnej pożywki hodowlanej, przy stężeniu 1 miliona żywych komórek na mililitr, do osobnych probówek stożkowych o pojemności 15 mililitrów. Wyznacz jedną probówkę z PBMC dawcy jako stymulatory, a drugą jako respondery, aby przygotować masową ko-kulturę aktywacji allogenicznej.Dodaj 100 µg przeciwciał anty-B 7.1 i anty-B 7.2 do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej jako stymulator. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i inkubuj przez 30 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji napromieniuj PBMC stymulatora i przenieś je do kolby hodowlanowej T 25 o pojemności 50 cm³ z przepuszczalną dla gazów zakrętką.Oznacz kolbę jako hodowlę allogenicznego węgla masowego. Następnie do kolby dodaj 10 mililitrów PBMC respondenta od innego dawcy w stężeniu 1 milion na mililitr w podłożu kompletnym. Do kolby dodaj kolejne 100 mikrogramów każdego z przeciwciał antib 7.1 i Antib 7.2, a następnie delikatnie wymieszaj przed umieszczeniem kolby w pozycji pionowej w inkubatorze na 72 godziny.Następnie naświetl kolejne 10 milionów PBMC stymulatora do przygotowania kontrolnej kokultury masowej bez przeciwciał blokujących, a następnie przenieś je do kolby hodowlaną o pojemności 25 cm² (50 cm³). Opisz kolbę jako bulk control co-culture. Do kolby dodaj 10 ml tych samych PBMC respondenta, które zostały użyte do masowej kokultury alloenergetyzującej, w stężeniu 1 milion na ml w pełnej pożywce, i delikatnie wymieszaj przed ustawieniem kolby pionowo w inkubatorze na 72 godziny.Kolejnym krokiem jest pomiar funkcji puli allostymulowanych donatorskich limfocytów T w tym samym dniu, w którym przygotowano zbiorcze hodowle współhodowlane. Do każdego z trzech mierzonych punktów czasowych należy przygotować pierwotną reakcję MLR w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Następnie należy przelać 5 ml z każdej zbiorczej hodowli kontrolnej oraz allostymulowanej współhodowli do probówek o pojemności 15 ml.Następnie pipetuj 200 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w dołkach na każdej z trzech płytek. Dołki z komórkami z masowych kultur kontrolnych w niskiej temperaturze oznacz jako „brak blokady kostymulującej” lub „no CSB”, a dołki z komórkami z masowych kultur allostymulujących w niskiej temperaturze oznacz jako „CSB”. Następnie do sześciu dołków na każdej płytce dodaj 200 µL pożywki kompletnej jako kontrole negatywne.Na koniec dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studni, aby ograniczyć parowanie, a następnie umieść płytki w inkubatorze na 72 h po przygotowaniu zbiorczych kokultur. Oznacz jedną płytkę 96-dołkową UBO jako „wtórny MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych. Aby przygotować komórki respondera do wtórnego MLR, przenieś 5 ml z każdej z kontrolnych oraz alloenergetyzujących zbiorczych kokultur do probówek o pojemności 15 ml i wiruj je przez 5 do 10 min przy 2000 RPM w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie aspirując supernatanty, rozbijając osady, dodając 10 ml pełnej pożywki do każdej probówki, a następnie ponownie wirując komórki po drugim przemyciu.Resuspendować komórki w 1 ml pełnej pożywki. Wykorzystać barwienie błękitem trypanowym do policzenia żywych komórek i dostosować stężenie komórek do poziomu 1 miliona żywych komórek responderów na 1 ml. Pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w każdej płytce.Oznacz te studzienki jako stymulacja pierwszej strony lub stop stopu FP. Następnie pipetuj 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do kolejnych trzech studzienek na każdej płytce i oznacz te studzienki jako stymulacja CD 3/28 PBMC od tego samego dawcy, który dostarczył PBMC stymulatora pierwszej strony do allo. Energetyzowane i kontrolne kokultury są używane jako komórki stymulujące dla wtórnego MLR; zawieś 10 milionów PBMC dawcy pierwszej strony w stężeniu 1 milion/mL i dodaj irradiat.100 µL napromieniowanych komórek stymulujących do studzienek oznaczonych jako fp allo restimulation na każdej wtórnej płytce MLR. Jako kontrole dodatnie dodaj po 1 µL przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD28 oraz 98 µL pełnej pożywki do studzienek oznaczonych jako CD 3 28 stimulation na każdej wtórnej płytce MLR. Dodatkowo dodaj 200 µL pełnej pożywki do sześciu pustych studzienek na każdej płytce, aby służyły jako kontrole ujemne, oraz dodaj 200 µL PBS do wszystkich pozostałych pustych studzienek w celu ograniczenia parowania.Umieść płytki w inkubatorze. Kolejnym krokiem jest pomiar swoistości; do przetestowania swoistości procesu allo w wtórnej reakcji MLR wykorzystuje się allo PBMC izolowane od nowego zdrowego dawcy, nazwanego dawcą trzecim. Zawiesić PBMC od dawcy trzeciego w stężeniu 1 milion komórek na mililitr i napromieniować; oznakować 3 płytki 96-dołkowe dla wtórnej MLR na określenie swoistości w dniu trzecim, piątym i siódmym.Aby przygotować komórki odpowiadające do wtórnej reakcji mieszanej leukocytów (MLR) w celu pomiaru swoistości, przenieś pięć mililitrów z każdej z masowych kokultur kontrolnych i allostymulujących do probówek o pojemności 15 mililitrów i wiruj probówki od pięciu do 10 minut przy 2000 RPM. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie odsysając nadsączniki, rozbijając osady, dodając 10 mililitrów pełnej pożywki do każdej probówki i ponownie wirując komórki po drugim przemyciu. Resuspenduj komórki w jednym mililitrze pełnej pożywki.Zastosuj barwienie błęknitem trypanowym w celu policzenia komórek i dostosuj stężenie komórek do poziomu 1 miliona żywych komórek respondujących na mililitr, a następnie pipetuj 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórnych studni na każdej płytce. Oznacz te studnie jako TP lub stymulacja allo strony trzeciej. Następnie dodaj 100 µL naświetlonych komórek stymulatorów TP do studni oznaczonych jako stymulacja allo TP.Aby dalej przetestować swoistość odpowiedzi allo, mierzy się odpowiedzi na patogeny po energizacji PBMC od dawców z uprzednio ustalonymi odpowiedziami proliferacyjnymi na CMV etykieta 3 96. Płytki wielodołkowe wtórne M-L-R-C-M-V dzień trzeci, piąty i siódmy, a następnie przenieść 5 ml z każdej z kontrolnych kultur masowych oraz allo-energizujących kultur współdzielonych do probówek o pojemności 15 ml. Następnie wyprać, policzyć i resuspenderć komórki w stężeniu 1 milion na ml w kompletnej pożywce, pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech dołków na każdej płytce i oznaczyć te dołki jako stymulacja CMV.Następnie dodaj 0,1 µL lizatu CMV w 100 µL kompletnej pożywki do studni oznaczonych jako stymulacja CMV. Następnie dodaj 200 µL kompletnej pożywki do sześciu studni na każdej płytce jako kontrole negatywne. Na koniec dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studni, aby ograniczyć parowanie, i umieść płytki w inkubatorze w celu pomiaru proliferacji w pierwotnej i wtórnej reakcji MLR.Dodaj jeden mikrokuri tritylowanej tymidyny do kontroli negatywnej oraz do dołków zawierających komórki na 16 godzin przed zebraniem płytek. Zbierz tymidynę na jednej macie filtracyjnej dla każdej płytki, korzystając z systemu TomTec harvester lub podobnego urządzenia. Susz maty filtracyjne przez jedną godzinę.Następnie umieść je w oddzielnych woreczkach na próbki. Do każdego z nich dodaj 5 mL płynu scyntylacyjnego i szczelnie zamknij. Zmierz wbudowanie tritiu-tymidyny w ciągu ostatnich 16 godzin eksperymentu, odczytując maty filtracyjne za pomocą mikrobeta-licznika scyntylacyjnego Wallach lub urządzenia podobnego, wykorzystując PBMC stymulatora i respondenta przy niezgodności HLA.Na tej rycinie widać, że obecność blokady kostymulacyjnej w pierwotnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) redukuje średnią alloproliferację PBMC responderów w piątym dniu do około 30% wartości obserwowanej w kontrolnej pierwotnej MLR bez blokady kostymulacyjnej. Odpowiada to średniemu zahamowaniu pierwotnej alloproliferacji na poziomie około 70% w piątym dniu. Jak pokazano na tej rycinie.Na tej figurze widać, że w wtórnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) proliferacja PBMC aktywowanych allogenicznie w odpowiedzi na stymulację allogeniczną pierwszej strony w piątym dniu zazwyczaj wynosi od 10 do 15% wartości obserwowanej dla kontrolnych PBMC. Odpowiada to średniemu zahamowaniu proliferacji na poziomie 85 do 90%, co wykazuje, że PBMC aktywowane allogenicznie są hiporeaktywne na stymulatory allogeniczne pierwszej strony. Jak wynika z tej figury, po opanowaniu metody, masowe kokultury z allogenicznie aktywowanymi mononuklearnymi komórkami krwi obwodowej dawcy można przygotować w ciągu dwóch do trzech godzin.Metodę tę można łatwo zestandaryzować do zastosowań klinicznych w celu generowania limfocytów T dawcy o zredukowanej alloreaktywności, przy zachowaniu odporności specyficznej przeciwko patogenom. Takie komórki mogą być przenoszone adoptywnie w kontekście allogenicznego przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych, aby poprawić odbudowę odporności bez wywoływania nadmiernej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować sprawnie.Pomaga to zachować żywotność komórek oraz zapobiega nieswoistej aktywacji lub utracie komórek prezentujących antygen. W przypadku użycia krio-konserwowanych PBMC jako stymulatorów lub responderów, należy zastosować zwalidowany protokół reanimacji zamrożonych komórek, który zapewnia stabilnie wysoką wydajność uzyskiwania żywotnych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić allo-immunizację ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej oraz jak wykonać testy oceniające skuteczność i swoistość tej procedury; opisana strategia może być wykorzystana do generowania ludzkich komórek T od dawcy o zredukowanej odpowiedzi allogenicznej, co może być zastosowane klinicznie w celu poprawy rekonstrukcji immunologicznej po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

induction-alloantigen-specific-anergy-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Indukcja anergii specyficznej dla allantygenu w ludzkich obwodowych krwinkach jednojądrzastych poprzez stymulację allantygenem z blokadą sygnału współstymulującego

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Poznaj metodę indukcji anergii swoistej dla alloantygenu w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej poprzez blokadę kostymulacji CD28. Technika ta generuje nieraktywne allo komórki T z zachowaną odpornością na patogeny.

Indukcja swoistej dla alloantygenu anergii w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenu z kostymulacyjną blokadą sygnału (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Przeglądaj więcej filmów