Name: Inwazja patogenu bakteryjnego na komórki ludzkie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zdolności inwazyjnej szczepów bakterii Staphylococcus aureus wobec komórek śródbłonka ludzkiego. Protokół ten pozwala identyfikować białka bakteryjne zaangażowane w interakcje z gospodarzem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została sfinansowana przez Wellcome Trust (WT 0795880).

Poniższy protokół opisuje badanie inwazji komórek śródbłonka przez S. aureus, jednak teoretycznie może zostać wykorzystany do badania inwazji komórkowej przez każdą bakterię nadającą się do hodowli. Etapy specyficzne dla S. aureus oraz komórek śródbłonka zostały wskazane.
1. Przygotowanie bakterii
<ol>
 <li>Hodować szczepy S. aureus przez 4-16 h (w zależności od wymaganej fazy wzrostu) w 10 ml bulionu Brain-Heart Infusion (BHI) w temperaturze 37°C w powietrzu, przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm. Warunki wzrostu te są specyficzne dla S. aureus i mogą wymagać dostosowania w przypadku innych bakterii.</li>
 <li>Przemyć bakterie trzykrotnie w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM; Invitrogen) poprzez naprzemienne cykle wirowania w temperaturze pokojowej (5,000 x g, 10 min), usuwania nadsączu hodowli i resuspensji osadu bakteryjnego w równoważnej objętości DMEM. Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanej zawiesiny bakterii, którą można następnie dostosować zgodnie z potrzebami. Dla S. aureus przygotowujemy zawiesinę o OD600 = 1, co odpowiada ~109 cfu ml-1.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek śródbłonka
<ol>
 <li>Hodować linię komórek śródbłonka EA.hy926 1 w pożywce DMEM uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS; 10%) i L-glutaminę (2 mM) w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Alternatywnie można zakupić pulę pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs) od firmy Lonza (Bazylea, Szwajcaria) i hodować je w podstawowej pożywce dla komórek śródbłonka uzupełnionej o 2% FBS, ekstrakt z mózgu bydlęcego (zawierający heparynę), ludzki czynnik wzrostu śródbłonka oraz hydrokortyzon w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 zgodnie z instrukcjami producenta (Lonza). Warunki wzrostu te są specyficzne dla tych komórek i mogą wymagać dostosowania dla innych typów komórek gospodarza.</li>
 <li>Hodować komórki śródbłonka w kolbach T75 do uzyskania pełnej konfluencji, potwierdzonej wizualnie.</li>
 <li>Przygotować płytki 24-dołkowe do umieszczenia szkiełek nakrywkowych. Do przenoszenia szkiełek nakrywkowych, które mają jedną powierzchnię matową i jedną błyszczącą, niezbędna jest precyzyjna pęseta (sterylizowana płomieniem). Umieścić szkiełka nakrywkowe w dołkach płytki 24-dołkowej powierzchnią matową skierowaną do góry, aby umożliwić przyleganie komórek.</li>
 <li>Odseparować komórki z kolby T75 za pomocą 3 ml trypsyny-EDTA (0.25%) i dodać do 10 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Dodać 500 μl resuspensji komórek do płytek 24-dołkowych zawierających szklane szkiełka nakrywkowe Thermanox. Jedna konfluentna kolba T75 zapewniła wystarczającą liczbę komórek dla dwóch płytek 24-dołkowych, co dało około 5 × 105 komórek na dołek (w 500 μl pożywki).</li>
 <li>Inkubować płytki przez 48 h zgodnie z powyższym opisem i potwierdzić 100% konfluencję komórek za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.</li>
 <li>Przepłukać szkiełka nakrywkowe w PBS i przenieść je do nowych płytek 24-dołkowych zawierających po 490 μl DMEM z 10% FBS w każdym dołku.</li>
 <li>Aby zbadać rolę konkretnych procesów metabolicznych w inwazji komórkowej, do hodowanych komórek można dodać inhibitory na 1 h przed dodaniem bakterii i utrzymywać ich stężenia podczas analizy. Na przykład, aby określić rolę reorganizacji aktyny w inwazji S. aureus do komórek śródbłonka, można dodać 50 μM cytochalazyny D; natomiast w celu zbadania roli kaweoli można dodać 5 mM metylo-β-cyklodekstryny.</li>
</ol>
3. Test inwazji
<ol>
