Ograniczenia dietetyczne oparte na stałych talerzach w Caenorhabditis elegans
28 maja 2011
Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania restrykcji diety opartej na stałym talerzu u C. elegans z zabitymi bakteriami.
Procedura polega na nałożeniu ograniczeń dietetycznych na standardową płytkę na bazie w morskiej elegancji, aby zbadać jej wpływ na długowieczność, reprodukcję i metabolizm. Osiąga się to poprzez dokładny pomiar stężenia bakterii, które będą wykorzystywane jako źródło pożywienia. Drugim etapem zabiegu jest odpowiednie rozcieńczenie kultury bakterii do odpowiednich stężeń.
Następnie przygotuj płytki SDR na bazie z zabitymi bakteriami. Na koniec przeprowadź eksperymenty SDR z populacją robaków zsynchronizowaną z wiekiem. Wyniki pomiarów produkcji potomstwa i długości życia mogą wskazywać na opóźnioną i zmniejszoną produkcję potomstwa, a także na wydłużenie średniej długości życia.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z 60 metodami, takimi jak Dian w pożywce AZA, jest to, że cały eksperyment zostanie przeprowadzony na standardowej grze opartej na stałej AGA, która jest używana przez większość ciepłych laboratoriów W przypadku eksperymentów z ograniczeniami dietetycznymi i zobaczenia elegancji ustal oddzielne krzywe kalibracyjne dla każdego szczepu bakterii używanego jako źródło pożywienia. Wybierz pojedynczą kolonię bakterii E coli OP 50 ze świeżej smugi na agarze lb i zaszczepij trzy mililitry płynnej kultury bulionu lb w shakerze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Przygotować seryjne dwukrotne rozcieńczenie nocnej kultury.
Następnie zmierzyć chłonność każdego rozcieńczenia przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru w trzech egzemplarzach. Następnie zasłaniaj każdą zawiesinę bakteryjną, 1 milion razy równomiernie wysiewaj 0,4 mililitra zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na 100-milimetrowej płytce agri i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Policz liczbę kolonii bakteryjnych wyhodowanych na każdej płytce, aby obliczyć jednostki tworzące kolonie na mililitr dla każdej próbki.
Teraz wykreśl OD 600 jako funkcję stężenia bakterii i przeprowadź analizę regresji liniowej, aby ustalić zależność między zmierzonymi wartościami OD 600 a stężeniami bakterii OP 50. W przypadku tej metody stosuje się stężenie bakterii od jednego do 10 do 11 CFU na mililitr w warunkach żywienia ad lido i od jednego razy 10 do 8 CFU na mililitr jako optymalne warunki karmienia DR. Jednak do ustalenia pełnej zależności zależnej od dawki może być potrzebnych od czterech do sześciu różnych stężeń bakterii.
Dla SDR i jego odpowiedzi. Przygotuj inokulum z pojedynczą kolonią bakterii E coli OP 50 w trzech mililitrach płynnego bulionu LB, hodowanego w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Przenieś kulturę OP 50 do nowej kolby zawierającej 500 mililitrów bulionu LB i hoduj przez noc, aby bakterie osiągnęły nasycenie, jeśli to konieczne.
Przygotować odpowiednie rozcieńczenie kultury OP 50 do pomiaru chłonności przy OD 600. Aby określić stężenie bakterii, osadzaj bakterie przez odwirowanie w temperaturze 1500 g przez 20 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie do stężenia jeden razy 10 przy 12. CFU na mililitr.
Teraz przygotuj 10-mililitrowe kultury bakterii w sześciu różnych stężeniach, od jednego razy 10 z 12. do jednego razy 10 siódmego CFU na mililitrową pipetę. Skieruj dwa mililitry kultury bakterii na środek 60-milimetrowej, zestalonej płytki N GM. Unikaj dotykania powierzchni płytki końcówką pipety, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają robakom zakopanie się w napowietrzaniach.
Umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie nałóż 10 mikrolitrów po 100 miligramów na mililitr węgla i 10 mikrolitrów po 50 miligramów na mililitr puszki micyny na każdą płytkę, aby pozostał wzrost bakterii. Przechowuj płytki z różnymi stężeniami bakterii zabitych antybiotykiem w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości przez okres do jednego miesiąca.
