Name: Wytwarzanie wielowirusowych limfocytów T w celu zapobiegania/leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj szybką metodę wytwarzania wielowirusowych limfocytów T cytotoksycznych po allogenicznym przeszczepie komórek macierzystych. Protokół zgodny z GMP umożliwia ekspansję komórek w bioreaktorze G-Rex z minimalną aloreaktywnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta jest wspierana przez program Production Assistance for Cellular Therapies (kontrakt NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (C.M.R.), grant Specialized Centers for Cell-based Therapy NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (C.M.R.), nagrodę ASBMT Young Investigator Award (U.G. i J.V.), nagrodę Leukemia and Lymphoma Society Special Fellow in Clinical Research Award (U.G.) oraz nagrodę Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (A.M.L).

1. Nukleofekcja komórek DC
<ol>
<li>Zebrać komórki DC pochodzące z monocytów, które zostały wzbogacone poprzez adhezję do plastiku, hodowane przez 5 dni w pożywce Cell Genix uzupełnionej o IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) i dodatkowo dojrzewane przez 24h przy użyciu cytokin dojrzewania DC: IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml oraz PGE2 (1μg/ml)1, poprzez delikatne resuspensowanie za pomocą pipety transferowej 3ml.</li> 
<li>Policzyć żywe komórki DC przy użyciu błękitu trypanu, a następnie przenieść je do trzech probówek 15ml, tak aby w każdej probówce znalazło się nie mniej niż 0,5x106 i nie więcej niż 2x106 komórek/probówkę.</li>
<li>Wirować komórki DC przez 10min przy 200g. W tym czasie wstępnie ogrzać pożywkę Cell Genix uzupełnioną o cytokiny dojrzewania DC (pożywka dojrzewania DC) – 2ml/dołek w trzech dołkach płytki 12-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek w inkubatorze 37°C/5% CO2.</li> 
<li>Po zakończeniu wirowania odessać nadosad i dodać odpowiednie plazmidy DNA do każdej z probówek w końcowym stężeniu 5μg DNA/probówkę. W tym przypadku dodać plazmid kodujący IE1-pp65 do probówki nr 1, Hexon-Penton do probówki nr 2 oraz EBNA1-LMP2-BZLF1 do probówki nr 3.</li>
<li>Resuspender komórki DC i DNA w 100μl roztworu do nukleofekcji Amaxa, dobrze wymieszać i przenieść do kuwet do nukleofekcji.</li>
<li>Umieścić kuwety w nukleofektorze 4D, wybrać program CB150 (Amaxa/Lonza) i nacisnąć start.</li>
<li>Natychmiast po nukleofekcji dodać 500μl z 2ml wstępnie ogrzanej pożywki dojrzewania DC Cell Genix do kuwety, delikatnie wymieszać poprzez 2-3 krotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść nukleofektowane komórki DC na przygotowaną płytkę 12-dołkową zawierającą pozostałe 1,5 ml wstępnie ogrzanej pożywki dojrzewania DC. Przenieść do inkubatora 37°C/5% CO2 na kolejne 12-18h.</li>
</ol>
2. Stymulacja limfocytów T
<ol>
<li>Zebrać i policzyć nukleofektowane komórki DC, a następnie napromieniować dawką 30Gy. Przemyć raz 10ml pożywki CTL (45% RPMI, 45% Clicks EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) i resuspender w stężeniu 3 x 105 komórek DC na ml pożywki CTL.</li> 
<li>Połączyć minimum 7,5x105 (2,5ml) i maksimum 15x105 (5ml) komórek DC zawierających każdy z plazmidów, a następnie przenieść połączone komórki DC do urządzenia G-Rex, które zostanie umieszczone w inkubatorze.</li>
<li>Do przygotowania komórek responderów użyć wcześniej zamrożonych PBMC lub nieprzylegających komórek mononuklearnych pozostałych po selekcji DC (selekcja przez adhezję lub CD14). Rozmrozić komórki, przenieść do uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej i przemyć raz pożywką CTL. Resuspender komórki w pożywce CTL, policzyć je i doprowadzić do stężenia 2x106 komórek na ml. Odmierzyć 15x106 komórek (7,5ml) i uzupełnić o 30000U IL4 (stężenie końcowe 1000U/ml) oraz 300ng IL7 (stężenie końcowe 10ng/ml).</li>
