Metody oceny śmierci komórek beta za pośrednictwem cytotoksycznych limfocytów T

Cukrzyca typu pierwszego jest chorobą autoimmunologiczną, w której komórki beta trzustki wydzielające insulinę są niszczone przez autoreaktywne limfocyty T. Zrozumienie mechanizmów związanych z tą chorobą dostarczy informacji, które pozwolą na opracowanie skutecznego leku na tę chorobę. Tutaj pokazano dwie metody obserwacji specyficznego cd eight dodatnich limfocytów T niszczenia komórek beta trzustki in vitro: test cytotoksyczności limfatycznej za pośrednictwem komórek chromu 51 lub CML oraz wizualny test CML dla obu metod.

CD osiem dodatnich komórek efektorowych T jest najpierw przygotowywanych do śledzenia myszy w celu wykonania testu CML, dzianiny jednej lub dzianiny czterech docelowych komórek beta jest znakowanych chromem 51 i współhodowanych z komórkami efektorowymi. Kiedy docelowe komórki beta są zabijane, uwalniany jest chrom 51. Supernatanty i lizaty komórkowe są następnie zbierane, a poziomy radioaktywności, które wskazują na zakres śmierci komórki, są mierzone za pomocą licznika gamma w celu wykonania wizualnego testu CML Dzianina jedna i dzianina czwarta Docelowe komórki beta są znakowane barwnikiem potencjału mitochondrialnego TM Komórki efektorowe RM są znakowane kolorem piko zielonym.

Komórki są łączone i wykonuje się obrazowanie żywych komórek w celu zbadania szybkości śmierci komórki wskazanej przez rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej. Główną zaletą tego testu w porównaniu z tradycyjnymi testami, takimi jak test uwalniania chromu, jest to, że możemy obserwować śmierć komórek beta w czasie rzeczywistym. Dodatkowe zalety obejmują możliwość określenia, czy śmierć komórek beta za pośrednictwem limfocytów T CD jest zależna od kontaktu, a także test ten można rozszerzyć za pomocą wskaźników fluorescencyjnych do mapowania ścieżek śmierci komórek beta.

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy każdej choroby, w której rolę odgrywają cytotoksyczne limfocyty T. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i ewentualnie diagnozę, ponieważ funkcja mitochondriów jest niezbędna zarówno dla przetrwania komórek beta, jak i fizjologii. Jing Chen i ja zademonstrujemy tę procedurę.

Komórkami docelowymi użytymi w tej demonstracji są mysie linie komórkowe beta, dziergane jedna i czwarta, szarpnięcie CD trzy plus ludzka linia komórkowa limfocytów, która nie rozpoznaje i nie zabija mysich komórek beta, jest używana jako kontrola negatywna zastosowanych skutecznych komórek. Oto autoreaktywne CD osiem dodatnich limfocytów T uzyskanych ze śledziony trzy- do czterotygodniowych myszy typu nod AI czterech myszy alfa beta F1 w celu uzyskania komórek zacznij od umieszczenia śledziony w siedmiomililitrowym homogenizatorze szklanym zawierającym pięć mililitrów lodowatego HBSS, homogenizuj śledziony za pomocą homogenizatora Downsa, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki i odwiruj przy 250 G przez pięć minut po wirowaniu, Wyrzuć SNAT Następnie, aby usunąć czerwone krwinki, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach roztworu hipotonicznego na śledzionę. Inkubować przez pięć minut na lodzie.

Po inkubacji przemyć osad komórkowy dwukrotnie 10 mililitrami lodowatej wirówki HBSS. Zawiesina komórek między każdym praniem ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach lodowatego HBSS. Następnie za pomocą hemocytometru zlicz komórki po ustaleniu liczby komórek.

Ponownie odwirować, a następnie ponownie zawiesić komórki i uzupełnić RPMI 1640 o gęstości pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr komórek nasiennych o gęstości pięć razy 10 do sześciu na mililitr w kolbie T 75. Na koniec, aby aktywować komórki, dodaj AI cztery krótkowzroczność i IL dwa do kolby w końcowych stężeniach odpowiednio 0,1 mikromola i 25 jednostek na mililitr, inkubuj kolbę w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. Aktywowane komórki mogą być teraz wykorzystane do testu CML opartego na ACROMIUM 51 lub wizualnego testu CML.

Test cytotoksyczności limfatycznej za pośrednictwem komórek lub CML wykorzystuje tutaj uwalnianie chromu 51 z komórek docelowych jako wskaźnik śmierci komórki beta za pośrednictwem CD eight. Aby oznaczyć jedną lub cztery docelowe komórki beta chromem 51, zacznij od wysiewu ich o gęstości pięć razy 10 do czwartej komórki na dołek 96-dołkowej płytki w 200 mikrolitrach uzupełnionego DM E EMM inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 przez 24 godziny. Następnego dnia rozcieńczyć chrom 51 i uzupełnić DMEM do stężenia jednego mikrokiuru na 20 mikrolitrów.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonego chromu 51 do każdej studzienki zawierającej docelowe komórki beta, aby uzyskać jeden mikrokiur na studzienkę. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i inkubuj przez trzy godziny po inkubacji. Odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki świeżą pożywką hodowlaną.

Następnie dodaj pożywkę do aktywowanej płyty CD ośmiu dodatnich komórek efektorowych, tak aby końcowa objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 200 mikrolitrów. Połącz efektor w docelowych hodowlach komórek beta w pożądanych proporcjach E do T, tutaj stosuje się proporcje 20 do jednego, 10 do jednego, pięć do jednego, dwa do jednego, jeden do jednego i 0,25 do jednego do jednego do przygotowania spontanicznych kontroli lizy. Dodaj świeżą pożywkę do sześciu dołków docelowych komórek beta.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze i kokulturze efektorowej oraz komórek docelowych na 16 godzin. Następnego dnia użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść supernatant do sześciokrotnie 50-milimetrowych probówek ze szkła wapiennego. Następnie przetrzyj komórki w ilości stu mikrolitrów 2% SDS na płytkę i delikatnie pipetuj kilka razy w górę iw dół.

Przenieś lizat komórkowy do nowego zestawu sześciokrotnie 50-milimetrowych probówek ze szkła wapiennego. Następnie, aby upewnić się, że cały lizat komórkowy jest zbierany w stu mikrolitrach sterylnej wody do każdej studzienki, pipetuj w górę iw dół i dodaj go do probówek lizatu komórkowego, aby określić stopień zniszczenia komórek beta. Zmierzyć radioaktywność w supernatencie i lizacie za pomocą licznika gamma po wykonaniu obliczeń.

Określić specyficzną lizę, odejmując procent zliczeń w spontanicznych supernatantach kontrolnych lizy od procentu zliczeń w supernatantach eksperymentalnych, jak pokazano w tym równaniu. Badanie śmierci komórek beta za pośrednictwem limfocytów T w czasie rzeczywistym. Potencjał błony mitochondrialnej jest monitorowany za pomocą obrazowania żywych komórek docelowych i efektorowych kultur koaktywnych.

Aby przygotować się do mikroskopii, zobacz docelowe komórki beta na zmodyfikowanych i wysterylizowanych ośmiu dobrze komorowych szkiełkach nakrywkowych pięć razy 10 czwartych komórek. Dobrze umieść szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 i pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin. W dniu eksperymentu dodać mitochondrialny barwnik potencjału błonowego tetraetylu estru metylowego żawki tetraetylowej TMRM o stężeniu 25 nanomolowych i inkubować DM EM bez zawartości czerwieni fenolowej przez 30 minut.

Po zabarwieniu komórek za pomocą TMRM zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą pięć nanomolowych TM RM, aby utrzymać równowagę rozkładu barwnika. Następnie policz aktywowany efektor AI cztery limfocyty T lub kontroluj szarpnięcie komórek za pomocą hemocytometru, ponownie zawieś komórki w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej w 15-mililitrowych stożkowych probówkach o odpowiednim stężeniu. Następnie dodaj pico green do aktywowanych komórek efektorowych lub szarpnij komórki kontrolne do końcowego stężenia jednego mikrolitra na mililitr.

Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, a następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej po inkubacji. Umyj komórki trzykrotnie, dodając krótko DMEM wolny od czerwieni fenolowej i odwirowując w temperaturze 250 GS przez pięć minut. Aby zebrać komórki do obrazowania, umieść szkiełko komory na stoliku mikroskopu konfokalnego wyposażonego w stolik z napędem i nawilżoną komorę do obrazowania żywych komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Dodać aktywowane komórki efektorowe zabarwione na zielono pico do komór w stosunku efektora do celu, który ma być tutaj oceniony. Zobrazowany stosunek ET będzie wynosił 50 do jednego, skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania, aby zbierać obrazy w czterech studniach z trzema lokalizacjami co trzy minuty z 300 klatkami na lokalizację i ekscytacją przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla TMRM i Pico Green. Po zebraniu wszystkich obrazów należy je przekonwertować do publikacji tutaj.

Fiji i Image J są używane z wtyczką formatów biograficznych od loci. Więcej szczegółów na temat konwersji wideo można znaleźć w załączonym tekście pisemnym. Test cytotoksyczności limfatycznej za pośrednictwem komórek lub CML przeprowadzono przy użyciu chromu 51, jak opisano w tym filmie.

Jak pokazano tutaj, procentowa specyficzna liza pokazana na osi Y wzrasta wraz ze wzrostem stosunku efektora do celu pokazanego na osi x w celu oceny śmierci komórki za pomocą obrazowania żywych komórek, mysia linia komórek beta dzianina jedna została wybarwiona mitochondrialnym barwnikiem potencjału błony TMRM pokazanym na czerwono aktywowanym autoreaktywnie I cztery CD osiem dodatnich komórek T pozostawało zielonych z zielenią piko, a dwa typy komórek były hodowane wspólnie przy stosunku E do T wynoszącym 50 do jednego, jak widać tutaj. Na drutach jeden potencjał błony mitochondrialnej rozpraszał się stopniowo w ciągu 400 minut, ale tylko w klastrach, w których wchodzimy w interakcję z zielonymi komórkami T AI w ramach eksperymentu kontrolnego. Barwione dzianinowe komórki jednokomórkowe były zamiast tego hodowane z pico greens barwionymi MHC niedopasowanymi ludzkimi szarpnięciami w komórkach T, jak widać tutaj.

Dziane komórki były w stanie utrzymać potencjał błony mitochondrialnej przez 400 minut. Komórki obwodów nie wchodziły w interakcje z klastrami dzianiny i dlatego nie indukowały zabijania. Raz opanowane.

Ta technika trwa około pięciu dni, łącznie z przygotowaniem komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmienia się potencjał błony komórkowej beta, gdy jest atakowany przez autoreaktywną komórkę T. Nie zapominaj, że praca z izotopami promieniotwórczymi może być niebezpieczna i należy przejść odpowiednie szkolenie oraz podjąć środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.