Name: Metody oceny śmierci komórek beta za pośrednictwem cytotoksycznych limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Poznaj dwie metody oceny cytotoksyczności limfocytów T CD8+ wobec komórek beta trzustki: test uwalniania chromu 51 oraz obrazowanie żywych komórek z barwnikiem potencjału mitochondrialnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health DK074656 oraz AI56374 (CEM), a także z Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Kultura komórek docelowych: Hodowlę mysich linii komórkowych beta, NIT-1 i NIT-4, prowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem1,2 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS, 0,02% BSA, niezasadnicze aminokwasy, 15mM HEPES, 16,5mM glukozy oraz penicylinę/streptomycynę. Do znakowania 51Cr wysiać komórki na 96-dołkową płytkę hodowlaną z płaskim dnem w zagęszczeniu 5X104 komórek/dołek w 200 μl pożywki hodowlanej. Do eksperymentów mikroskopowych wysiać komórki na 8-dołkową szkiełka nakrywkę z komorami Lab-Tak II w zagęszczeniu 5x104 na komorę w 500 μl pożywki hodowlanej i inkubować przez 48 godzin przed zastosowaniem w badaniach cytotoksyczności.</li> 
	<li>Kultura kontrolnej linii komórkowej limfocytów T: Jako kontrolę negatywną wykorzystać linię komórkową Jurkat (ATCC, ludzka linia komórkowa limfocytów CD3+). Hodować komórki Jurkat w pożywce RPMI1640 uzupełnionej o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1,5 g/L wodorowęglanu sodu, 10 mM HEPES i 1,0 mM pirogronianu sodu.</li> 
</ol>
2. Pozyskiwanie i aktywacja efektorowych autoreaktywnych limfocytów T CD8+
Myszy NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] oraz NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] zostały zakupione z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i hodowane w naszym ośrodku dla myszy. Potomstwo hybrydowe F1 z krzyżówek NOD-AI4a z NOD-AI4b [NOD-AI4a/b] rozwija cukrzycę w wieku 3-5 tygodni. Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i uzyskały zatwierdzenie odpowiedniej instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
<ol>
	<li>Uśmierć myszy NOD-AI4a/b w wieku 3-4 tygodni za pomocą CO2. </li>
	<li>Pobierz śledziony od myszy. Uśmiercone myszy przygotuj za pomocą sprayu z etanolem i otwórz pod dygestorium chirurgicznym. Śledziony należy usunąć i natychmiast umieścić w lodowatym buforze HBSS.</li>
	<li>Wyizoluj komórki śledziony, używając szklanego homogenizatora 7 mL. Dwie do trzech śledzion razem umieść w 5 mL zimnego HBSS i zhomogenizuj za pomocą szklanego homogenizatora 7 mL. Homogenizat należy zebrać i odwirować z prędkością 1200rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C przy użyciu wirówki Sorvall RT7+. Zbierz osady komórkowe.</li>
	<li>Usuń erytrocyty poprzez traktowanie roztworem hipotonicznym. Osady traktuj 5 mL roztworu hipotonicznego na jedną śledzionę w warunkach chłodzenia na lodzie przez 5 minut, a następnie zneutralizuj poprzez dodanie równiej objętości HBSS. Zbierz komórki poprzez wirowanie, jak opisano powyżej, i resuspenduj w 50 mL HBSS. Przepuść zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe i policz komórki za pomocą hemocytometru z barwieniem TrypanBlue.</li>
	<li>Aktywuj komórki. Resuspenduj komórki do stężenia 5x106/mL i aktywuj poprzez 3-dniową hodowlę z 0,1 μM mimotopu AI4 (sekwencja aminokwasowa YFIENYLEL) oraz 25 U/mL IL-2 w pożywce RPMI1640 uzupełnionej o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1,5 g/L wodorowęglanu sodu, 10 mM HEPES i 1,0 mM pirogronianu sodu.</li> 
</ol>
3.	Test uwalniania 51Cr w celu badania CML
<ol>
<li>Znakowanie komórek docelowych: dodać 51Cr do komórek docelowych w ilości 1 μCi/dołek i inkubować przez 3 godziny, a następnie przemyć 3 razy pożywką hodowlaną.</li>
<li>Zawiesić komórki efektorowe w pożywce RPMI 1640, zgodnie z opisem w kroku 2.5, tak aby końcowa objętość dodana do każdej dołki wynosiła 200 μl.</li> 
<li>Po ostatnim przemyciu znakowanych komórek docelowych dodać aktywowane komórki efektorowe do kultur komórek docelowych w wybranych stosunkach efektorowych do docelowych (E:T). Zazwyczaj stosujemy stosunki E:T wynoszące 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 oraz 50:1.</li>
<li>Do 6 dołek z komórkami docelowymi dodać świeżą zmodyfikowaną pożywkę RPMI 1640 (patrz krok 2.5), która posłuży jako kontrola lizy spontanicznej.</li>
<li>Wykonywać kokulturę komórek efektorowych i docelowych przez 16 godzin.</li>
<li>Zebrać nadsącz do probówek Lime Glass 6x50 mm.</li>
<li>Zlizować komórki, dodając 100 μl 2% SDS i delikatnie pipetując kilka razy.</li> 
<li>Zebrać lizat komórkowy do kolejnego zestawu probówek Lime Glass 6x50 mm.</li> 
<li>Przemyć dołki raz czystą wodą H2O i dodać płuczkę do probówek z lizatem komórkowym.</li>
<li>Zmierzyć aktywność nadsączów i lizatów komórkowych za pomocą licznika gamma.</li> 
<li>Obliczyć specyficzną lizę według następującego wzoru: 
<img src="/files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Wzór równowagi statycznej; równanie % specyficznej lizy; zastosowanie edukacyjne w badaniach nad lizą komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>