 <li>Do każdego dołka zawierającego wypłukaną szkiełko podstawowe z konfluencyjną warstwą komórek śródbłonka w 490 μl DMEM z dodatkiem 10% FBS, dodać 10 μl wypłukanych bakterii (co daje około 2 × 107 cfu ml-1 S. aureus).</li>
 <li>Inkubować przez 15-90 minut w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.</li>
 <li>Aby zmierzyć całkowitą liczbę bakterii związanych z komórkami (adherentnych i zinternalizowanych), wypłukać szkiełka podstawowe poprzez trzykrotne zanurzenie w PBS, a następnie przenieść do nowych dołków zawierających 500 μl 0,5% Triton X-100 w PBS. Aby zapewnić pełną lizę komórek i uwolnienie wszystkich zinternalizowanych bakterii, pipetować zawartość kilka razy, kierując końcówkę pipety bezpośrednio na powierzchnię szkiełka podstawowego.</li>
 <li>Oszacować liczbę bakterii poprzez wysianie zawiesiny (lub jej rozcieńczeń, jeśli jest to konieczne) na powierzchnię płytek z agar TSA. Ponieważ TX-100 lizuje wiele bakterii Gram-ujemnych, można zamiast niego użyć saponiny 2.</li>
 <li>Aby zmierzyć liczbę zinternalizowanych bakterii, usunąć znad każdego dołka nadsącz hodowlany zawierający niezwiązane bakterie i zastąpić go 500 μl DMEM/10% FBS uzupełnionego o 200 μg ml−1 gentamycyny. W tym miejscu rutynowo stosujemy gentamycynę zamiast lizostafiny, ponieważ jest ona tańsza i pozwala na zmianę eksperymentów z użyciem różnych typów bakterii (np. gronkowców i laktokoków) bez konieczności zmiany protokołu doświadczalnego.</li>
 <li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 60 min, aby zabić wszystkie bakterie pozakomórkowe.</li>
 <li>Wypłukać szkiełka podstawowe 3 razy w PBS, poddać lizie i oszacować liczbę bakterii poprzez wysianie na TSA, zgodnie z opisem dla powyższego testu adhezji.</li>
 <li>W niektórych przypadkach korzystniejsze może być wizualne policzenie liczby bakterii za pomocą mikroskopii świetlnej. W takim przypadku, specyficznie dla inwazji komórkowej S. aureus, należy użyć lizostafiny (10 μg ml−1) zamiast gentamycyny, aby fizycznie zniszczyć bakterie pozakomórkowe.</li>
 <li>Inkubować szkiełka podstawowe przez 20 min w temperaturze 37°C w CO2 w roztworze lizostafiny, a następnie opłukać i utrwalić preparatem Cytopath (Cellpath).</li>
 <li>Zalać szkiełka podstawowe fioletem krystalicznym (0,5%, w/v) na 5 min.</li>
 <li>Opłukać w wodzie, wysuszyć na powietrzu i zamontować na szkiełkach przedmiotowych. Liczbę bakterii na mm2 konfluencyjnych komórek śródbłonka można określić za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Ekspresja białek wiążących fibronektynę (FnBPA i FnBPB) na powierzchni S. aureus nadaje zdolność do wnikania do komórek śródbłonka. Niedawne prace zdefiniowały na nowo domenę wiążącą fibronektynę białka FnBPA 3. Dzikiego typu (WT) S. aureus 8325.4 wnika do komórek śródbłonka z wysoką wydajnością, podczas gdy szczep pozbawiony zarówno FnBPA, jak i B (Δfnb) wykazał znacząco obniżony poziom internalizacji (Rycina 1A). Komplementacja mutanta plazmidem kodującym fnb A bez domeny wiążącej fibronektynę (pFnR0) nie promowała wnikania (Rycina 1A). Z kolei komplementacja mutanta plazmidem kodującym cały gen fnb A (pFnBA4) przywróciła wnikanie do poziomu WT (Rycina 1A).
Rolę FnBPA w inwazji komórek śródbłonka można również zademonstrować, wykorzystując heterologiczny gospodarz ekspresyjny Lactococcus lactis. Ekspresja kodowanego w plazmidzie FnBPA w L. lactis (pRM9 9) nie zwiększyła znacząco adhezji do komórek śródbłonka w porównaniu z bakteriami niewykazującymi ekspresji FnBPA (CTL) (słupki puste, Rysunek 1B). Z kolei L. lactis wykazujący ekspresję FnBPA naciekał komórki śródbłonka na znacznie wyższym poziomie niż szczep nieekspresujący (słupki wypełnione, Rysunek 1B).
Doświadczenia przeprowadzono czterokrotnie w dubletach, a wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Symbol * oznacza dane, które są statystycznie istotnie różne (p = &lt;0.05) od wartości WT lub CTL.
<img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Wykres internalizacji bakterii; porównanie S. aureus i L. lactis; wyniki eksperymentalne; wykres słupkowy." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Inwazja komórek śródbłonka EA. Hy926 przez S. aureus (A) lub L. lactis (B).

