Name: Siedem kroków do komórek gwiaździstych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z mysiej wątroby za pomocą perfuzji enzymatycznej i gradientowej centrifugacji gęstościowej. Technika ta zapewnia wysoką czystość komórek do badań biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z funduszy Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research oraz NIH RO1 AI083426-01 (F.W.). Patrick Maschmeyer i Melanie Flach otrzymali wsparcie w ramach stypendiów doktoranckich z Boehringer Ingelheim Foundation.

Należy używać myszy C57BL/6 w wieku około 20 tygodni lub starszych. Zaleca się stosowanie samców myszy o masie 25-30g. Wydajność izolacji komórek gwiaździstych można zwiększyć, podając myszom dietę wzbogaconą w witaminę A przez 2 miesiące przed izolacją tych komórek. Z wątroby jednej myszy C57BL/6 można oczyścić około 2x105 wątrobowych komórek gwiaździstych, natomiast wydajność uzyskiwana z myszy Balb/c jest znacznie wyższa. Poniższy protokół został dostosowany do 5 myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty były prowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). 


1. Perfuzja in situ wątrób myszy enzymami trawiennymi
<ol>
 <li>Podgrzać bufor SC1 oraz roztwory do perfuzji enzymatycznej w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
 <li>Zamocować skrzydłowy zestaw do infuzji do silikonowej rurki pompy perystaltycznej.</li>
 <li>Zkalibrować pompę za pomocą PBS, aby uzyskać przepływ laminarny wynoszący 6,5ml/min, który będzie stosowany podczas perfuzji wątroby in situ. Przepłukać silikonową rurkę roztworem SC1 w celu równoważenia.</li>
 <li>Uśpić mysz poprzez podanie dootrzewnowe roztworu ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), a następnie sprawdzić zanik odruchów, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w stanie głębokiej narkozy.</li>
 <li>Utrzymać mysz w pozycji grzbietnej na odpowiedniej podstawie.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek i pęsety wykonać podłużne nacięcie skóry brzucha i odsłonić otrzewną.</li>
 <li>Ostrożnie otworzyć otrzewną i przesunąć jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
 <li>Wprowadzić kaniulę zestawu do infuzji do żyły wrotnej. Na tym etapie zaleca się użycie stereomikroskopu.</li>
 <li>Rozpocząć perfuzję wątroby 30ml roztworu SC1. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otworzyć żyłę główną dolną. O skutecznym wypłukaniu wątroby świadczy utrata koloru tkanki wątrobowej.</li>
 <li>Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem pronazy E. Po skutecznym trawieniu płaty wątroby opuchną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę.</li>
 <li>Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem kolagenazy P. Na tym etapie wątroba traci swój kształt i staje się atoniczna oraz amorficzna.</li>
 <li>Ostrożnie oddzielić wątrobę od przepony i otaczających organów, a następnie umieścić ją w 70ml roztworu SC2 na lodzie.</li>
 <li>Powtórzyć procedurę dla kolejnych myszy.</li>
</ol>





2. Trawienie in vitro wątrób myszy

Wszystkie kolejne etapy pracy należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