4.	Barwienie komórek do obrazowania żywych komórek

Wśród najczęściej stosowanych barwników do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej TMRM wykazuje najniższą toksyczność mitochondrialną.3 W związku z tym wybraliśmy TMRM do niniejszych badań obrazowania żywych komórek.
<ol>
<li>Przygotować roztwór zapasowy TMRM o stężeniu 40 mM w DMSO i przechowywać w temperaturze -20°C. Przygotować świeży roztwór roboczy o stężeniu [25 nM] w pożywce DMEM bez czerwieni fenolowej ze wszystkimi suplementami do hodowli komórek NIT-1 1.</li> 
<li>Barwić docelowe komórki NIT-1 za pomocą TMRM 25 nM przez 30 min w temperaturze 37°C.</li>
<li>Wymienić pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą 5 nM TMRM, aby utrzymać równowagę rozkładu barwnika4.</li> 
<li>Policzyć aktywowane efektorowe limfocyty T AI4 za pomocą hematocytometru.</li>
<li>Barwić aktywowane efektorowe limfocyty T AI4 za pomocą Picogreen w stężeniu 1 μl/mL przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć trzykrotnie pożywką hodowlaną bez czerwieni fenolowej.</li>
</ol>
5. Ocena śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T przy użyciu obrazowania żywych komórek