<ol><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li>
<li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li>
<li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li>
<li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22+Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li>
<li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li>
<li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li>
<li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li>
<li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li>
<li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li>
<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun.%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li>
<li>Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li>
<li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li>
<li>Eiff, C. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small+colony+variants%3A+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li>
<li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisany przez nas test opiera się na metodzie ochrony gentamycyną, która jest szeroko stosowana do badania inwazji komórek gospodarza przez bakterie. Obserwacje dotyczące niezdolności gentamycyny i innych antybiotyków do zabijania bakterii wewnątrzkomórkowych zostały wykorzystane w wczesnych badaniach nad inwazją komórek gospodarza przez bakterie 4-8. Zastosowanie płytek 24-, 48- lub nawet 96-dołkowych pozwala na wygenerowanie dużych ilości ilościowych, powtarzalnych danych w krótkim czasie i przy stosunkowo niskich kosztach. Test ten jest również atrakcyjny, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu, można go dostosować do pracy z różnymi bakteriami i komórkami oraz można go wykorzystać do badania roli procesów zarówno bakteryjnych, jak i komórek gospodarza w procesie inwazji 9. W rzeczywistości, od pierwszych eksperymentów, metoda ochrony gentamycyną była szeroko stosowana do pomiaru inwazji komórek gospodarza przez szereg różnych bakterii, a nawet kombinacje bakterii 10,11. Choć podstawowe zasady pozostają takie same, zgłoszono wiele subtelnych wariacji tej metody. W niniejszym artykule opisaliśmy naszą wersję i wskazaliśmy, gdzie modyfikacje mogą być konieczne w przypadku innych bakterii lub komórek gospodarza. Podczas projektowania eksperymentu w celu pomiaru inwazji komórek gospodarza przy użyciu tego podejścia należy wziąć pod uwagę szereg istotnych kwestii:
Wrażliwość bakterii na gentamycynę. Może się to wydawać oczywiste, ale ważne jest upewnienie się, że badana bakteria jest wrażliwa na gentamycynę przy zastosowaniu odpowiedniego stężenia, temperatury oraz czasu trwania inkubacji. W przypadku braku wrażliwości można rozważyć zastosowanie innych antybiotyków 5. Alternatywnym podejściem może być użycie enzymów litycznych (lyzostafiny, mutanolizyny, lizozymu) 12.
Inkubacja i inokulum. Podczas pierwszego przeprowadzania tego testu ważne jest ustalenie optymalnego czasu inkubacji oraz ilości użytego inokulum bakteryjnego. Dlatego w wstępnych eksperymentach należy zbadać zarówno adhezję, jak i inwazję w czasie (od 5 min do maksymalnie 6 h). Ważne jest również ocenić, w jaki sposób na inwazję wpływa wielokrotność infekcji (MOI; liczba bakterii na komórkę). Zazwyczaj najlepiej użyć jak najmniejszej liczby bakterii, co pozwoli zminimalizować uszkodzenia hodowanych komórek. Zastosowanie przedłużonych okresów inkubacji lub dużych inokulum może doprowadzić do przeoczenia istotnych różnic między szczepami 9,13.
Uszkodzenia komórkowe. Ważne jest przemycie bakterii przed użyciem. Należy jednak pamiętać, że uszkodzenia komórkowe nie ograniczają się jedynie do produkcji toksyn. Inwazja bakteryjna, indukcja apoptozy oraz zaburzenie prawidłowych funkcji komórkowych mogą również powodować uszkodzenia komórek. Może to prowadzić do przenikania gentamycyny do wnętrza komórki, co skutkuje zabiciem zinternalizowanych bakterii i sprawia wrażenie, że inwazja nie miała miejsca 14.
