Name: Ograniczenia dietetyczne oparte na stałych talerzach w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj metodę restrykcji dietetycznej na stałych płytkach w Caenorhabditis elegans przy użyciu zabitych bakterii. Protokół pozwala badać wpływ diety na długość życia, reprodukcję i metabolizm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z funduszy pilotażowych przyznanych przez Nathan Shock Center (P30 AG13283) oraz z grantu R01 (R01 AG028516) przyznanego A.-L.H. przez National Institute on Aging (NIA).

1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do szacowania stężenia bakterii
W tej sekcji opisano metodę szacowania stężenia bakterii dla dowolnego szczepu bakterii (np. OP50, HT115), który będzie wykorzystywany jako źródło pożywienia w eksperymentach dotyczących restrykcji dietetycznej u C. elegans. Dla każdego użytego szczepu bakterii należy sporządzić oddzielną krzywą kalibracyjną.
<ol>
 <li>Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii E. coli OP50, pobraną ze świeżego posiewu na agarze LB, do 3 mL płynnej pożywki LB.</li>
 <li>Umieść kulturę OP50 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i inkubuj bakterie przez noc. </li>
 <li>Przygotuj seryjne rozcieńczenia dwukrotne zawiesiny bakteryjnej z kultury nocnej (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).</li>
 <li>Zmierz absorbancję (gęstość optyczną) każdego rozcieńczenia przy 600 nm za pomocą spektrofotometru w trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Dalszo rozcieńcz każdą zawiesinę bakteryjną milionkrotnie (dwukrotne rozcieńczenie 1000-krotne).</li>
 <li>Rozsiej równomiernie 0,4 mL zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na płytce z agarem LB o średnicy 100 mm.</li>
 <li>Umieść płytki LB z OP50 w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18-24 godziny.</li>
 <li>Policz liczbę kolonii bakteryjnych, które wyrosły na każdej płytce. Liczbę kolonii wykorzystuje się do obliczenia cfu (jednostek tworzących kolonie) na mL dla każdej próbki.</li>
 <li>Zależność między zmierzonymi wartościami OD600 a stężeniem bakterii OP50 można ustalić, wykreślając OD600 jako funkcję stężenia bakterii (cfu/mL) i przeprowadzając analizę regresji liniowej (Rycina 1).</li>
</ol>
 Roztwory:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Pożywka Luria Broth (LB), 1 l:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 g</td>
 <td>Baktotryptona</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 g </td>
 <td>Ekstrakt z drożdży</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 g</td>
 <td>NaCl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Dopełnić wody dejonizowanej do 1L. 
 Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie stałych płytek z ograniczeniem kalorycznym (sDR)
W tej sekcji opisano przygotowanie szalek do zastosowania w eksperymentach nad restrykcją kaloryczną w warunkach podłoża stałego (sDR). Zazwyczaj przyjmuje się, że stężenie bakterii 1 x 1011 cfu/mL odpowiada warunkom żywienia ad libitum, a 1 x 108 cfu/mL jest optymalnym stężeniem dla warunków restrykcji kalorycznej (DR) w tej metodzie. Niemniej jednak, w celu ustalenia pełnej zależności od dawki dla sDR oraz wynikających z niej odpowiedzi, konieczne może być zastosowanie 4–6 różnych stężeń bakterii.