<li>Przenieść 7,5ml PBMC (15x106 komórek) do urządzenia G-Rex i uzupełnić bioreaktor pożywką CTL do całkowitej objętości 30ml.</li> 
<li>Inkubować urządzenie G-Rex przez 6-7 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Ekspansja limfocytów T
<ol>
<li>W dniu 6-7 odessać 10ml pożywki, następnie wymieszać komórki w pozostałych 20ml pożywki za pomocą pipety 10ml i policzyć żywe komórki przy użyciu błękitu trypanu. Jeśli liczba komórek wynosi &lt;50x106, uzupełnić świeżą pożywką + cytokinami. Jeśli liczba komórek wynosi &gt;50x106, odessać 10ml zawiesiny komórkowej, przenieść do nowego G-Rex, a następnie zasilić oba G-Rex świeżą pożywką CTL + cytokinami.</li>
<li>Kulturować przez kolejne 4-6 dni. Po namnożeniu odpowiedniej liczby komórek przeprowadzić charakterystykę fenotypową i funkcjonalną CTL oraz kriokonserwować nadmiar komórek do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
Schemat naszego zatwierdzonego przez FDA procesu generowania CTL specyficznych dla wielu wirusów przedstawiono na Rysunku 1. W przeciwieństwie do konwencjonalnych protokołów CTL dla wielu wirusów, w których do stymulacji limfocytów T reaktywnych na wirusy wykorzystuje się adenowektory i EBV-LCL2, zastąpiliśmy materiał wirusowy zakaźny plazmidami DNA kodującymi wiele antygenów pochodzących z każdego z wirusów3. Aby stymulować CTL przeciwko trzem wirusom, zaprojektowaliśmy trzy plazmidy wielocistronowe kodujące Hexon i Penton adenowirusa, IE1 i pp65 CMV oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 EBV. Antygeny te wybrano w oparciu o obiecujące wyniki kliniczne uzyskane przez naszą oraz inne grupy, wykazujące, że limfocyty T skierowane przeciwko Adv-hexon i penton2,4-6, a także przeciwko CMV-1E1 i CMV-pp65, wykazują działanie ochronne in vivo7. W przypadku EBV, EBNA1 jest immunodominującym antygenem docelowym dla limfocytów T CD4+, eksprymowanym we wszystkich nowotworach związanych z EBV oraz w prawidłowych zainfekowanych EBV limfocytach B8,9, LMP2 jest immunogenny dla wielu typów HLA i eksprymowany w większości nowotworów wywołanych przez EBV10,11, natomiast BZLF1 koduje immunodominujący antygen wczesny cyklu litycznego, który stymuluje limfocyty T CD4+ i CD8+ u większości osób i jest prawdopodobnie istotny dla kontroli komórek replikujących wirusa12. W celu dalszej optymalizacji naszych metod wytwarzania nawiązaliśmy współpracę z Nature Technology, która opracowała zminimalizowane, wolne od antybiotyków (zgodne z wymogami FDA) plazmidy do stymulacji CTL13,14. Stosując tę strategię, konsekwentnie osiągamy wydajność nukleofekcji &gt;35%, zachowując jednocześnie wysoką żywotność komórek (dane nie pokazano)3. Rysunek 2 pokazuje, że częstotliwość występowania limfocytów T specyficznych dla wirusów w odpowiedzi na zoptymalizowane plazmidy DNA, zmierzona za pomocą testu IFNγ ELIspot, była większa niż w odpowiedzi na konwencjonalne plazmidy ekspresyjne oparte na pShuttle ekspresujące te same antygeny (n=8 Adenowirus, n=4 CMV i n=2 EBV). Optymalny stosunek DC:PBMC był istotny dla silnej stymulacji limfocytów T, co pokazano na Rysunku 3, gdzie stosunek 1:50 spowodował suboptymalną aktywację w porównaniu ze stosunkiem S:R 1:20 (n=2 dawców). Produkcja wystarczającej liczby CTL o szerokiej swoistości antygenowej jest warunkiem wstępnym skuteczności klinicznej przeciwko wszystkim trzem wirusom. Osiąga się to poprzez hodowlę CTL w systemie G-Rex, który zapewnia lepszą ekspansję limfocytów T w porównaniu z konwencjonalnymi