Ważne jest, aby przygotować i przechowywać wystarczającą ilość talerzy, najlepiej tę samą partię dla całej rośliny. Eksperymentuj co najmniej jeden do dwóch dni wcześniej, aby zweryfikować żywotność bakterii. Zeskrob trochę bakterii z płytek SDR i rozprowadź je na pustej płytce N GM z węglem, sejiną i antymycyną.
Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na sześć do ośmiu godzin i potwierdź, że nie ma wzrostu bakterii. W przypadku większości badań związanych z SDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie produkcji potomstwa, niezbędne jest przygotowanie populacji robaków zsynchronizowanej z wiekiem. Użyj platynowego zbieracza robaków, aby przenieść od 20 do 30 aktywnych reprodukcyjnie dorosłych osobników na kilka zwykłych płytek NGM.
Z OP 50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być potrzebnych więcej dorosłych osobników. Pozostaw talerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza na cztery godziny, aby umożliwić złożenie jaj.
Usuń dorosłe osobniki z talerza i sprawdź wzrokowo talerze pod kątem jaj. Kontynuuj inkubację płytek w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić potomstwu rozwinięcie się do późnego stadium L, czterech dni, jednego dorosłego stadium. Zwykle zajmuje to trzy dni dla N dwóch robaków typu dzikiego w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Do analizy żywotności. Przenieś od 10 do 12 dni dorosłych robaków na płytkę SDR, aby zainicjować ograniczenie dietetyczne. Aby uzyskać wystarczającą moc statystyczną, użyj łącznie od 60 do 100 robaków na każdy warunek SDR.
Oceniaj żywotność każdego robaka co dwa do trzech dni, aż wszystkie robaki umrą. Co ważne, co drugi dzień przenoś robaki na świeże płytki SDR, aby uniknąć głodu. Ta krzywa kalibracyjna wykreśla stężenie OP 50 w stosunku do OD 600.
Równanie wygenerowane przez analizę regresji liniowej może być wykorzystane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP 50. W badaniu tym oceniano wpływ przewlekłego leczenia SDR na średnią długość życia różnych szczepów robaków w porównaniu z normalną, zależną od dawki odpowiedzią robaków typu dzikiego na SDR. Efekt wydłużenia życia SDR jest częściowo stłumiony przez nadekspresję DR dwa, podczas gdy mutacja DAF 16 MU 86 nie ma wpływu na wydłużenie życia wywołane SDR.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać Dian na standardowej grze opartej na AGA w morskiej elegancji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na podłożu stałym u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii. Celem badania jest analiza wpływu restrykcji dietetycznej na długość życia, reprodukcję oraz metabolizm tych organizmów modelowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia
- organizmy modelowe
Wstęp
- C. elegans jest powszechnie stosowanym organizmem modelowym w badaniach biologicznych.
- Wykazano, że restrykcje dietetyczne wpływają na długość życia i rozrodczość.
- Zrozumienie zmian metabolicznych podczas restrykcji dietetycznych może dostarczyć cennych informacji na temat starzenia się.
- W tej konfiguracji eksperymentalnej jako źródło pożywienia wykorzystuje się zabite bakterie.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu restrykcji dietetycznej u C. elegans.
- Ocena wpływu restrykcji dietetycznej na liczbę potomstwa i długość życia.
- Zbadanie efektów metabolicznych związanych ze zmianami w diecie.
Zastosowane metody
- Dokładny pomiar stężenia bakterii do przygotowania pożywki.
- Rozcieńczanie kultury bakterii do odpowiednich stężeń.
- Przygotowanie stałych szalek z ograniczeniem dietetycznym z zabitymi bakteriami.
- Przygotowanie eksperymentów z populacjami nicieni o zsynchronizowanym wieku.
Główne wyniki
- Obserwowano opóźnienie i zmniejszenie produkcji potomstwa w warunkach restrykcji dietetycznej.
- Stwierdzono wydłużenie średniej długości życia C. elegans w warunkach restrykcji dietetycznej.
- Odnotowano zmiany metaboliczne w odpowiedzi na manipulację dietą.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia zależności między dietą a długowiecznością.
Wnioski
- Protokół ten stanowi podstawę do badania wpływu diety na C. elegans.