<ol>
 <li>Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii E. Coli OP50 w 3 mL płynnej pożywki LB.</li>
 <li>Umieść kulturę OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i pozostaw bakterie do wzrostu na 6-8 godzin.</li>
 <li>Przenieś kulturę OP50 do nowej kolby zawierającej 500 mL pożywki LB i ponownie umieść kulturę OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem w 37 °C na noc.</li>
 <li>Zmierz OD600 kultury OP50, aby określić stężenie bakterii (stężenie oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej w Części 1). W celu dokładnego pomiaru absorbancji może być konieczne wykonanie odpowiednich rozcieńczeń.</li>
 <li>Z pelletuj bakterie OP50 poprzez wirowanie przy 1,500 g przez 20 minut.</li>
 <li>Resuspenduj bakterie do stężenia 1 x 1012 cfu/mL.</li>
 <li>Przygotuj 10 mL kultury bakterii w sześciu różnych stężeniach: 1 x 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107 cfu/mL.</li>
 <li>Pipetuj 0,2 mL kultury bakterii na środek utwardzonej płytki NGM o średnicy 60 mm. Unikaj dotykania powierzchni płytki końcówką pipety, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają nicieniom wgryzanie się w agar.</li>
 <li>Umieść płytki w inkubatorze w 37 °C na 1 godzinę.</li>
 <li>Nanieś 10 μL karbenicyliny o stężeniu 100 mg/mL oraz 10 μL kanamycyny o stężeniu 50 mg/mL na każdą płytkę, aby zahamować wzrost bakterii.</li>
 <li>Przechowuj płytki z różnymi stężeniami bakterii zabitych antybiotykiem w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (do jednego miesiąca). Ważne jest, aby przygotować i przechować odpowiednią liczbę płytek na cały zaplanowany eksperyment z co najmniej 1-2 dniowym wyprzedzeniem. Preferowane jest używanie tej samej partii płytek przez cały okres trwania eksperymentów.</li>
 <li>Aby zweryfikować żywotność bakterii, zeskrob część bakterii z płytek sDR i rozsiej je na pustej płytce NGM z karbenicyliną i kanamycyną. Umieść płytkę w inkubatorze w 37 °C na 6-8 godzin, a następnie sprawdź, czy wystąpił wzrost bakterii (nie powinien być obserwowany żaden wzrost bakterii).</li>
</ol>
Roztwory
<table border="1">
 <tbody>
 	<tr>
 <td colspan="2">Pożywka do hodowli nicieni (NGM), 1 L:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 g </td>
 <td>NaCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2,5 g</td>
 <td>Pepton Bacto </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 g</td>
 <td>Agar</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Autoklawować przez 40 minut i schłodzić do 65 °C, a następnie dodać:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>1 mL </td>
 <td>1 M MgSO44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml</td>
 <td>1 M CaCl22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml</td>
 <td>5 mg/mL cholesterolu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml</td>
 <td>1M fosforan potasu, pH 6,0</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Natychmiast wlej płynne podłoże NGM do szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w ilościach 10 mL na szalkę
3. Przygotowanie eksperymentów sDR
W większości badań związanych z sDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie płodności, niezbędne jest przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku. W przypadku innych badań, aby zapoczątkować restrykcję dietetyczną, wystarczy przenieść nicienie z regularnej płytki OP50 na płytkę sDR. W tej sekcji, jako przykład, opisano protokół przygotowania analizy długości życia dla zwierząt poddanych sDR.
<ol>
 <li>Za pomocą platynowego zgłębnika przeniieść 20-30 osobników dorosłych w okresie aktywności rozrodczej na kilka standardowych płytek NGM z bakteriami OP50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być konieczne użycie większej liczby osobników dorosłych.</li>
 <li>Pozostawić płytki w temperaturze 20°C na 4 godziny, aby umożliwić zniesienie jaj.</li>
 <li>Usunąć osobniki dorosłe z płytek. Płytki należy sprawdzić wizualnie pod kątem obecności jaj.</li>
 <li>Pozostawić płytki w temperaturze 20°C i pozwolić potomstwu rozwinąć się do stadium późnego L4/dorosłego dnia 1. W przypadku nicieni dzikiego typu N2 w temperaturze 20 °C trwa to zazwyczaj 3 dni.</li>
 <li>Przenieść odpowiednią liczbę osobników dorosłych dnia 1 na płytki sDR, aby rozpocząć restrykcję dietetyczną.</li>
 <li>W celu analizy długości życia przygotować łącznie 6-8 płytek z 10-20 nicieniami na płytkę dla każdego warunku sDR.</li>
 <li>Oceniać żywotność każdego nicienia co 2 dni, aż do śmierci wszystkich osobników. Krytyczne jest przenoszenie nicieni na świeże płytki sDR co 12-48 godzin, aby uniknąć całkowitego braku pożywienia.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Na rysunku 1 przedstawiono wykres reprezentatywnej krzywej kalibracyjnej dla szacowania stężenia OP50 w odniesieniu do OD600. Równanie uzyskane w drodze analizy regresji liniowej może być wykorzystane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP50. Na rysunku 2 przedstawiono przykład badania wpływu chronicznych zabiegów sDR na średnią długość życia różnych szczepów nicieni. Niebieska linia reprezentuje typową odpowiedź zależną od dawki nicieni typu dzikiego na sDR. Czerwona linia wskazuje, że efekt sDR na długość życia jest częściowo tłumiony przez drr-2 o.e., natomiast daf-16(mu86) nie ma wpływu na indukowane przez sDR wydłużenie życia. Szczegółowa metoda przeprowadzania analizy długości życia u C. elegans została opisana w poprzedniej literaturze 1-3.