Warunki inkubacji. Temperatura i skład pożywki hodowlanej mogą mieć istotny wpływ na inwazję. Na przykład inwazja komórek HeLa przez Streptococcus pyogenes jest zależna od obecności rozpuszczalnej fibronektyny, która zazwyczaj występuje w surowicy 15. Kolejną kwestią jest wzrost bakterii w pożywce hodowlanej w trakcie trwania eksperymentu.
Hodowla i kwantyfikacja bakterii wewnątrzkomórkowych. Chociaż TX-100 może nie zabijać bakterii wewnątrzkomórkowych, może hamować ich wzrost. W związku z tym ważne jest sprawdzenie replikacji bakterii na podłożach stałych w obecności detergentu. W przypadku wystąpienia takiego efektu, możliwe może być zastosowanie niższych stężeń detergentu lub użycie alternatywy, takiej jak saponina. Przewagą testu ochrony gentamycyną nad barwieniem fioletem krystalicznym i analizą mikroskopową jest mniejsza pracochłonność oraz możliwość wykrywania i rozróżniania subpopulacji bakterii zinternalizowanych. Na przykład S. aureus może wytwarzać zarówno typowy wariant kolonii (NCT), jak i wariant małych kolonii (SCV) 16, których nie udałoby się rozróżnić podczas mikroskopii pojedynczych komórek bakteryjnych. Przewagą barwienia fioletem krystalicznym i analizy mikroskopowej nad testem ochrony gentamycyną jest możliwość uwzględnienia agregacji komórek oraz wykrycia bakterii wewnątrzkomórkowych, które przeszły w stan „żyjących, lecz niehodowlanych” 17.
Badanie roli procesów komórek gospodarza w inwazji bakteryjnej. W wielu badaniach zastosowano inhibitory funkcji komórek gospodarza, takie jak cytochalasyna D, która zakłóca reorganizację aktyny. Badania te mogą również obejmować przeciwciała skierowane przeciwko receptorom powierzchniowym komórek oraz wyciszanie specyficznych genów za pomocą siRNA 18. Jest niezwykle ważne, aby upewnić się, że zabiegi te nie wpływają na żywotność lub przyleganie hodowlanych komórek i nie wywierają toksycznego działania na bakterie.
Kierunki przyszłych badań:
Ponieważ test ten jest zazwyczaj przeprowadzany w wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowej, teoretycznie możliwe jest jego dostosowanie do wysokoprzepustowego screeningu, co może obejmować badanie bibliotek potencjalnych inhibitorów funkcji komórkowych, środków przeciwinfekcyjnych lub antybiotyków zaprojektowanych do zwalczania bakterii wewnątrzkomórkowych. Alternatywnie takie podejście można wykorzystać do screeningu bibliotek mutantów w celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w adhezję, inwazję lub przeżycie wewnątrzkomórkowe. W niektórych przypadkach pożądanym może być uwzględnienie sił ścinających (przepływu) w systemie modelowym, na przykład podczas modelowania śródbłonka, aby dokładniej odwzorować środowisko in vivo. Obecne postępy w projektowaniu i produkcji komór przepływowych oraz mikrofluidycznych systemów hodowli komórkowej umożliwiają zastosowanie testu ochrony gentamycyną w modelach gospodarz-patogen uwzględniających siły ścinające.
Podsumowując, opisany tutaj protokół opiera się na podobnych podejściach stosowanych od wielu lat. Ma on szerokie zastosowanie w wielu typach hodowli komórkowych i gatunkach bakterii, a także pozwala na szybkie generowanie dużych ilości danych przy stosunkowo niskich kosztach.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg z mózgu i serca (BHI)</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;talna surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe medium dla komórek śródbłonkowych</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z mózgu bydlęcego (zawierający heparynę)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki czynnik wzrostu śródbłonka</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Lizostafina</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>Kryształki Thermanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cytopath</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-β-cyklodekstryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