<ol>
<li>Zamocuj szkiełko nakrywowe z komorą zawierające zabarwione komórki NIT na stoliku konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510. Usuń wypustkę za pomocą narzędzia Dremel i wysterylizuj szkiełko z komorą gazowo tlenkiem etylenu. Stolik jest wyposażony w komorę do obrazowania żywych komórek z kontrolą temperatury 37°C, 5% CO2 oraz wilgotnością.</li> 
<li>Dodaj aktywowane i zabarwione limfocyty T do odpowiednich komór w różnych stosunkach E:T.</li>
<li>Dodaj taką samą liczbę zabarwionych komórek Jurkat do komór kontrolnych.</li>
</ol>
6. Pozyskiwanie obrazów żywych komórek
Mikroskop jest wyposażony w zautomatyzowany stolik, który umożliwił nam automatyczne, powtarzalne pozyskiwanie obrazów z różnych lokalizacji w obrębie tych samych lub różnych komór w czasie trwania eksperymentu.
<ol>
	<li>Używając obiektywu olejowego 63x, wykonaj zdjęcia w odstępach 3 minut, uzyskując łącznie 300 klatek dla każdej lokalizacji.</li> 
	<li>Wykryj barwienie TMRM, stosując długość fali wzbudzenia 543 nm oraz zestaw filtrów dla emisji 565-619 nm.</li>
	<li>Wykryj barwienie Picogreen, stosując wzbudzenie 488 nm oraz zestaw filtrów dla emisji 500-630 nm. Wideo zostało utworzone przy użyciu oprogramowania Zeiss LSM.</li>
</ol>
7. Konwersja wideo do publikacji
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania Zeiss LSM utwórz nieskompresowany plik filmowy w formacie AVI.</li>
	<li>Aby przekonwertować wideo do formatu publikacyjnego, zaimportuj je do pakietu oprogramowania FIJI (<a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a>), będącego dystrybucją ImageJ (<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>), wykorzystując wtyczkę Bioformats z LOCI (<a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a>).</li> 
	<li>Dostosuj ustawienia jasności i kontrastu, aby zrównoważyć sygnały zielone i czerwone, a częstotliwość klatek ustaw na 2 frames/second w menu opcji animacji.</li> 
	<li>Przytnij wideo do wymiarów 512 x 512 pixels i wyeksportuj jako nieskompresowany plik AVI.</li> 
	<li>Otwórz ten plik AVI w oprogramowaniu Quicktime 7 (Apple computer, Cupertino, CA), a następnie skompresuj i wyeksportuj w otwartym formacie plików wideo H264/MPEG-4 przy przepływności 1200 kbs/second.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
<ol>
<li>Reprezentatywny wynik testu CML z użyciem 51Cr. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny wynik testu CML, w którym procent swoistej lizy (oś Y) wzrasta wraz ze wzrostem stosunku Efektory:Cel (oś X). Komórkami docelowymi są pierwotne wysepki wyizolowane z immunodeficyjnych myszy NOD.Rag1-/- i znakowane 51Cr. Splenocyty z transgenicznych myszy NOD.AI4α/β są izolowane i aktywowane zgodnie z opisem w kroku 2 powyżej. Komórki docelowe i efektory były współhodowane przez 16 godzin. Procent swoistej lizy oblicza się zgodnie z opisem w kroku 3.11 powyżej.</li>
<li>Przedstawiono dwa reprezentatywne wyniki (dodatni i ujemny) rozproszenia potencjału błony mitochondrialnej komórek beta opośredniczonego przez limfocyty T. Komórki są barwione, a reakcje rejestrowane zgodnie z opisem w krokach 4, 5 i 6 powyżej; pliki wideo są tworzone zgodnie z krokiem 7. Wideo 1: Linia komórek beta myszy NIT-1 została zabarwiona barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej TMRM (czerwony). Aktywowane, autoreaktywne limfocyty T CD8+ AI4 (zabarwione na zielono Picogreen) były współhodowane z tymi komórkami NIT-1 w stosunku E:T 50:1. Potencjał błony mitochondrialnej NIT-1 ulegał stopniowemu rozproszeniu w ciągu 400 minut, lecz tylko w skupiskach oddziałujących z limfocytami T AI4.
Wideo 2: W ramach eksperymentu kontrolnego komórki NIT-1 zabarwiono TMRM i współhodowano z komórkami Jurkat zabarwionymi Picogreen w stosunku E:T 50:1. Komórki Jurkat to ludzka linia limfocytów T niedopasowana pod względem MHC. Komórki NIT-1 zachowały potencjał błony mitochondrialnej przez cały 400-minutowy okres wspólnej inkubacji. Komórki Jurkat nie wchodziły w interakcje ze skupiskami NIT-1, a w konsekwencji nie indukowały ich śmierci.</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Wykres słupkowy stosunku efektorów do celu względem procentowej specyficznej lizy, przedstawiający aktywność komórek odpornościowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywny wynik testu CML z wykorzystaniem pierwotnych wysepek wyizolowanych z immunodeficientnych myszy NOD.Rag1-/- jako komórek docelowych oraz splenocytów z transgenicznych myszy NOD.AI4α/β. Komórki docelowe i efektory były współhodowane przez 16 godzin. Procent specyficznej lizy wzrasta wraz ze wzrostem stosunku efektorów do celu.
Wideo 1. Linia komórkowa beta mysia NIT-1 została zabarwiona barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej TMRM (czerwony). Aktywowane autoreaktywne limfocyty T CD8+ AI4 (zabarwione na zielono za pomocą Picogreen) współhodowano z komórkami NIT-1 w stosunku E:T wynoszącym 50:1. Potencjał błony mitochondrialnej komórek NIT-1 zanikał stopniowo w ciągu 400 minut, ale tylko w skupiskach oddziałujących z zielonymi limfocytami T AI4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>.
Wideo 2. Komórki NIT-1 barwiono w ten sam sposób, jak opisano w Wideo 1, a następnie hodowano w ko kulturze z linią komórkową ludzkich limfocytów T Jurkat barwioną PicoGreen. Komórki NIT-1 były w stanie utrzymać potencjał błony mitochondrialnej przez cały czas trwania eksperymentu wynoszący 400 minut. Komórki Jurkat nie wchodziły w interakcje z skupiskami NIT-1, w związku z czym nie indukowały ich śmierci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>.

