Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest aktywacja allo-specyficznych limfocytów T dawcy przez biorcę poprzez stymulację ex vivo antygenami allo biorcy w obecności przeciwciał blokujących kostymulację limfocytów T przez komórki prezentujące antygen za pośrednictwem receptora CD 28. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyizolowanie PBMC od dwóch różnych zdrowych dawców. Następnie tworzona jest masowa ko-kultura aktywująca allo poprzez inkubację niedopasowanych pod względem HLA populacji PBMC w obecności przeciwciał monoklonalnych przeciwko ligandom B 7.1 i B 7.2 w celu zablokowania stymulacji CD 28.

Następnie skuteczność energizacji allogenicznej jest mierzona za pomocą pierwotnych i wtórnych mieszanych reakcji limfocytarnych (MLR). Na koniec swoistość allogeniczna energizacji jest oceniana poprzez wyznaczenie odpowiedzi specyficznych dla CMV oraz dla osób trzecich. Uzyskane wyniki wykazują, że limfocyty T dawcy stają się hiporeaktywne na późniejszą stymulację antygenami allogenicznymi, natomiast niealloreaktywne limfocyty T dawcy pozostają nienaruszone i funkcjonalne.

Strategię tę z sukcesem zastosowaliśmy w poprzednich i trwających pilotażowych badaniach klinicznych nad infuzją allostymulowanych limfocytów T od dawców w trakcie i po transplantacji komórek macierzystych przy niezgodności HLA; zaobserwowano poprawę odbudowy odporności, rzadsze występowanie infekcji oraz łagodniejszy przebieg ostrej i przewlekłej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi w porównaniu z historyczną grupą kontrolną odbiorców niezmodyfikowanych przeszczepów przy niezgodności HLA. Główną zaletą strategii alloanodyzacji jest minimalizacja efektów pozatargetowych, ponieważ technika ta nie redukuje odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla patogenów lub antygenów związanych z nowotworem ani nie eliminuje regulatorowych limfocytów T CD4 z puli limfocytów T dawcy, co dowodzi skuteczności procedury. Christine Vin, naukowiec w naszym laboratorium, zaprezentuje metodę. Pierwszym krokiem jest pobranie krwi od dwóch zdrowych dawców-ochotników.

Komórki od jednego dawcy będą służyć jako responder, a komórki od innego dawcy jako stymulator. Następnie wyizoluj PBMC z krwi metodą wirowania w gradiencie gęstości przy użyciu fial pac. Wybarw niewielką ilość komórek błękitem trypanowym i policz żywe PBMC za pomocą hemo cytometer reus.

Rozdziel PBMC od każdego dawcy w ilości 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej przy stężeniu 1 miliona żywych komórek na ml do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Wyznacz jedną probówkę PBMC dawcy jako stymulatory, a drugą jako respondery, aby przygotować masową ko-kulturę aktywacyjną allogeniczną.

Dodaj 100 µg przeciwciał anti B 7.1 i anti B 7.2 do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej jako stymulator. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i inkubuj przez 30 minut. Po okresie inkubacji napromieniuj PBMC stymulatora i przenieś je do kolby hodowlanej T 25 o pojemności 50 cm³ z przepuszczalną dla gazów zakrętką.

Oznakuj kolbę jako hodowlę allo-węgla (allo coal culture). Następnie do kolby dodaj 10 mililitrów PBMC respondenta od innego dawcy w stężeniu 1 milion na mililitr w pełnej pożywce. Dodaj do kolby kolejne 100 mikrogramów każdego z przeciwciał antib 7.1 i Antib 7.2, a następnie delikatnie wymieszaj przed umieszczeniem kolby w pozycji pionowej w inkubatorze na 72 godziny.

Następnie napromieniuj kolejne 10 milionów PBMC stymulatora dla kontrolnej ko-kultury zbiorczej bez przeciwciał blokujących, a następnie przenieś je do kolby hodowlanej T 25 o pojemności 50 cm³. Oznacz kolbę jako kontrolna ko-kultura zbiorcza. Do kolby dodaj 10 ml tych samych PBMC respondenta, których użyto do zbiorczej energizującej ko-kultury allogenicznej, w stężeniu 1 milion na ml w pożywce kompletnej i delikatnie wymieszaj przed ustawieniem kolby pionowo w inkubatorze na 72 godziny.