W niniejszej procedurze opisano sposób badania inwazji ludzkich komórek śródbłonka przez patogen bakteryjny Staphylococcus aureus. Ogólny protokół można zastosować do badania inwazji komórkowej przez praktycznie każdą bakterię zdolną do hodowli. Omówione zostaną etapy, na których można badać konkretne aspekty inwazji, takie jak rola reorganizacji aktyny lub kaweoli. Komórki gospodarza hoduje się w kolbach, a po osiągnięciu odpowiedniego stanu wysiewa do płytek 24-dołkowych zawierających szkiełka Thermanox. Zastosowanie szkiełek umożliwia późniejsze usunięcie komórek z dołków w celu zminimalizowania zakłóceń wywołanych przez białka surowicy osadzone na ściankach dołków (do których S. aureus mógłby przylegać). Bakterie hoduje się do wymaganej gęstości, a następnie płucze w celu usunięcia wydzielanych białek (np. toksyn). Szkiełka z konfluencyjnymi warstwami komórek śródbłonka przenosi się do nowych płytek 24-dołkowych zawierających świeżą pożywkę hodowlaną przed dodaniem bakterii. Następnie bakterie i komórki inkubuje się razem przez wymagany czas w 5% CO2 w temperaturze 37°C. W przypadku S. aureus czas ten wynosi zazwyczaj od 15 do 90 minut. Szkiełka Thermanox wyjmuje się z każdego dołka i płucze w PBS, aby usunąć nieprzyległe bakterie. Jeśli celem jest ilościowe oznaczenie wszystkich powiązanych bakterii (przylegających i zinternalizowanych), szkiełka umieszcza się w nowym dołku zawierającym 0,5% Triton X-100 w PBS. Delikatne pipetowanie prowadzi do całkowitej lizy komórek, a bakterie są enumerowane poprzez rozcieńczenia seryjne i wysiew na agar. Jeśli wymagana jest liczba bakterii, które wniknęły do wnętrza komórek, szkiełka dodaje się do dołków zawierających 500 μl pożywki tkankowej uzupełnionej o gentamycynę i kontynuuje inkubację przez 1 h, co spowoduje śmierć wszystkich bakterii zewnętrznych. Następnie szkiełka można wypłukać, poddać lizie komórek i enumerować bakterie poprzez wysiew na agar, jak opisano powyżej. Jeśli eksperyment wymaga bezpośredniej wizualizacji, szkiełka można utrwalić i barwić do mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej lub konfokalnej albo przygotować do mikroskopii elektronowej.

Ogólny protokół badania inwazji komórek gospodarza przez patogen bakteryjny, skupiający się na Staphylococcus aureus oraz ludzkich komórkach śródbłonka.

Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

W niniejszym rozdziale opiszemy sposób badania inwazji ludzkich komórek śródbłonka przez patogen bakteryjny Staphylococcus aureus. Ogólny protokół można...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest pomiar zdolności szczepów bakteryjnych do naciekania komórek gospodarza. Komórki gospodarza w hodowli są przenoszone na szklane lamelle w płytce 24-dołkowej i inkubowane do momentu osiągnięcia konfluencji. Następnie lamelle są płukane i przenoszone do nowej płytki.Bakterie zebrane ze standardowej hodowli w bulionie są przemywane poprzez wirowanie, a następnie dodawane do hodowli komórek gospodarza. Po dokonaniu inwazji bakterie pozakomórkowe są zabijane przy użyciu Gentamycyny, a szkiełka nakrywkowe są przemywane i przenoszone na nową płytkę. Na koniec komórki gospodarza są lizowane, a lizaty wysiewane na płytki agarowe w celu oznaczenia liczby bakterii wewnątrzkomórkowych.W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące zdolność inwazyjną konkretnych bakterii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patogenezy mikrobowej, takie jak sposób, w jaki inwazja bakterii do komórek gospodarza wywołuje chorobę. Może ona również ułatwić identyfikację i charakterystykę białek bakteryjnych zaangażowanych w interakcje między patogenem a gospodarzem.Procedurę tę zaprezentuje dr Andrew Edwards, stażysta podoktorski z laboratorium. Do tego testu wykorzystujemy ludzkie komórki endotelialne EAHY 9 26 hodowane w kolbach T 75 w temperaturze 37 °C. Komórki należy zebrać, gdy osiągną około 95% konfluencji.Przemyj komórki 10 mililitrami PBS, aby usunąć pożywkę wzrostową. Odklej komórki, inkubując je w roztworze trypsyny z EDTA przez pięć minut. Następnie przenieś je do probówki typu conical.Następnie odwiruj komórki i resuspenduj je w około 25 mililitrach kompletnej pożywki DMEM lub do stężenia 1 milion komórek na mililitr, używając sterylnej pęsety. Umieść szkiełko podstawowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że nieprzezroczysta strona szkiełka, do której mogą przylegać komórki, jest skierowana do góry.Następnie do każdego dołka dodaje się 500 µL komórek i inkubuje płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 h lub do czasu osiągnięcia przez komórki konfluencji. Po inkubacji, za pomocą czystej pęsety, należy ostrożnie wyjąć każde szkiełko podstawowe i zanurzyć je w DMEM, aby usunąć rozpuszczalne białka wydzielane. Przemyte szkiełka podstawowe przenosi się do poszczególnych dołków nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 490 µL kompletnego DMEM na dołek.Należy zachować orientację szkiełek nakrywkowych tak, aby komórki były skierowane ku górze. Przygotować 10 ml hodowli staphylococcus aureus w bulionie BHI (brain heart infusion). Przenieść kulturę bakterii do probówki stożkowej i odwirować bakterie z prędkością 5 000 ×g przez 10 minut.Po odwirowaniu komórek należy usunąć nadsącz i odrzucić go. PrzesuspendTime pellet w 10 mililitrach sterylnego DMEM w celu przemycia komórek, odwirować je ponownie i powtórzyć przemywanie trzy razy. Ponownie przesuspendTime bakterie w DMEM i zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny.Dostosuj stężenie tak, aby uzyskać OD 600 równą 1,0, co odpowiada w przybliżeniu 10⁹ jednostkom tworzących kolonie na mililitr. Po przygotowaniu zawiesiny bakteryjnej dodaj 10 µL bakterii do każdego dołka 24-dołkowej płytki zawierającej szkiełka podstawowe.Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 15 do 90 minut, aby umożliwić bakteriom przytwierdzenie się do komórek i ich inwazję. Po tej inkubacji odessać nadsącz z każdej studzienki zawierający nieprzytwierdzone bakterie i zastąpić go DMEM z 10% FBS uzupełnionym o gentamycynę. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 60 minut, aby zabić bakterie pozakomórkowe.Po zakończeniu inkubacji należy trzykrotnie przemyć każde szkiełko zakrywkowe w DMEM, aby usunąć antybiotyk. Następnie należy przenieść je do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 500 µL 0,5% Triton X 100 w PBS na dołek.Podobnie jak poprzednio, należy zadbać o to, aby strona z przykrywkiem była skierowana do góry. Każdy szkiełko nakrywkowe należy energicznie przemyć roztworem Tritonu, pipetując ciecz w dołku w górę i w dół bezpośrednio na szkiełko, aby zapewnić lizę wszystkich komórek i uwolnienie bakterii wewnątrzkomórkowych. Należy przeprowadzić rozcieńczenia seryjne lizatu w celu określenia liczby infekujących bakterii. Lizat należy zebrać, a rozcieńczenia seryjne wysiać na płytki z agar TSA.Jednostki tworzące kolonie można określić na tych płytkach po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C. Wykres ten przedstawia liczbę bakterii Staphylococcus aureus typu dzikiego lub z deficytem białka wiążącego fibrynogen, które wniknęły do ludzkich komórek śródbłonka, w porównaniu do bakterii typu dzikiego. Staphylococcus aureus z deficytem białka wiążącego fibronektynę wykazują znaczące upośledzenie zdolności do wnikania do komórek śródbłonka.Komplementacja mutanta plazmidem kodującym białko wiążące fibronektynę pozbawione domeny wiążącej fibronektynę nie promowała inwazji. W przeciwieństwie do tego, komplementacja mutanta plazmidem kodującym pełne białko wiążące fibronektynę przywróciła inwazję do poziomu typu dzikiego. W tym eksperymencie wykazano, że Lactococcus lactis ekspresujący białko wiążące fibronektynę jest zdolny do inwazji w komórki gospodarza.Podczas gdy bakterie niewyrażające białka nie posiadały zdolności do przylegania do komórek, zdolność ta była taka sama dla obu szczepów. Po opanowaniu ta technika może być wykonana w ciągu trzech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować bakterie i komórki gospodarza do badania inwazji komórkowej.Powinieneś być również w stanie zidentyfikować etapy, w odniesieniu do których można zadać dodatkowe pytania, aby pogłębić zrozumienie tego aspektu choroby.