- Wyniki podkreślają znaczenie diety dla długości życia i rozrodczości.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat szlaków metabolicznych modulowanych przez restrykcję kaloryczną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie wiarygodnych modeli restrykcji dietetycznej u C. elegans umożliwia mechanistyczną weryfikację celów związanych ze starzeniem poprzez zapewnienie genetycznie podatnego systemu do oceny długości życia i fenotypów metabolicznych. To podejście oparte na płytkach agarowych jest zgodne ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi, co poprawia powtarzalność i pewność translacyjną w walidacji celów w szlakach chorób związanych z wiekiem. Metoda ta wspiera predykcyjny screening interwencji modulujących szlaki wykrywania składników odżywczych, które są istotne dla rozwoju przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z detekcją składników odżywczych, sygnalizacją insuliny/IGF-1 oraz szlakami długowieczności.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje martwe bakterie na standardowych płytkach NGM, co zapewnia kompatybilność z istniejącymi procedurami pracy z C. elegans i zmniejsza zmienność wynikającą z zastosowania żywych źródeł pożywienia.
- Wartość prognostyczna: Wspiera analizę zależną od dawki efektów stężenia bakterii na długość życia i reprodukcję, pomagając w weryfikacji angażowania celu i walidacji funkcjonalnej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów długości życia oraz liczby potomstwa, które służą jako punkty końcowe fenotypowe w badaniach przesiewowych związków chemicznych lub genetycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia stworzenie krzywych kalibracyjnych wiążących pomiary OD600 z koncentracją bakterii, co pozwala na precyzyjne i powtarzalne przygotowanie pożywek w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Protokół umożliwia równoległe testowanie wielu stężeń bakterii i szczepów nicieni, co ułatwia przeprowadzanie badań zależności dawka-odpowiedź oraz analizy interakcji genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy manipulacje dietetyczne z konserwowanymi szlakami starzenia (np. DAF-16/FOXO), co wspiera ekstrapolację na modele ssacze.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia rolę DAF-16 w wydłużaniu czasu życia indukowanym przez SDR, pomagając w priorytetyzacji celów z genetycznymi dowodami na zależność od danego szlaku.
- Pewność prognostyczna: Wykazuje, że efekty dotyczące długości życia są modulowane przez tło genetyczne (np. zależność od DAF-16), co pozwala na dobór celów z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, przez walidację fenotypową, aż po przedkliniczną eksplorację mechanizmów, szczególnie w odniesieniu do celów związanych ze starzeniem się organizmu i chorobami metabolicznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących szlaków wykrywania składników odżywczych i odpowiedzi stresowej poprzez kontrolowaną manipulację dietą oraz ocenę długości życia i reprodukcji.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanym preparatom zabitych bakterii oraz mierzalnym wynikom, takim jak średnia długość życia i wielkość miotu.
- Analityka: Wymaga regresji liniowej OD600 względem CFU/mL w celu wygenerowania krzywych kalibracyjnych, co zapewnia ilościową kontrolę diety niezbędną do powtarzalnych porównań.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki SDR z konserwowanymi regulatorami długowieczności (DAF-16, insulina/IGF-1), wspierając ciągłość mechanistyczną w odniesieniu do modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowany format oparty na płytkach pozwala na ponowne wykorzystanie w różnych laboratoriach i badaniach, co sprzyja spójności międzyprojektowej w badaniach nad starzeniem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach starzenia się dzięki danym o interakcjach genetycznych i dietetycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji przechowywania martwych bakterii (4°C, do 1 miesiąca) oraz protokołów przygotowania płytek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych, zależnych od dawki danych fenotypowych dotyczących długości życia i płodności w warunkach restrykcji dietetycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie epstazy genetycznej (np. zależności od DAF-16) oraz profili odpowiedzi na dietę.
Uwagi dotyczące wdrażania
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z C. elegans, w tym w synchronizacji wieku oraz ocenie długości życia.
- Metoda opiera się na spektrofotometrii do pomiaru OD600 oraz liczeniu kolonii w celu kalibracji CFU/mL.
- Niezbędne jest zachowanie sterylności oraz inkubacja w kontrolowanej temperaturze (37°C dla bakterii, 20°C dla nicieni).
- Należy uwzględnić zmienność szczepów bakteryjnych; dla każdego użytego szczepu wymagana jest oddzielna krzywa kalibracyjna.
- Ograniczeniem jest konieczność regularnego przenoszenia nicieni, aby zapobiec ich zagłodzeniu oraz zanieczyszczeniu płytek w czasie.