Kolejnym krokiem jest pomiar funkcji puli allostymulowanych donorskich limfocytów T w tym samym dniu, w którym etykietowano kultury zbiorcze. Do dołków płytki 96-dołkowej typu U przygotuj pierwotną reakcję MLR dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych. Następnie przelej 5 mL z każdej z kontrolnych kultur zbiorczych oraz allostymulowanych kokultur do probówek o pojemności 15 mL.

Następnie pipetujemy 200 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w dołkach na każdej z trzech płytek. Dołki z komórkami z kontrolnych kultur zbiorczych w niskiej temperaturze oznaczamy jako brak blokady kostymulującej lub brak CSB, a dołki z komórkami z alloenergetyzujących kultur zbiorczych w niskiej temperaturze jako CSB. Następnie do sześciu dołków na każdej płytce dodajemy 200 µL pożywki kompletnej jako kontrole negatywne.

Na koniec, aby ograniczyć parowanie, dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studzienek i umieść płytki w inkubatorze na 72 h po przygotowaniu masowych kokultur. Oznacz jedną płytkę U-bottom 96-dołkową jako „wtórny MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych. Aby przygotować komórki odpowiadające do wtórnego MLR, przenieś 5 mL z każdej z masowych kokultur kontrolnych i allostymulujących do probówek o pojemności 15 mL i wiruj probówki przez 5–10 min przy 2000 RPM w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie odsysając nadsącz, resuspensując osad, dodając 10 mL pełnej pożywki do każdej probówki, a następnie ponownie wirując komórki po drugim przemyciu.

Resuspender komórki w 1 ml pełnej pożywki. Wykorzystać barwienie błękitem trypanu do policzenia żywych komórek i dostosować ich stężenie do 1 milion żywych komórek respondujących na 1 ml. Pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórnych dołków na każdej płytce.

Oznacz te studzienki jako stymulacja pierwszej strony (first party) lub stop alloy. Następnie pipetuj 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do kolejnych trzech studzienek na każdej płytce i oznacz te studzienki jako stymulacja CD 3/28 PBMC od tego samego dawcy, który dostarczył PBMC stymulatora pierwszej strony dla allo. Energizowane i kontrolne kokultury są wykorzystywane jako komórki stymulatora dla wtórnego MLR. Zawieś 10 milionów PBMC dawcy pierwszej strony w stężeniu 1 milion/mL i napromieniuj.

100 µL napromieniowanych komórek stymulujących do studniek oznaczonych jako fp allo restimulation na każdej wtórnej płytce MLR. W celu przygotowania kontroli pozytywnych, dodaj po 1 µL przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD28 oraz 98 µL kompletnego medium do studniek oznaczonych jako CD 3 28 stimulation na każdej wtórnej płytce MLR. Dodatkowo, dodaj 200 µL kompletnego medium do sześciu pustych studniek na każdej płytce, aby służyły jako kontrole negatywne, oraz dodaj 200 µL PBS do wszystkich pozostałych pustych studniek w celu ograniczenia parowania.

Umieść płytki w inkubatorze. Kolejnym krokiem jest pomiar swoistości; do przetestowania swoistości procesu allo w wtórnym MLR wykorzystuje się allo PBMC wyizolowane od nowego zdrowego dawcy, określanego jako dawca trzeciej strony. Zawiesić PBMC dawcy trzeciej strony w stężeniu 1 milion komórek na ml, a następnie naświetlić i oznakować 3 płytki 96-dołkowe dla wtórnego MLR w celu badania swoistości w trzecim, piątym i siódmym dniu.

Aby przygotować komórki odpowiadające do wtórnej reakcji MLR w celu pomiaru swoistości, przenieś pięć mililitrów z każdej z objętościowych kokultur kontrolnych oraz kokultur allostymulujących do probówek o pojemności 15 mililitrów i wiruj je przez 5 do 10 minut przy 2000 RPM. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie odsysając nadsącz, rozbijając pellety, dodając 10 mililitrów pełnej pożywki do każdej probówki i ponownie wirując komórki po drugim przemyciu. Resuspenduj komórki w jednym mililitrze pełnej pożywki.

Użyć barwienia błękitem trypanowym do zliczenia komórek i dostosować stężenie komórek do poziomu 1 milion żywych komórek respondera na mililitr, a następnie pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w dołkach każdej płytki. Oznaczyć te dołki jako TP lub stymulacja allogeniczna strony trzeciej. Następnie dodać 100 µL napromieniowanych komórek stymulatora TP do dołków oznaczonych jako stymulacja allogeniczna TP.

Aby dalej przetestować swoistość odpowiedzi allo, zmierzono reakcje na patogeny po energizacji PBMC od dawców z wcześniej ustalonymi odpowiedziami proliferacyjnymi na CMV etykieta 3 96. Płytki wielodołkowe wtórne M-L-R-C-M-V dzień trzeci, piąty i siódmy, a następnie przenieść 5 mL z każdej z kultur kontrolnych oraz kultur energizujących allo do probówek o pojemności 15 mL. Następnie przemyć, policzyć i resuspenderć komórki w stężeniu 1 milion na mL w pełnym medium; pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech dołków na każdej płytce i oznaczyć te dołki jako stymulacja CMV.

Następnie dodaj 0,1 µL lizatu CMV w 100 µL pełnej pożywki do studniek oznaczonych jako stymulacja CMV. Następnie dodaj 200 µL pełnej pożywki do sześciu studniek na każdej płytce jako kontrole negatywne. Na koniec dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studniek, aby ograniczyć parowanie, i umieść płytki w inkubatorze w celu pomiaru proliferacji w pierwotnej i wtórnej reakcji MLR.

Dodaj jeden mikrokuriy tritiated thymidine do kontroli negatywnej oraz do dołków zawierających komórki na 16 godzin przed zebraniem płytek. Zbierz tymidynę na jedną matę filtracyjną dla każdej płytki, używając urządzenia TomTec harvester lub podobnego urządzenia pneumatycznego. Susz maty filtracyjne przez jedną godzinę.

Następnie umieść je w oddzielnych woreczkach na próbki. Do każdego dodaj 5 mL płynu scyntylacyjnego i szczelnie zamknij. Zmierz wbudowanie tritiymidyny w ciągu ostatnich 16 godzin eksperymentu, odczytując maty filtracyjne za pomocą mikrobeta-licznika scyntylacyjnego Wallach lub urządzenia o podobnym działaniu, wykorzystując PBMC stymulatora i respondenta z niedopasowaniem HLA.

Na tej rysunku widać, że obecność blokady kostymulującej w pierwotnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) redukuje średnią alloproliferację PBMC respondery w piątym dniu do około 30% wartości obserwowanej w kontrolnej pierwotnej MLR w przypadku braku blokady kostymulującej. Odpowiada to średniemu zahamowaniu pierwotnej alloproliferacji na poziomie około 70% w piątym dniu, jak pokazano na tym rysunku.

Na tej figurze widać, że w wtórnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) proliferacja pierwszorazowa allo-stymulowanych PBMC w piątym dniu wynosi zazwyczaj od 10 do 15% wartości obserwowanej dla kontrolnych PBMC. Odpowiada to średniemu zahamowaniu proliferacji na poziomie 85 do 90%, co wykazuje, że allo-stymulowane PBMC wykazują hiporeaktywność na pierwszorazowe allo-stymulatory. Jak widać na tej figurze, po opanowaniu techniki można przygotować masowe kokultury z allo-stymulowanymi mononuklearnymi komórkami krwi obwodowej dawcy w ciągu dwóch do trzech godzin.

Podejście to można łatwo zstandaryzować do zastosowań klinicznych w celu generowania komórek T od dawcy o zredukowanej reaktywności allogenicznej, przy zachowaniu odporności specyficznej przeciw patogenom. Takie komórki mogą być przeniesione adoptywnie w ramach allogenicznego przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych, aby poprawić rekonstrukcję odporności bez wywoływania nadmiernej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować sprawnie i szybko.

Pomaga to zachować żywotność komórek oraz uniknąć niespecyficznej aktywacji lub utraty komórek prezentujących antygen. W przypadku stosowania kriokonserwowanych PBMC jako stymulatorów lub responderów, należy zastosować zwalidowany protokół reanimacji mrożonych komórek, który zapewnia stabilnie wysoką wydajność uzyskiwania żywych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić alloimmunizację ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej od dawcy oraz jak wykonywać analizy w celu oceny skuteczności i specyficzności tej procedury; strategia ta może być wykorzystana do generowania ludzkich limfocytów T od dawcy o zredukowanej odpowiedzi allogenicznej, co może być stosowane klinicznie w celu poprawy rekonstrukcji odporności po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.