<ol>
 <li>Za pomocą ostrych nożyczek pokrój wątroby na kawałki o wymiarach około 2x2x2mm3.</li>
 <li>Połącz zawiesinę 70ml SC2 zawierającą kawałki wątroby z 50ml roztworu Pronazy E-Kolagenazy P i dodaj 1ml roztworu DNazy I.</li>
 <li>Traw wątroby przez 20min w temperaturze 37°C przy ciągłym mieszaniu.</li>
</ol>
3. Wirowanie w gradiencie gęstości
<ol>
 <li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitka komórkowe 70μm do 6 probówek Falcon 50ml i uzupełnij objętość do 50ml buforem SC2. Wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.</li>
 <li>Ostrożnie odessij 40ml supernatantu, następnie dodaj 150μl roztworu DNazy I do każdej probówki i resuspenduj komórki. </li>
 <li>Połącz zawiesiny komórkowe w 4 probówkach Falcon 50ml i przemyj je GBSS-B, a następnie wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.</li>
 <li>Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu, i dodaj 150μl roztworu DNazy I do każdej probówki. Resuspenduj osady komórkowe w 10ml GBSS-B na probówkę. </li>
 <li>Połącz komórki w 2 probówkach Falcon 50ml i dodaj GBSS-B do całkowitej objętości 36ml na probówkę. Dodaj 14ml roztworu Nycodenz do każdej probówki i dobrze wymieszaj.</li>
 <li>Przenieś 10ml zawiesiny komórkowej do jednej probówki do wirowania gradientowego 12ml, co da łącznie 10 probówek. Ostrożnie nałóż na wierzch zawiesiny komórkowej 1,5ml GBSS-B na probówkę. </li>
 <li>Wiruj gradienty przez 15min przy 1500g i 4°C bez hamowania. W rezultacie hepatocyty utworzą osad na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się w interfazie w postaci białego pierścienia.</li>
 <li>Ostrożnie pobierz interfazę zawierającą komórki gwiaździste i przemyj je GBSS-B; wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.</li>
 <li>Odessij supernatant i resuspenduj komórki w 20ml DMEM uzupełnionego o 10% inaktywowanej termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2mM L-glutaminy, 1mM pirogronianu sodu oraz 10mM HEPES. Przenieś komórki do kolb hodowlanych w stężeniu 2x104 komórek/cm2. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2. </li>
 <li>Wymień medium, gdy tylko komórki gwiaździste wątroby przywrą do podłoża (około 2h po przygotowaniu), aby wypłukać martwe komórki i szczątki komórkowe. </li>
 <li>Następnego dnia komórki gwiaździste powinny rozwinąć charakterystyczną morfologię w kształcie gwiazdy z pęcherzykami lipidowymi magazynującymi witaminę A w obszarze okojądrowym. </li>
 <li>W kolejnych eksperymentach komórki gwiaździste wątroby można łatwo odłączyć od niepowlekanych powierzchni plastikowych, używając łagodnych roztworów enzymatycznych, np. Accutase.</li>
</ol>


4. Reprezentatywne wyniki:
Po przygotowaniu komórek gwiaździstych wątroby zgodnie z podanym protokołem, czystość wyizolowanej populacji można zweryfikować, biorąc pod uwagę trzy główne cechy tego typu komórek, takie jak kształt przypominający gwiazdę, perinuklearne krople lipidowe oraz ekspresja białka kwaśnego włókienka glejowego (GFAP). Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające charakterystyczny wygląd komórek gwiaździstych wątroby 2h po izolacji, a także w 1. i 3. dniu hodowli in vitro, przedstawiono na Ryc. 1. Ryc. 2 przedstawia reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne GFAP w komórkach gwiaździstych wątroby, które były hodowane przez 3 dni po izolacji. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w komórki miofibroblastyczne podczas hodowli in vitro. Charakterystyczną cechą tych aktywowanych komórek gwiaździstych jest ekspresja aktyny gładkokomórkowej alfa (αSMA). Ryc. 3 przedstawia barwienie immunofluorescencyjne αSMA oraz miozyny IIA w aktywowanych komórkach gwiaździstych w 7. dniu hodowli in vitro.



<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="Mikroskopowe obrazy pęcherzyków lipidowych, widoczne komórki; eksperyment czteropanelowy, analiza lipidów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Charakterystyczna morfologia komórek gwiaździstych wątroby. Komórki gwiaździste wyizolowano z wątrób myszy zgodnie z podanym protokołem. Obrazy przedstawiają komórki gwiaździste 2h po izolacji (a, b), a także w dniu 1 (c) i dniu 3 (d) hodowli in vitro. Komórki gwiaździste wątroby wykazują dużą ilość pęcherzyków lipidowych w obszarach okołojądrowych i nabierają swojej charakterystycznej morfologii gwiaździstej w ciągu pierwszych dni hodowli in vitro (powiększenie 200x).



<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="Analiza struktury komórkowej; obraz mikroskopowy ukazujący fluorescencję w komórkach neuronów, kolor niebieski i pomarańczowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Komórki gwiaździste wątroby specyficznie wykazują ekspresję GFAP w wątrobie. Komórki gwiaździste zostały wyizolowane i poddane barwieniu immunofluorescencyjnemu na GFAP (czerwony) w 3. dniu hodowli in vitro. Jądra komórkowe przedstawiono w kolorze niebieskim (barwienie Hoechst).


<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej struktury komórkowej; barwienie filamentów aktynowych i jąder; badanie komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w myofibroblasty. Komórki gwiaździste wątroby wyizolowane od myszy C57BL/6 hodowano przez 7 dni. Następnie przeniesiono je na szkiełka komorowe i zabarwiono na aSMA (kolor czerwony) oraz miozynę IIA (kolor zielony). Jądra komórkowe skontrastowano barwieniem Hoechst (kolor niebieski). 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Bufor SC1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>190mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glukoza</td>
 <td>900mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10 ml roztworu stokowego 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>400mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 x 2 H2O</td>
 <td>151mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4 x H2O</td>
 <td>78mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>350mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czerwony fenol</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>dopełnić do 1l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Bufor SC2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 x 2H2O</td>
 <td>560mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10ml roztworu stokowego 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>400mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 x 2 H2O</td>
 <td>151mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4 x H2O</td>
 <td>78mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>350mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czerwony fenol</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>dopełnić do 1l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Bufor GBSS-A</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>370mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 x 2H2O</td>
 <td>225mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glukoza</td>
 <td>991mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>30mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 x 6 H2O</td>
 <td>210mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 x 7 H2O</td>
 <td>70mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 x 2 H2O</td>
 <td>75mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>227mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czerwony fenol</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>dopełnić do 1l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Bufor GBSS-B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 x 2H2O</td>
 <td>225mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glukoza</td>
 <td>991mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>370mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>30mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 x 6 H2O</td>
 <td>210mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 x 7 H2O</td>
 <td>70mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 x 2 H2O</td>
 <td>75mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>227mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czerwony fenol</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>dopełnić do 1l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Roztwór perfuzyjny Pronase E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pronase E</td>
 <td>100mg (4000 PU/mg min) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor SC2</td>
 <td>200ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Roztwór perfuzyjny Kolagenaza P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagenaza P</td>
 <td>85mg (1.78 U/mg lyo)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor SC2</td>
 <td>200ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Roztwór Pronase E-Kolagenaza P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pronase E</td>
 <td>50mg (4000 PU/mg min) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagenaza P</td>
 <td>85mg (1.78 U/mg lyo)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor SC2</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Roztwór DNaza I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNaza I</td>
 <td>6mg (ok. 2000U/mg)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GBSS-B</td>
 <td>3ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Roztwór Nycodenz</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nycodenz</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GBSS-A</td>
 <td>28ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Bufory i roztwory enzymów wymagane do izolacji komórek gwiaździstych wątroby. pH wszystkich buforów należy dostosować do wartości 7,3-7,4. Ponadto zaleca się sterylną filtrację wszystkich buforów. Ważne jest, aby dostosować ilość użytego enzymu do podanej aktywności enzymatycznej.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Komórki gwiaździste wątroby regulują kluczowe procesy fizjologiczne i patofizjologiczne w wątrobie. Ponadto komórki gwiaździste posiadają właściwości prezentacji antygenu, co czyni je istotnym elementem odpowiedzi immunologicznej wątroby. Chociaż komórki gwiaździste wątroby stanowią 10-15% całkowitej liczby komórek w wątrobie, ich izolacja jest trudna ze względu na lokalizację w okozatokowej przestrzeni Dissego.

 Przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mys...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;Sito do oddzielania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Grupa Roche</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Grupa Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-cv</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fluka</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirowania w gradiencie stężeń</td><td>Greiner Bio-One</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 6 h&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; x 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; x 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; x H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Accudenz AG</td><td>AN7050/BLK</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-7523-70</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4633</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza E</td><td>Calbiochem</td><td>7433-2</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>HV-96440-14</td><td></td></tr><tr><td>pirowinian sodu</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowej (25 cm²)&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>BD Biosciences</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji z motylkiem</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>1SV27EL</td><td></td></tr></tbody></table>

siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Seven Steps to Stellate Cells

Komórki gwiaździste wątroby są rezydującymi w wątrobie komórkami o morfologii przypominającej gwiazdę, zlokalizowanymi w przestrzeni Disse’a pomiędzy sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby a hepatocytami1,2. Komórki gwiaździste pochodzą z prekursorów szpiku kostnego i magazynują do 80% całkowitej ilości witaminy A w organizmie1, 2. Po aktywacji komórki gwiaździste różnicują się w myofibroblasty, które produkują macierz pozakomórkową, przyczyniając się tym samym do włóknienia wątroby3. Dzięki zdolności do kurczenia się, myofibroblastyczne komórki gwiaździste mogą regulować napięcie naczyniowe związane z nadciśnieniem wrotnym4. Niedawno wykazaliśmy, że komórki gwiaździste wątroby są potężnymi komórkami prezentującymi antygen i mogą aktywować zarówno komórki NKT, jak i konwencjonalne limfocyty T5.

 W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wydajnego przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Ze względu na ich perysinusoidalną lokalizację, izolacja komórek gwiaździstych wątroby jest procesem wieloetapowym. Aby umożliwić izolację komórek gwiaździstych z przestrzeni Disse'a, wątroby mysie są perfundowane in situ enzymami trawiennymi: Pronazą E i Kolagenazą P. Po perfuzji tkanka wątroby poddawana jest dodatkowej obróbce enzymatycznej z użyciem Pronazy E i Kolagenazy P in vitro. Następnie metoda wykorzystuje obecność ogromnej liczby kropli lipidowych magazynujących witaminę A w komórkach gwiaździstych wątroby. Cecha ta pozwala na oddzielenie komórek gwiaździstych od innych typów komórek wątroby poprzez wirowanie w 8% gradiencie Nycodenzu. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie wysoce czystej i homogennej populacji komórek gwiaździstych. Czystość preparatów można ocenić poprzez barwienie na cząsteczkę markerową – kwaśne białko włókieniste gleju (GFAP), przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Ponadto mikroskopia świetlna ujawnia charakterystyczny wygląd gwieździstych komórek gwiaździstych wątroby, które zawierają dużą liczbę kropli lipidowych.


 Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnej izolacji komórek gwiaździstych wątroby, obejmujący reprezentatywne obrazy ich morfologii oraz ekspresji GFAP, które pomagają zdefiniować tożsamość komórek gwiaździstych.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. W celu oczyszczania komórek gwiaździstych, wątroby mysie poddawane są trawieniu in situ oraz in vitro przy użyciu pronazy i kolagenazy przed przeprowadzeniem wirowania w gradiencie gęstości. Technika ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości komórek gwiaździstych wątroby.

Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Komórki gwiaździste wątroby to rezydujące w wątrobie komórki o morfologii przypominającej gwiazdę, zlokalizowane w przestrzeni Dissego pomiędzy śródbłonkowymi komórkami sinusoid wątrobowych...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności dwóch perfuzji wątrób mysich enzymami trawiennymi. Po perfuzji wątroby są cięte na małe kawałki w celu zwiększenia wydajności trawienia in vitro, które jest wykonywane w kolejnym kroku.W ostatnim kroku komórki gwiaździste wątroby są oddzielane od innych typów komórek wątroby za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. W rezultacie uzyskuje się komórki gwiaździste wątroby, a ich czystość można ocenić za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofluorescencyjnej. Procedurę zademonstruje Patrick Meyer, doktorant z laboratorium. W ramach przygotowania do perfuzji wątrób mysich w roztworze NC dwa, należy najpierw ogrzać bufor SC jeden oraz roztwory perfuzyjne z enzymami w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Następnie należy ustawić pompę perystaltyczną tak, aby uzyskać przepływ laminarny wynoszący 6.5 milliliters per minute i zrównoważyć rurkę silikonową pompy roztworem SC one. Teraz należy potwierdzić brak odruchów, aby upewnić się, że znieczulona mysz znajduje się w głębokiej sedacji. Następnie mysz należy unieruchomić w pozycji grzbietowej na odpowiedniej podstawie.Używając nożyczek i pęsety, wykonaj nacięcie podłużne skóry brzusznej i odsłoń otrzewną. Ostrożnie otwórz otrzewną i przesuń jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest perfuzja wątroby enzymami trawiennymi, która zostanie teraz zademonstrowana.Następnie, podczas wprowadzania kaniuli oraz monitorowania zmian w strukturach wątroby w trakcie perfuzji, ważne jest korzystanie ze stereomikroskopu. Pracując pod stereomikroskopem, wprowadź kaniulę zestawu infuzyjnego do żyły wrotnej. Rozpocznij perfuzję wątroby 30 mililitrami roztworu SC one. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otwórz żyłę główną dolną.Prawidłowe przepłukanie wątroby objawia się utratą barwy tkanki wątrobowej; następnie przemyj wątrobę 30 mililitrami roztworu Pronase E. Po perfuzji roztworem pronazy E płaty wątroby obrzękną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę; następnie przeprowadź perfuzję 30 mililitrami roztworu kollagenazy P. Po zakończeniu perfuzji kollagenazą P pobierz wątrobę z myszy, ostrożnie oddzielając ją od przepony i sąsiednich organów, a następnie umieść ją w 70 mililitrach roztworu SC two na lodzie.W tym momencie wątroba straciła swój kształt i wygląda na wiotką oraz amorficzną. Procedura trawienia wątrób mysich powinna być przeprowadzana w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Za pomocą ostrych nożyczek należy pociąć wątroby na kawałki o wymiarach około 2 × 2 × 2 mm³. Następnie zawiesinę 70 ml SC dwa oraz kawałki wątroby należy połączyć z 50 ml roztworu proteazy E i kolagenazy P. Po dodaniu 1 ml roztworu dna jeden, wątroby należy trawić przez 20 minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym mieszaniu.Po trawieniu enzymatycznym tkanki wątroby komórki gwiaździste są oddzielane od innych typów komórek wątrobowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Aby rozpocząć tę procedurę, przefiltruj zawiesinę komórkową przez sita komórkowe o rozmiarze 70 µm do sześciu probówek Falcon o pojemności 50 mL i przemyj komórki buforem E2, a następnie wiruj przez 10 minut przy 600 ×g w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessij 40 mL supernatantu z każdej probówki.Następnie do każdej probówki dodaj 150 µL roztworu DNA i resuspenduj komórki. Połącz zawiesiny komórkowe w czterech probówkach Falcon o pojemności 50 mL i przemyj za pomocą wirówki w buforze G-B-S-S-P przez 10 minut przy 600 ×g i 4 °C. Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie do każdej probówki dodaj 150 µL roztworu DNA.Osady komórkowe resuspendujemy w 10 mililitrach G-B-S-S-B na probówkę. Komórki łączymy w dwóch 50-mililitrowych probówkach typu Falcon i dopełniamy G-B-S-S-B do całkowitej objętości 36 mililitrów na probówkę. Do każdej probówki dodajemy 14 mililitrów roztworu den i dokładnie mieszamy.Następnie przenieś 10 mililitrów zawiesiny komórkowej do jednej probówki do wirowania gradientowego o pojemności 12 mililitrów, aż do uzyskania łącznie 10 probówek. Ostrożnie nałóż na zawiesinę komórkową 1,5 mililitra G-B-S-S-B na probówkę. Wirowanie gradientów przeprowadź przez 15 minut przy 1500 Gs i czterech stopniach Celsius bez hamowania.Następnie hepatocyty osiądą na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się na granicy faz w postaci białego pierścienia. Za pomocą pipety 5 ml ostrożnie pobierz frakcję z granicy faz zawierającą komórki gwiaździste i przenieś ją do probówki o pojemności 50 ml. Przemyj komórki, dodając G-B-S-S-B i wirując przez 10 minut przy 600 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odssać supernatant i resuspender komórki w 20 mililitrach DMEM z dodatkami. Po policzeniu komórek przenieść je do kolb hodowlanych w stężeniu 2 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy; inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Około dwóch godzin po przygotowaniu komórki gwiaździste wątroby powinny przywrzeć do podłoża; zmienić medium, aby wypłukać martwe komórki i resztki komórkowe.Przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mysich z zastosowaniem niniejszego protokołu. Komórki w pierwszym i trzecim dniu hodowli in vitro wykazują charakterystyczną morfologię komórek gwiaździstych wątroby. Mają one kształt astrocytoidalny i wykazują obecność pęcherzyków lipidowych.W obrębie jąder komórkowych czystość wyizolowanych komórek gwiaździstych wątroby można również zweryfikować poprzez ekspresję gliałowego kwaśnego białka włóknistego (GFAP). Obrazy te przedstawiają reprezentacyjne barwienie immunofluorescencyjne na GFAP, zaznaczone kolorem czerwonym w komórkach gwiaździstych wątroby, które były hodowane przez trzy dni po izolacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki gwiaździste wątroby z wątroby neuronowej, aby uzyskać odpowiednią wydajność czystych komórek gwiaździstych.Ważne jest zapewnienie efektywnego trawienia podczas perfuzji wątroby. Wreszcie, kluczowe jest określenie właściwej tożsamości wyizolowanych komórek poprzez ocenę morfologii i fenotypu komórek wątrobowych.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Siedem kroków do komórek gwiaździstych

Wyprowadzenie nabłonka prekursorów z zarodkowych komórek macierzystych (ES) komórki za pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA).

ES pochodzące z komórek nabłonka Cell Cultures

Ten film demonstruje protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w progenitorach móżdżku. Polega ona na przeniesieniu kolonii komórek macierzystych na bardzo niską płytkę przyczepową w celu utworzenia ciał zarodkowych, promowaniu różnicowania za pomocą czynników wzrostu, a następnie przeniesieniu ciał zarodkowych na płytkę pokrytą matrycą w celu adhezji. Kolejne kroki obejmują indukcję migracji komórek i dodanie pożywki do dojrzewania, aby kierować...

Technika generowania monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Patofizjologiczne zmiany w autonomicznym układzie nerwowym serca, zwłaszcza w jego oddziale współczulnym, przyczyniają się do wystąpienia i utrzymywania się komorowych zaburzeń rytmu serca. W niniejszym protokole pokazujemy, jak scharakteryzować mysie zwoje gwiaździste, aby lepiej zrozumieć leżące u ich podstaw procesy molekularne i komórkowe.

Lokalizacja, rozwarstwienie i analiza mysiego ganglionu gwiaździstego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Poznaj metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z mysiej wątroby za pomocą perfuzji enzymatycznej i gradientowej centrifugacji gęstościowej. Technika ta zapewnia wysoką czystość komórek do badań biologii komórkowej.

Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Przeglądaj więcej filmów