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Inwazja patogenu bakterii na ludzkie komórki

Ten film demonstruje technikę oceny zdolności Porphyromonas gingivalis, beztlenowej bakterii chorobotwórczej, do przylegania i atakowania ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Po zakażeniu komórek gospodarza bakteriami, komórki gospodarza są poddawane lizie w celu uwolnienia zarówno przylegających, jak i zinternalizowanych bakterii. Gdy lizat jest posiewany w odpowiednim pożywce, obecność kolonii wskazuje na udane interakcje bakteria-komórka gospodarza.

Test infekcji bakteryjnej do badania interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Wykonywanie testów hodowli komórkowych w celu zbadania adhezji i inwazji bakterii w warunkach tlenowych jest zazwyczaj niereprezentatywne dla środowiska in vivo. Model pionowej komory dyfuzyjnej umożliwia badanie interakcji ludzkiego patogenu Campylobacter jejuni z komórkami nabłonka jelitowego w warunkach bardziej zbliżonych do in vivo, co skutkuje zwiększoną inwazją bakterii.

Inwazja bakterii jelitowych na komórki nabłonka jelitowego in vitro jest znacznie zwiększona dzięki pionowemu modelowi komory dyfuzyjnej

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes powoduje infekcje płodu u kobiet w ciąży i zapalenie opon mózgowych w populacjach podatnych.  Subpopulacje bakterii mogą kolonizować tkankę serca, powodując zapalenie mięśnia sercowego u pacjentów i zwierząt laboratoryjnych.  W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opisuje, jak ocenić inwazję komórek serca L. monocytogenes in vitro i kolonizację serca u zakażonych zwierząt.

Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes

Tutaj przedstawiono protokół pomiaru wychwytywania bakterii przez limfocyty T CD4+, które następuje podczas prezentacji antygenu poprzez transinfekcję z wcześniej zainfekowanych komórek dendrytycznych (DC). Pokazujemy, jak wykonać niezbędne kroki: izolację komórek pierwotnych, zakażenie DC, tworzenie koniugatu limfocytów DC/T oraz pomiar transfekcji bakteryjnych limfocytów T.

Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Poznaj metodę pomiaru zdolności inwazyjnej szczepów bakterii Staphylococcus aureus wobec komórek śródbłonka ludzkiego. Protokół ten pozwala identyfikować białka bakteryjne zaangażowane w interakcje z gospodarzem.

Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Przeglądaj więcej filmów