<img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="Wykres stężenia bakterii w funkcji gęstości optycznej, regresja liniowa, R²=0.99505, analiza OD600." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywny wynik krzywej kalibracyjnej do szacowania stężenia E. Coli OP50. Stężenie OP50 przedstawiono jako funkcję zmierzonych wartości OD600. Słupki błędów = S.D. Nocna hodowla bakteryjna została rozcieńczona 1,5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x przed pomiarem absorbancji, a następnie dwukrotnie rozcieńczona 1000x przed pomiarem cfu.
<img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="Wykres koncentracji bakterii w funkcji średniej długości życia; analiza N2, daf-16(mu86) oraz nadekspresji drr-2." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny wynik C. elegans eksperyment dotyczący długości życia porównujący zwierzęta typu dzikiego N2 (niebieski) z dwoma różnymi mutantami (zielony i czerwony) w odpowiedzi na sDR (rycina z pracy Ching) i wsp. 4). Słupki błędów = S.E.M.

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wiadomo, że restrykcje dietetyczne (DR) wydłużają czas życia i opóźniają wystąpienie wielu chorób związanych z wiekiem u szerokiego grona gatunków, w tym u ssaków 5-7. Do modelowania DR u C. elegans wykorzystywano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, w tym hodowlę nicieni w półzdefiniowanym medium ciekłym 8,9, rozcieńczanie bakteryjnego źródła pokarmu w medium ciekłym 10-12 oraz wykorzystanie mutantów behawioralnych, które żywią się wolniej 13. Jednak ge...

<table><tbody><tr><td>Karbenicylina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109.25</td><td>Rozpuszczona w wodzie.</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Roche Group</td><td>10106801001</td><td>Rozpuszczona w wodzie.</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0118072</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-trypton</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123075</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0127071</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>DF00145170</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna probówka do hodowli</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1485-0810</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Amersham</td><td>Gene Quant pro</td><td>Amersham jest obecnie częścią GE Healthcare.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Accuspin FR</td><td></td></tr></tbody></table>

ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Wiadomo, że ograniczenie spożycia pokarmu bez doprowadzenia do niedożywienia lub zagłodzenia wydłuża długość życia i opóźnia wystąpienie wielu chorób związanych z wiekiem u szerokiego spektrum gatunków, w tym u ssaków. Powoduje ono również spadek masy ciała i płodności, a także obniżenie poziomu glukozy w osoczu, insuliny oraz IGF-1 u tych zwierząt. Zabieg ten jest często określany jako restrykcja dietetyczna (DR) lub restrykcja kaloryczna (CR). Nicień Caenorhabditis elegans stał się istotnym organizmem modelowym do badania biologii starzenia. Do modelowania DR wykorzystywano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, które wykazały działanie wydłużające długość życia u C. elegans. Jednak wiele raportowanych badań nad DR u C. elegans przeprowadzano poprzez hodowlę zwierząt w pożywkach płynnych, podczas gdy większość badań genetycznych w dziedzinie starzenia prowadzono na standardowym stałym agarze w szalkach Petriego. W niniejszym protokole przedstawiamy metodę DR z wykorzystaniem standardowych szalek z agarem NGM z martwymi bakteriami.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Wiadomo, że ograniczenie przyjmowania pokarmu bez niedożywienia ani głodzenia wydłuża życie i opóźnia wystąpienie wielu chorób związanych z wiekiem w szerokim...

