Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybkie generowanie pochodzących od dawcy wirusowo-specyficznych limfocytów T cytotoksycznych lub CTL, które nadają się do transferu adopcyjnego u biorców allogenicznego przeszczepienia komórek macierzystych krwiwłochotwórczych lub HSCT. Osiąga się to poprzez najpierw nuklefekcję komórek dendrytycznych lub dcs plazmidami kodującymi antygeny wirusowe, aby przygotować komórki do prezentacji antygenu. W drugim kroku nuklefekowane dcs są wykorzystywane do stymulacji antygenowo-specyficznych limfocytów T, które następnie są namnażane w obecności IL-4 i IL-7 w gazoprzepuszczalnym urządzeniu hodowlanym zwanym GASP.

Następnie, po siedmiu dniach hodowli, komórki są pasażowane i wysiewane, a pożywka jest uzupełniana w celu utrzymania maksymalnej ekspansji CTL in vitro. W końcu, w dniu 12., komórki są zbierane i testowane pod kątem czystości, aktywności oraz bezpieczeństwa, a następnie krio konserwowane do późniejszego zastosowania klinicznego. W rezultacie można wygenerować linie CTL o wielowirusowej swoistości i minimalnej reaktywności allogenicznej, co potwierdzają barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, produkcja interferonu gamma oraz cytotoksyczność.

Wytwarzanie linii cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla wielu wirusów jest czasochłonne i uciążliwe. Wymaga ono zastosowania linii komórek B transformowanych wirusem EBV oraz wektorów adenowirusowych, a cała procedura trwa około trzech miesięcy. Nasza nowa metoda nie wykorzystuje wektorów wirusowych.

Komórki rosną w hodowli wykładniczo przy minimalnej utracie komórek, dzięki czemu procedura jest szybka i kosztowo efektywna. Procedurę tę prezentuje Eureka Gerdeman, stażysta kliniczny w laboratorium. Pozyskaj dcs pochodzące z monocytów, które zostały wygenerowane w pożywce Cellgenic uzupełnionej o IL-4 i G-M-CSF, a następnie dojrzewały przez 24 godziny w cytokinach dojrzewania, poprzez delikatne resuspensowanie za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml. Użyj błękitu trypanowego do policzenia dcs, a następnie przenieś je do trzech probówek o pojemności 15 ml, tak aby w każdej probówce znalazło się nie mniej niż 0,5 × 10⁶ i nie więcej niż 2 × 10⁶ komórek.

Następnie odwiruj DCS przez 10 minut przy 200 ×g. W tym czasie przygotuj 6 mL pożywki cell genix uzupełnionej o ten sam koktajl cytokin do dojrzewania DC co poprzednio i nlej po 2 mL do trzech dołków 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej; niewykorzystane dołki wypełnij 2 mL sterylnej wody. Przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu wstępnego ogrzania.

Po zakończeniu wirowania komórek odessać nadsączki i dodać odpowiednie plazmidy DNA do każdej probówki, tak aby końcowe stężenie wynosiło 5 µg DNA na probówkę. W tym przypadku do probówki nr 1 dodaje się plazmid kodujący IE1 pp65, do probówki nr 2 hcp5, a do probówki nr 3 EBNA1 LMP2 BZLF1. Resuspender komórki i DNA w 100 µL roztworu do nukleofekcji.

Dokładnie wymieszać i przenieść mieszaninę do kuwet do nukleofekcji Nucleofector. Umieścić kuwety w urządzeniu Nucleofector 4D. Wybrać program CB 150 i nacisnąć start natychmiast po nukleofekcji.

Do każdej probówki z zawiesiną komórek dodać 500 µL podgrzanego medium do dojrzewania CELLGENIC DC, wymieszać komórki, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół dwa do trzech razy, a następnie przenieść zainfekowane nukleazycznie DC do przygotowanej płytki 12-dołkowej zawierającej pozostałe 1,5 mL podgrzanego medium do dojrzewania DC. Płytkę przenieść do inkubatora na kolejne 12 do 18 godzin, po czym zebrać, policzyć i naświetlać zainfekowane nukleazycznie DC. Komórki przemyć raz 10 mL medium CTL, a następnie resuspender w stężeniu 3 × 10⁵ DC/mL medium. Z trzech infekcji nukleazycznych zebrać łącznie minimum 7,5 × 10⁵ (2,5 mL) i maksimum 15 × 10⁵ (5 mL) DC, a następnie przenieść połączone, przetransfekowane plazmidowo DC do urządzenia G Rex.

Następnie umieść urządzenie w inkubatorze w celu przygotowania komórek odpowiadających. Wykorzystaj nieadherentne komórki mononuklearne pozostałe po selekcji DC. Przenieś komórki odpowiadające do podgrzanego wcześniej roztworu hodowlanego.

Przemyć je raz podłożem CTL media reus. Zawiesić komórki w podłożu CTL media. Policzyć komórki i doprowadzić je do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml.

Pobrać 15 × 10⁶ komórek lub 7,5 ml i uzupełnić cytokinami IL-4 oraz IL-7. Przenieść 7,5 ml PBMC do G-Rex i dopełnić bioreaktor pożywką do CTL do całkowitej objętości 30 ml. Na koniec umieścić G-Rex w inkubatorze na sześć do siedmiu dni; w szóstym lub siódmym dniu odessać 10 ml pożywki.

Następnie wymieszać pozostałe 20 milliliters pożywki za pomocą pipety 10 milliliter. W przypadku, gdy liczba komórek jest mniejsza niż 50 × 10⁶, zastosować błękit trypanu w celu ich policzenia. Uzupełnić kulturę świeżą pożywką oraz cytokinami.

Jeśli liczba komórek przekracza 50 × 10⁶, należy odjąć 10 ml zawiesiny komórkowej, przenieść komórki do nowego naczynia G rex, a następnie zasilić oba naczynia G rex świeżą pożywką CTL i cytokinami; komórki należy hodować przez kolejne cztery do sześciu dni, aby zwiększyć ich liczbę do poziomu wystarczającego do zbioru i policzenia. Następnie komórki, które nie zostaną wykorzystane do analiz fenotypowych lub funkcjonalnych, należy kriozachować do późniejszego użycia. Reprezentatywne wyniki wykazują, że multicytoniczne plazmidy DNA indukują specyficzne dla wielu wirusów limfocyty T, co zmierzono za pomocą testu ELISpot dla interferonu gamma, a częstotliwość komórek reaktywnych jest wyższa niż w przypadku linii generowanych przy użyciu konwencjonalnych plazmidów PHU wykazujących te same antygeny.

Optymalny stosunek DC do PBMC jest istotny dla silnej stymulacji limfocytów T, co pokazano na tej rycinie, gdzie stosunek 1:50 daje suboptimalną reaktywację w porównaniu do stosunku stymulatora do respondenta 1:20. Hodowla CTL w systemie G rex, przedstawiona na tej rycinie, zapewnia lepszą ekspansję limfocytów T w porównaniu z konwencjonalnymi płytkami 24-dołkowymi. Dodanie IL-4 i IL-7 do hodowli zwiększa repertuar i specyficzność rozszerzonych komórek, co pokazano tutaj, oceniając częstotliwość limfocytów T reaktywnych przeciwko peptydowi NLV pochodzącemu z CMV PP65 z ograniczeniem do HLA-A2 w hodowlach generowanych w obecności lub nieobecności IL-4 i/lub IL-7. Ta rycina przedstawia reprezentatywną próbkę fenotypu szybko rozszerzonych wielowirusowych CTL, które są poliklonalne i stanowią mieszaninę limfocytów T CD4+ oraz CD8+, z których większość wykazuje markery pamięci CD45RO i CD62L. Rozszerzone CTL są specyficzne dla wszystkich antygenów stymulujących i są polifunkcyjne, co oceniono tutaj za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w celu wykrycia produkcji interferonu gamma i TNF-alpha po stymulacji antygenem, ocenionej za pomocą testu uwalniania chromu.

Ekspandowane limfocyty CTL są w stanie specyficznie eliminować cele wirusowe, nie wykazując przy tym niespecyficznej aktywności przeciwko celom z niedopasowaniem HLA, co jest kluczowym aspektem bezpieczeństwa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko wytwarzać linie cytotoksycznych limfocytów T swoistych dla wielu wirusów, które są zgodne z normami GNP i nadają się do transferu adopcyjnego u pacjentów z chorobami związanymi z wirusami. Uproszczenie tej procedury powinno ułatwić jej wdrożenie poza specjalistycznymi zakładami produkcyjnymi i sprawić, że stanie się ona standardem opieki dla pacjentów z niedoborami odporności, którzy są szczególnie podatni na choroby związane z wirusami.