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Florydy.

Śmierć komórek beta pośredniczona przez cytotoksyczne limfocyty T jest głównym mechanizmem patofizjologicznym T1D 5. Testy CML z wykorzystaniem uwalniania 51Cr pozwalają na badanie stopnia odpowiedzi efektorowej w relacji efektor-cel 6. Jednak szczegółowy proces i szlaki śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Ponieważ mitochondria są kluczowe dla funkcji i śmierci komórek beta7, skupiliśmy się na zmianach mitochondrialnych podcz...

<table><tbody><tr><td>Cr-51</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030500IMC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-60</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloestru rodaminy (TMRM)</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Picogreen</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>Mimotop AI4</td><td>mimotopes.com</td><td>sekwencja aminokwasowa: YFIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumin surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy MEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5303</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HeraCell 150i</td><td>Utrzymywany w warunkach sterylnych do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Forma 1440</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki do hodowli, 6x50 mm Lime Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-958-A</td><td></td></tr><tr><td>Licznik gamma</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>Wizard 1470 Automatic Gamma Counter</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 510 Meta Confocal</td><td>Z zmotoryzowanym stolikiem i komorą do żywych komórek</td></tr><tr><td>Pipeta (1ml, 200&amp;mu;l, 20&amp;mu;l, 10&amp;mu;l, 2&amp;mu;l)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki (bursztynowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50819772</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axioskop40</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NOD.Cg-Rag1&lt;sup&gt;tm1Mom&lt;/sup&gt; Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>004347</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NOD.Cg-Rag1&lt;sup&gt;tm1Mom&lt;/sup&gt; Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>004348</td><td></td></tr><tr><td>Myszy F1 NOD-AI4&amp;#945;/ &amp;#946;</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>Hodowane w zapleczu dla zwierząt UF</td></tr></tbody></table>

metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty t

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest autoimmunologiczną chorobą pośredniczoną przez limfocyty T. W przebiegu patogenezy u pacjentów postępuje insulinoopenia w wyniku utraty produkcji insuliny, co prawdopodobnie wynika z niszczenia komórek beta trzustki przez limfocyty T. Zrozumienie mechanizmów śmierci komórek beta podczas rozwoju T1D dostarczy wiedzy niezbędnej do opracowania skutecznej metody leczenia tej choroby. W testach limfocytotoksyczności komórkowej (CML) historycznie stosowano radionuklid chromu 51 (51Cr) do znakowania komórek docelowych. Następnie komórki docelowe są eksponowane na działanie komórek efektorowych, a uwalnianie 51Cr z komórek docelowych jest odczytywane jako wskaźnik śmierci komórek pośredniczonej przez limfocyty. Inhibitory śmierci komórkowej powodują zmniejszenie uwalniania 51Cr.
 Jako komórki efektorowe wykorzystano aktywowaną autoreaktywną populację klonalną CD8+ cytotoksycznych limfocytów T (CTL) wyizolowaną od myszy transgenicznej dla obu łańcuchów (alfa i beta) receptora TCR AI4. Aktywne limfocyty T AI4 współhodowano z komórkami docelowymi NIT znakowanymi 51Cr przez 16 godzin, a następnie rejestrowano uwalnianie 51Cr w celu obliczenia specyficznej lizy 
Mitochondria uczestniczą w wielu istotnych procesach fizjologicznych, takich jak produkcja energii, regulacja transdukcji sygnałowej oraz apoptoza. Badanie zmian funkcjonalnych mitochondriów w komórkach beta podczas rozwoju cukrzycy typu 1 (T1D) stanowi nowy obszar badań. Wykorzystując barwnik do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) oraz obrazowanie żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej, monitorowaliśmy potencjał błony mitochondrialnej w czasie w linii komórkowej komórek beta NIT-1. Na potrzeby badań obrazowych efektorowe limfocyty T AI4 zostały znakowane fluorescencyjnym barwnikiem do jąder komórkowych Picogreen. Komórki NIT-1 oraz limfocyty T hodowano wspólnie w komorowych szkiełkach nakrywkowych, które następnie umieszczono na stole mikroskopu wyposażonego w komorę do hodowli żywych komórek, z kontrolą temperatury 37°C, stężeniem 5% CO2 oraz odpowiednim nawilżeniem. Podczas tych eksperymentów obrazy każdego skupiska komórek były pobierane co 3 minuty przez 400 minut.
W ciągu 400 minut obserwowano zanik potencjału błony mitochondrialnej w skupiskach komórek NIT-1, do których przytwierdziły się limfocyty T AI4. W równoległym eksperymencie kontrolnym, w którym komórki NIT-1 współhodowano z ludzkimi limfocytami Jurkat o niedopasowanym MHC, potencjał błony mitochondrialnej pozostał nienaruszony. Technikę tę można wykorzystać do obserwacji zmian potencjału błony mitochondrialnej w czasie rzeczywistym w komórkach poddanych działaniu limfocytów cytotoksycznych, cytokin lub innych odczynników cytotoksycznych.

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest autoimmunologiczną chorobą zapośredniczoną przez limfocyty T. W przebiegu patogenezy u pacjentów postępuje niedobór insuliny, ponieważ insulina...

Cukrzyca typu pierwszego to choroba autoimmunologiczna, w której insulinowe komórki beta trzustki są niszczone przez autoreaktywne limfocyty T. Zrozumienie zaangażowanych w ten proces mechanizmów pozwoli na opracowanie skutecznej metody leczenia tej choroby. W niniejszym materiale zaprezentowano dwie metody obserwacji specyficznej destrukcji komórek beta trzustki w vitro, pośredniczonej przez limfocyty T CD8+: test cytotoksyczności limfocytowej (CML) oparty na chromie 51 oraz wizualny test CML.Komórki efektorowe T CD8+ są najpierw przygotowywane z śledzion ślimaka w celu przeprowadzenia testu CML. Komórki beta docelowe Knit 1 lub Knit 4 są znakowane chromem 51 i współhodowane z komórkami efektorowymi. Po śmierci komórek beta docelowych uwalniany jest chrom 51. Następnie zbiera się supernatanty oraz lizaty komórkowe i mierzy poziomy radioaktywności, które wskazują stopień śmierci komórek, przy użyciu licznika gamma. Aby przeprowadzić wizualny test CML, komórki beta docelowe Knit 1 i Knit 4 są znakowane barwnikiem potencjału mitochondrialnego TM RM, a komórki efektorowe są znakowane PicoGreen.Komórki łączy się i przeprowadza obrazowanie żywych komórek, aby zbadać tempo śmierci komórkowej wskazywane przez utratę potencjału błony mitochondrialnej. Główną zaletą tego testu w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu, jest możliwość obserwacji śmierci komórek beta w czasie rzeczywistym. Dodatkowe zalety obejmują możliwość określenia, czy śmierć komórek beta indukowana przez limfocyty T CD8 jest zależna od kontaktu; ponadto test ten można rozszerzyć o wskaźniki fluorescencyjne w celu zmapowania szlaków śmierci komórek beta.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy każdej choroby, w której rolę odgrywają cytotoksyczne limfocyty T. Zastosowanie tej techniki wykracza poza badanie mechanizmów i obejmuje terapię oraz potencjalnie diagnostykę, ponieważ funkcja mitochondriów jest niezbędna zarówno dla przeżycia, jak i fizjologii komórek beta. Procedurę tę zaprezentują Jing Chen i ja.Komórkami docelowymi wykorzystanymi w tym pokazie są linie komórek beta myszy, knit one oraz knit four; linia komórek limfocytów ludzkich Jurkat CD3+, która nie rozpoznaje i nie niszczy mysich komórek beta, służy jako kontrola negatywna. Efektorami wykorzystanymi w tym badaniu są autoreaktywne komórki T CD8+ uzyskane ze śledzion myszy NOD AI4 αβ F1 w wieku od trzech do czterech tygodni. Aby uzyskać te komórki, należy umieścić śledziony w szklanym homogenizatorze Dounce o pojemności 7 ml zawierającym 5 ml schłodzonego w lodzie HBSS. Homogenizować śledziony za pomocą homogenizatora Dounce, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej i wirować przy 250 G przez pięć minut. Po wirowaniu odrzucić supernatat, a następnie, aby usunąć erytrocyty, resuspender osad w 5 ml roztworu hipotonicznego na każdą śledzionę. Inkubować przez pięć minut w lodzie.Po inkubacji przemyj pellet komórkowy dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego HBSS w wirówce. Pomiędzy poszczególnymi przemyciami resuspenduj komórki w 10 mililitrach lodowatego HBSS. Następnie, używając komory hematometrycznej, policz komórki; po ustaleniu liczby komórek przejdź do kolejnego etapu.Ponownie odwiruj, a następnie resuspenduj komórki w uzupełnionym medium RPMI 1640 w zagęszczeniu 5 × 10⁶ komórek/ml; wysiej komórki w zagęszczeniu 5 × 10⁶/ml w kolbie T 75. Na koniec, aby aktywować komórki, dodaj do kolby AI4 myope oraz IL-2 w końcowych stężeniach odpowiednio 0,1 µM i 25 jednostek/ml; inkubuj kolbę w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez trzy dni. Aktywowane komórki można teraz wykorzystać do testu CML opartego na ACROMIUM 51 lub do wizualnego testu CML.Przedstawiony test cytotoksyczności limfocytowej zależnej od komórek (assay CML) wykorzystuje uwalnianie chromu 51 z komórek docelowych jako wskaźnik śmierci komórek beta pośredniczonej przez CD8. Aby oznakować chromem 51 docelowe komórki beta MIN1 lub MIN4, należy najpierw wysiać je z gęstością 5 × 10⁴ komórek na dołek płytki 96-dołkowej w 200 µL uzupełnionej pożywki DMEM; inkubować przy 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Następnego dnia rozcieńczyć chrom 51 w uzupełnionej pożywce DMEM do stężenia 1 µCi na 20 µL.Następnie do każdej studni zawierającej docelowe komórki beta dodaj 20 µL rozcieńczonego chromu 51, aby uzyskać stężenie 1 µCi na studnię. Płytkę umieść w inkubatorze z nawilżaną atmosferą w temperaturze 37 °C i 5%CO2, a następnie inkubuj przez trzy godziny. Odsącz medium i przemyj komórki trzy razy świeżym medium hodowlanym.Następnie dodaj pożywkę do aktywowanych efektorowych komórek CD8+, tak aby końcowa objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 200 µL. Połącz efektory z kulturami docelowych komórek beta w wybranych stosunkach E:T; do przygotowania kontroli spontanicznej lizy zastosowano stosunki 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 oraz 0,25:1. Do sześciu studni z docelowymi komórkami beta dodaj świeżą pożywkę.Następnie umieść płytkę w inkubatorze i prowadź kokulturę komórek efektorowych oraz docelowych przez 16 godzin. Następnego dnia za pomocą pipety wielokanałowej przenieś nadsącz do sześciu probówek szklanych o rozmiarze 50 mm. Następnie, aby zlizować komórki, dodaj do płytki 100 µL 2% SDS i delikatnie pipetuj w górę i w dół kilka razy.Przenieś lizat komórkowy do nowego zestawu sześciu probówek szklanych o pojemności 50 ml. Następnie, aby upewnić się, że cały lizat komórkowy został zebrany, pipetuj w górę i w dół 100 µL sterylnej wody w każdej studni i dodaj ją do probówek z lizatem komórkowym, aby określić stopień destrukcji komórek beta. Po wykonaniu pomiarów zmierz radioaktywność w supernatancie i lizacie za pomocą licznika gamma.Wyznacz specyficzną lizę, odejmując procent liczby zliczeń w nadnadkładach kontrolnych lizy spontanicznej od procentu zliczeń w nadnadkładach eksperymentalnych, zgodnie z przedstawionym równaniem. W celu zbadania śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T w czasie rzeczywistym, potencjał błony mitochondrialnej jest monitorowany za pomocą obrazowania żywych komórek w kokulturach komórek docelowych i efektorowych.W celu przygotowania do mikroskopii, komórki beta docelowe wysiano na zmodyfikowane i wysterylizowane szkiełka podstawowe z ośmioma komorami w zagęszczeniu 5 × 10⁴ komórek na dołek. Szkiełka umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂, pozostawiając komórki do wzrostu na 48 godzin. W dniu eksperymentu dodano barwnik potencjału błony mitochondrialnej tetrametyloetylorubinę (TMRM) w stężeniu 25 nM w suplementowanym medium DMEM bez czerwieni fenolowej i inkubowano przez 30 minut.Po zabarwieniu komórek TMRM, należy zastąpić medium świeżym medium zawierającym 5 nM TMRM, aby utrzymać równowagny rozkład barwnika. Następnie należy policzyć aktywowane efektorowe limfocyty T CD4 lub kontrolne limfocyty T typu naive za pomocą hemocytometru, a następnie zawiesić komórki w uzupełnionym DMEM bez czerwieni fenolowej w probówkach stożkowych o pojemności 15 ml w odpowiednim stężeniu. Następnie należy dodać PicoGreen do aktywowanych komórek efektorowych lub kontrolnych komórek T do stężenia końcowego 1 µL/mL.Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, a następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej po zakończeniu inkubacji. Przemyj komórki trzykrotnie, dodając DMEM bez czerwieni fenolowej, mieszając krótko i wirując przy 250 GS przez pięć minut. Aby zebrać komórki do obrazowania, umieść szkiełko z komorą na stoliku mikroskopu konfokalnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik oraz nawilżaną komorę do obrazowania żywych komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Dodaj aktywowane komórki efektorowe barwione PicoGreen do komór w stosunku efektorów do komórek docelowych (ET), który ma zostać w tym przypadku oceniony. Obrazowany stosunek ET wyniesie 50:1; skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania tak, aby zbierać obrazy z czterech studzienek, w trzech lokalizacjach w każdej, co trzy minuty, przy 300 klatkach na lokalizację i ekscytacji przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla TMRM i PicoGreen. Po zebraniu wszystkich obrazów należy je przekonwertować w celu publikacji.Oprogramowanie Fiji i Image J wykorzystano wraz z wtyczką bio-formats z loci. Więcej szczegółów dotyczących konwersji wideo znajduje się w towarzyszącym tekście pisanym. Przeprowadzono test cytotoksyczności limfocytów zależnej od komórek lub test CML z wykorzystaniem chromu 51, zgodnie z opisem w tym filmie.Jak pokazano tutaj, procent specyficznej lizy na osi Y wzrasta wraz ze wzrostem stosunku efektorów do komórek docelowych na osi X. Aby ocenić śmierć komórek za pomocą obrazowania żywych komórek, linię komórkową beta myszy knit one barwiono barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej TMRM, widocznym na czerwono. Aktywowane autoreaktywne komórki T I four CD eight positive barwiono na zielono za pomocą pico green, a oba typy komórek współhodowano w stosunku E do T wynoszącym 50 do 1, co widać tutaj. Potencjał błony mitochondrialnej knit one zanikał stopniowo w ciągu 400 minut, ale tylko w skupiskach oddziałujących z zielonymi komórkami T AI four. W ramach eksperymentu kontrolnego barwione komórki knit one hodowano zamiast tego z barwionymi pico green ludzkimi komórkami T jerk at z niedopasowanym MHC, co widać tutaj.Komórki typu knit one były w stanie utrzymać potencjał błony mitochondrialnej przez cały czas trwania procedury wynoszący 400 minut. Komórki typu circuit nie wchodziły w interakcje z klastrami knit one, a w konsekwencji nie indukowały śmierci komórek. Po opanowaniu techniki.Technika ta zajmuje około pięciu dni, wliczając w to przygotowanie komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak zmienia się potencjał błonowy komórek beta podczas ataku autoreaktywnych limfocytów T. Pamiętaj, że praca z radioizotopami może być niebezpieczna, dlatego przed wykonaniem tej procedury należy przejść odpowiednie szkolenie i podjąć niezbędne środki ostrożności.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T cytotoksyczne

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Film prezentuje test oparty na cytometrii przepływowej do oznaczania dominacji immunologicznej w cytotoksycznych limfocytach T lub odpowiedziach CTL. Wstrzyknięte fluorescencyjne komórki docelowe wykazują różną fluorescencję odpowiadającą epitopom immunogennym. Pobranie i sortowanie po śledzionie ujawnia zmniejszenie liczby komórek fluorescencyjnych o wysokiej intensywności, co potwierdza dominację immunologiczną w odpowiedziach CTL.

Test do oceny immunodominacji w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T

Ten film demonstruje metodę opartą na obrazowaniu, aby zwizualizować przeszczepione komórki beta z ekspresją lucyferazy do nieotyłej myszy z cukrzycą z niedoborem odporności. Wprowadzenie splenocytów od myszy z cukrzycą prowadzi do postępującego niszczenia komórek beta, co jest wizualnie potwierdzone spadkiem luminescencji po wprowadzeniu substratu.

Obrazowanie transgenicznych komórek beta u myszy z niedoborem odporności i prowokacją ze splenocytami cukrzycowymi

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Poznaj dwie metody oceny cytotoksyczności limfocytów T CD8+ wobec komórek beta trzustki: test uwalniania chromu 51 oraz obrazowanie żywych komórek z barwnikiem potencjału mitochondrialnego.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Przeglądaj więcej filmów