Procedura polega na zastosowaniu ograniczenia kalorycznego w standardowych warunkach hodowli na płytkach z pożywką sea elegance w celu zbadania jego wpływu na długowieczność, reprodukcję i metabolizm. Jest to realizowane poprzez dokładny pomiar stężenia bakterii, które będą służyć jako źródło pokarmu. Drugim krokiem procedury jest odpowiednie rozcieńczenie hodowli bakterii do właściwych stężeń.Następnie przygotuj podłoża SDR z martwymi bakteriami. Na koniec przeprowadź eksperymenty SDR z populacją nicieni o zsynchronizowanym wieku. Wyniki pomiarów produkcji potomstwa i długości życia mogą wykazać opóźnioną i zredukowaną produkcję potomstwa oraz wydłużoną średnią długość życia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do metod takich jak Dian w medium AZA, jest to, że cały eksperyment zostanie przeprowadzony na standardowej płytce z agarem AGA, stosowanej w większości laboratoriów badających organizmy ciepłolubne. W przypadku eksperymentów z restrykcją dietetyczną należy sporządzić oddzielne krzywe kalibracyjne dla każdego szczepu bakterii wykorzystywanego jako źródło pożywienia. Pobierz pojedynczą kolonię bakterii e coli OP 50 ze świeżego wysiewu na agar LB i zaszczep trzy mililitry płynnej kultury w bulionie LB w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc. Przygotuj seryjne dwukrotne rozcieńczenia kultury z nocnej inkubacji.Następnie zmierz absorbancję każdego rozcieńczenia przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru w trzech powtórzeniach. Dalsze rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej wykonaj w stopniu milionkrotnym, a następnie równomiernie wysej 0,4 mililitra zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na płytkę LB agar o średnicy 100 milimetrów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Policz liczbę kolonii bakteryjnych wyrosłych na każdej płytce, aby obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr dla każdej próbki.Następnie narysuj wykres OD 600 jako funkcji stężenia bakterii i przeprowadź analizę regresji liniowej, aby ustalić zależność między zmierzonymi wartościami OD 600 a stężeniami bakterii OP 50. W tej metodzie w warunkach karmienia ad libitum stosuje się stężenie bakterii wynoszące 1 × 10¹¹ CFUs na mililitr, a w optymalnych warunkach karmienia DR – 1 × 10⁸ CFU na mililitr. Jednak do ustalenia pełnej zależności od dawki może być konieczne zastosowanie od czterech do sześciu różnych stężeń bakterii.W celu przeprowadzenia SDR i analizy odpowiedzi. Przygotuj inokulum z pojedynczej kolonii bakterii e coli OP 50 w 3 ml płynnej pożywki LB, inkubując w wytrząsarku w temperaturze 37 °C przez sześć do ośmiu godzin. Przenieś kulturę OP 50 do nowej kolby zawierającej 500 ml pożywki LB i hoduj przez noc, aby bakterie osiągnęły nasycenie, jeśli jest to konieczne.Przygotować odpowiednie rozcieńczenie kultury OP 50 do pomiaru absorbancji przy OD 600. Aby określić stężenie bakterii, należy je zgranulować poprzez wirowanie przy 1500 Gs przez 20 minut. Usunąć nadosad i resuspendować bakterie do stężenia 1 × 10¹² CFUs na mililitr.Następnie przygotuj kultury bakterii o objętości 10 mililitrów w sześciu różnych stężeniach, w zakresie od 1 × 10¹² do 1 × 10⁷ CFU na mililitr. Nanieś 0,2 mililitra kultury bakterii na środek zestalonej płytki NGM o średnicy 60 milimetrów. Unikaj dotykania końcówką pipety powierzchni płytki, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają nicieniom przekopanie się do agaru.Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Następnie nanieś na każdą płytkę 10 µL carbonic soin o stężeniu 100 mg/mL oraz 10 µL canmycyny o stężeniu 50 mg/mL, aby zahamować wzrost bakterii. Przechowuj płytki z różnymi stężeniami antybiotyku i zabitymi bakteriami w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania przez okres do jednego miesiąca.Ważne jest, aby przygotować i przechowywać odpowiednią liczbę płytek, najlepiej z tej samej serii dla całej rośliny. Przeprowadź eksperyment z co najmniej jednodniowym lub dwudniowym wyprzedzeniem, aby zweryfikować żywotność bakterii. Zeskrob niewielką ilość bakterii z płytek SDR i wysiej ją na pustą płytkę N GM z karbonikiem, seiną i antymycyną.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na sześć do ośmiu godzin i potwierdź brak wzrostu bakterii. W większości badań związanych z SDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie produkcji potomstwa, niezbędne jest przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku. Użyj platynowego picker-a do nicieni, aby przenieść 20 do 30 reprodukcyjnie aktywnych osobników dorosłych na kilka zwykłych płytek NGM.Z użyciem szczepu OP 50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być konieczne użycie większej liczby osobników dorosłych. Pozostawić płytki w temperaturze 20 °C przez cztery godziny, aby umożliwić składanie jaj.Usuń osobniki dorosłe z szalki i sprawdź wizualnie, czy na szalkach znajdują się jaja. Kontynuuj inkubację szalek w temperaturze 20°C, aby potomstwo mogło rozwinąć się do późnego stadium L4 lub pierwszego dnia stadium dorosłego. W przypadku nicieni N2 typu dzikiego w temperaturze 20°C zwykle trwa to trzy dni.Do analizy długości życia. Przenieś od 10 do 12 jednodniowych dorosłych nicieni na płytkę SDR, aby rozpocząć restrykcję dietetyczną. W celu uzyskania odpowiedniej mocy statystycznej użyj łącznie od 60 do 100 nicieni dla każdego wariantu SDR.Oceniaj żywotność każdego nicienia co dwa do trzech dni, aż do śmierci wszystkich osobników. Ważne jest, aby co drugi dzień przenosić nicienie na świeże płytki SDR, aby zapobiec ich zagłodzeniu. Ta krzywa kalibracyjna przedstawia stężenie OP 50 w zależności od OD 600.Równanie wyznaczone za pomocą analizy regresji liniowej może być wykorzystywane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP 50. W niniejszym badaniu analizuje się wpływ przewlekłych zabiegów SDR na średnią długość życia różnych szczepów nicieni w porównaniu z normalną odpowiedzią zależną od dawki nicieni typu dzikiego na SDR. Efekt przedłużenia długości życia indukowany przez SDR jest częściowo tłumiony przez nadekspresję DR dwa, podczas gdy mutacja DAF 16 MU 86 nie wpływa na wydłużenie długości życia indukowane przez SDR.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przeprowadzania Dian w standardowej grze opartej na AGA w sea elegance.

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ograniczenia żywieniowe oparte na stałych płytkach u Caenorhabditis elegans

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Caenorhabditis elegans to użyteczny model do badania funkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w rozwoju i fizjologii.  Protokół ten opisuje skuteczną metodę uzupełniania diety C. elegans w wielonienasycone kwasy tłuszczowe.

Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę restrykcji dietetycznej na stałych płytkach w Caenorhabditis elegans przy użyciu zabitych bakterii. Protokół pozwala badać wpływ diety na długość życia, reprodukcję i metabolizm.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów