Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności perfuzji wątrób myszych enzymami trawiennymi. Po perfuzji wątroby są cięte na małe kawałki w celu zwiększenia wydajności trawienia in vitro, które jest wykonywane w kolejnym kroku.

W ostatnim kroku komórki gwiaździste wątroby zostają oddzielone od innych typów komórek wątroby za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. W rezultacie otrzymuje się komórki gwiaździste wątroby, których czystość można ocenić za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofluorescencyjnej. Procedurę zaprezentuje Patrick Meyer, doktorant z laboratorium. W ramach przygotowania do perfuzji wątrób myszych NC 2, najpierw podgrzej bufor SC 1 oraz roztwory perfuzyjne z enzymami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

Następnie ustaw pompę perystaltyczną tak, aby uzyskać przepływ laminarny rzędu 6,5 milliliters per minute i zrównoważ rurkę silikonową pompy za pomocą roztworu SC one. Następnie potwierdź brak odruchów, aby upewnić się, że znieczulona mysz znajduje się w stanie głębokiej sedacji. Po tym unieruchom mysz w pozycji grzbietnej na odpowiedniej podstawie.

Za pomocą nożyczek i pincety wykonaj nacięcie wzdłużne skóry brzucha i odsłoń otrzewną. Ostrożnie otwórz otrzewną i przesuń jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną. Najtrudniejszym etapem tej procedury jest perfuzja wątrób enzymami trawiennymi, co zostanie zaprezentowane.

Następnie, podczas wprowadzania kaniuli, ważne jest zastosowanie stereomikroskopu oraz uważne monitorowanie zmian w strukturach wątroby w trakcie perfuzji. Pracując pod stereomikroskopem, wprowadź kaniulę zestawu infuzyjnego do żyły wrotnej. Rozpocznij perfuzję wątroby za pomocą 30 milliliters roztworu SC one. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otwórz żyłę główną dolną.

Prawidłowe przepłukanie wątroby objawia się utratą barwy tkanki wątrobowej; następnie należy przepłukać wątrobę 30 mililitrami roztworu Pronase E. Po perfuzji roztworem Pronase E płaty wątroby spuchną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę; następnie należy przeprowadzić perfuzję 30 mililitrami roztworu kolagenazy P. Po zakończeniu perfuzji kolagenazą P należy pobrać wątrobę z myszy, ostrożnie oddzielając ją od przepony i sąsiednich organów, a następnie umieścić ją w 70 mililitrach roztworu SC two w lodzie.

W tym momencie wątroba utraciła swój kształt i wygląda na atoniczną oraz amorficzną. Procedurę trawienia wątrób myszy należy przeprowadzać w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Za pomocą ostrych nożyczek pokroić wątroby na kawałki o wymiarach około 2 × 2 × 2 mm³. Następnie połączyć zawiesinę 70 ml SC two i kawałki wątroby z 50 ml roztworu proteazy E i kolagenazy P. Dodać 1 ml dna, one solution i trawić wątroby przez 20 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu.

Po trawieniu enzymatycznym tkanki wątroby, komórki gwiaździste są oddzielane od innych typów komórek wątrobowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Aby rozpocząć tę procedurę, przefiltrować zawiesinę komórkową przez sita komórkowe o oczkach 70 µm do sześciu probówek typu Falcon o pojemności 50 mL, a następnie przemyć komórki buforem E2 i wirować przez 10 minut przy 600 ×g w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessać 40 mL supernatantu z każdej probówki.

Następnie dodaj 150 µL roztworu DNA do każdej probówki i resuspenduj komórki. Połącz zawiesiny komórkowe w czterech probówkach Falcon o pojemności 50 mL i przemyj za pomocą wirowania w buforze G-B-S-S-P przez 10 minut przy 600 ×g i 4 °C. Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu, a następnie dodaj 150 µL roztworu DNA do każdej probówki.

Osady komórkowe resuspendujemy w 10 mililitrach G-B-S-S-B na probówkę. Komórki łączymy w dwóch 50-mililitrowych probówkach typu Falcon i dodajemy G-B-S-S-B do uzyskania całkowitej objętości 36 mililitrów na probówkę. Do każdej probówki dodajemy 14 mililitrów roztworu den i dokładnie mieszamy.

Następnie przenieś 10 ml zawiesiny komórkowej do jednej probówki do wirowania gradientowego o pojemności 12 ml, aż do uzyskania łącznie 10 probówek. Delikatnie nałóż 1,5 ml G-B-S-S-B na zawiesinę komórkową w każdej probówce. Wirowanie gradientów prowadź przez 15 minut przy 1500 Gs i 4 °C bez hamowania.

Następnie hepatocyty utworzą osad na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się w warstwie przejściowej w postaci białego pierścienia. Za pomocą pipety o objętości 5 ml ostrożnie pobierz warstwę przejściową zawierającą komórki gwiaździste i przenieś ją do probówki o objętości 50 ml. Przemyj komórki, dodając G-B-S-S-B, a następnie wiruj przez 10 minut przy 600 Gs i w temperaturze 4 °C.

Odssać nadsącz i resuspender komórki w 20 mililitrach DMEM z dodatkami. Po przeliczeniu komórek przenieść je do kolb hodowlanych w stężeniu 2 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy; inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Około dwie godziny po przygotowaniu komórki gwiaździste wątroby powinny przywrzeć do podłoża, po czym należy wymienić medium, aby wypłukać martwe komórki i szczątki komórkowe.

Przenieś komórki z powrotem do inkubatora; reprezentatywne wyniki przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mysich z wykorzystaniem niniejszego protokołu przedstawiono tutaj. Komórki w pierwszym i trzecim dniu hodowli in vitro wykazują charakterystyczną morfologię komórek gwiaździstych wątroby. Mają one kształt astrocytopodobny i wykazują gromadzenie pęcherzyków lipidowych.

W poszczególnych miejscach jądra czystość wyizolowanych komórek gwiaździstych wątroby można również zweryfikować poprzez ekspresję kwaśnego białka włókienstwa glejowego (GFAP). Obrazy te przedstawiają reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne dla GFAP, zaznaczone na czerwono w komórkach gwiaździstych wątroby, które były hodowane przez trzy dni po izolacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki gwiaździste wątroby z wątroby neuron w celu uzyskania odpowiedniej wydajności czystych komórek gwiaździstych.

Ważne jest zapewnienie efektywnego trawienia podczas perfuzji wątroby. Na koniec kluczowe jest określenie właściwej tożsamości wyizolowanych komórek poprzez ocenę morfologii i fenotypu komórek dal wątroby.