płytkami 24-dołkowymi (Rysunek 4A)15, podczas gdy dodanie IL4 i IL7 do kultur zwiększa repertuar i specyficzność, co pokazano na Rysunku 4B, gdzie oceniono częstotliwość limfocytów T reaktywnych przeciwko peptydowi NLV pochodzącemu z CMV-pp65, ograniczonemu do HLA-A2, w kulturach generowanych w obecności lub nieobecności IL4 i/lub IL716,17. Aby ocenić fenotyp i zdolność funkcjonalną rozszerzonych komórek, przeprowadzamy analizę cytometryczną, wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin/IFNγ ELIspot oraz testy uwalniania Cr51 na produkcie końcowym przeznaczonym do kriosprzechowywania/infuzji. Zazwyczaj generowane komórki są poliklonalne, z mieszaną populacją limfocytów T CD4+ i CD8+ ze swoistością antygenową wykrywalną w obu przedziałach limfocytów T. CTL są zdolne do zabijania komórek docelowych ekspresjonujących antygeny wirusowe, ale nie zabijają komórek docelowych ujemnych pod kątem wirusa i częściowo dopasowanych pod kątem HLA, co wskazuje, że nie powinny one indukować choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD) in vivo (Rysunek 5).
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Schemat procesu nukleofekcji; ekspansja CTL w bioreaktorze; zastosowanie plazmidowego DNA; wynik infuzji." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Protokół generowania rCTL. Najpierw komórki DC poddawane są nukleofekcji plazmidami kodującymi antygen wirusowy, a następnie mieszane z autologicznymi PBMC w stosunku R:S wynoszącym 10 lub 20:1. Komórki są namnażane w systemie G-Rex przez 10-14 dni w obecności IL4 i IL7, po czym są zbierane, liczone, badane pod kątem funkcji, tożsamości i sterylności, a następnie krio konserwowane do zastosowań klinicznych.
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący produkcję IFN-γ w eksperymentach z kontrolą plazmidową i optymalizacją." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Zoptymalizowane plazmidy DNA indukują silniejszą aktywację limfocytów T in vitro. Komórki DC poddano nukleofekcji zoptymalizowanymi plazmidami zgodnymi z FDA kodującymi Hexon i Penton (Adv), IE1 i pp65 (CMV) oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 (EBV) lub konwencjonalnymi plazmidami pShuttle kodującymi te same antygeny. Wykorzystano je do stymulacji limfocytów T, a swoistość przeanalizowano za pomocą testu IFNγ ELIspot 10 dni po stymulacji.
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący odpowiedź immunologiczną; SFC/2x10^5 CTL przeciwko antygenom przy rozcieńczeniach 1:20, 1:50." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Optymalne stosunki DC:komórki T dla aktywacji CTL. Komórki DC od 2 dawców poddano nukleofekcji za pomocą wszystkich trzech zoptymalizowanych plazmidów, a następnie wykorzystano do stymulacji autologicznych PBMCs w stosunku DC:PBMC 1:20 lub 1:50. Częstość reaktywowanych limfocytów T oceniono w 10. dniu za pomocą testu IFNγ ELIspot.
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Schemat ekspansji hodowli komórkowych i wyniki cytometrii przepływowej, pokazujące efekty cytokin IL-4 i IL-7." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Ekspansja limfocytów T w urządzeniu G-Rex z wykorzystaniem cytokin wspomagających. Panel A przedstawia urządzenie G-Rex oraz wygląd CTL na membranie przepuszczalnej dla gazów, oceniony za pomocą mikroskopii. Przedstawiono również porównanie wydajności komórkowej uzyskanej na konwencjonalnych płytkach hodowlanych w porównaniu do G-Rex. Panel B przedstawia częstotliwość występowania CTL dodatnich pod kątem pentameru CMV uzyskanych w hodowlach eksponowanych na brak cytokin, samą IL-4, samą IL-7 oraz kombinację IL-4+IL-7.
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej, podzbiory komórek odpornościowych; różnicowanie CD4/CD8, wykresy odpowiedzi cytokinowej." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Fenotyp i funkcja namnożonych CTL. Panel A przedstawia reprezentatywny przykład fenotypu namnożonych wielowirusowych CTL, które są poliklonalne i zawierają mieszankę limfocytów T CD4+ (45% – pomocnicze) i CD8+ (42% – cytotoksyczne), z których większość (95%) wykazuje ekspresję markerów pamięci CD45RO+/CD62L+. Panel B wykazuje, że komórki te są specyficzne dla wszystkich antygenów stymulujących i są polifunkcyjne, co oceniono za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w celu wykrycia produkcji IFNΓ i TNFα po stymulacji antygenowej. Panel C wykazuje, że namnożone CTL są funkcjonalne, co zmierzono testem z Cr51. Jako komórki docelowe wykorzystano autologiczne LCL, samodzielnie lub transdukowane wektorem null lub wektorem adenowirusowym wykazującym ekspresję CMV-pp65. Aloreaktywność oceniono, wykorzystując allogeniczne blasty PHA jako komórki docelowe.

<ol><li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function%3A+a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li>
<li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li>
<li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li>
<li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4%28%2B%29+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li>
<li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA1-specific+CD4%2B+T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li>
<li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li>
<li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans%3A+lessons+from+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li>
<li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li>
<li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li>
<li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pDNAVACCultra+vector+family%3A+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li>
<li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li>
<li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li>
<li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li>
<li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li>
<li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li>
</ol>

Juan F. Vera jest konsultantem w firmie Wilson Wolf Manufacturing. Pozostali autorzy nie zgłosili żadnych istotnych konfliktów interesów.

Zakażenia wirusowe odpowiadają za znaczną zachorowalność i śmiertelność u pacjentów z niedoborem odporności wynikającym z choroby lub jej leczenia. Na przykład po HSCT dobrze znane są zakażenia wywołane przez trwałe herpeswirusy, takie jak EBV i CMV, a także przez wirusy oddechowe, takie jak wirus RSV, podczas gdy znaczenie zakażeń wywołanych przez Adv, wirusa BK i ludzkiego herpeswirusa (HHV)-6 zostało docenione w ostatnim czasie. Chociaż środki farmakologiczne stanowią standardową terapię w przypadku niektórych zakażeń, wiążą się one ze znaczną toksycznością, prowadzą do powstawania wariantów opornych i często okazują się nieskuteczne. W przeciwieństwie do nich, specyficzne dla wirusa limfocyty T pochodzące od dawców komórek macierzystych okazały się bezpieczne i skuteczne w zapobieganiu oraz leczeniu zakażeń lub chorób wirusowych w kontekście przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT)2,5,6,18-21. Jednak szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T jest ostatecznie ograniczone przez koszt, złożoność i czas wymagany do produkcji CTL.
Nasze nowatorskie i szybkie podejście do generowania wielowirusowych CTL, opisane w niniejszym manuskrypcie, powinno znacząco zwiększyć wykonalność terapii cytotoksycznymi limfocytami T w chorobach wirusowych, umożliwiając przekształcenie tej strategii w standard opieki nad pacjentami z niedoborem odporności. Wykorzystanie nukleofektowanych plazmidami komórek DC jako APC umożliwia prezentację antygenu zarówno na cząsteczkach MHC klasy I, jak i II, bez konkurencji ze strony wektorów wirusowych czy wielu antygenów wirusowych eksprymowanych w jednej komórce, ponieważ dla każdego plazmidu wykorzystywane są różne populacje DC3. Zastosowanie IL-4/7 zwiększa przeżywalność i proliferację limfocytów T, co w konsekwencji pomaga zwiększyć częstotliwość i repertuar odpowiadających limfocytów T specyficznych dla antygenu16,17. Wreszcie, hodowla w systemie G-Rex drastycznie redukuje apoptozę limfocytów T podczas inkubacji. Wymiana gazowa (napływ O2 i odpływ CO2) odbywa się przez przepuszczalną dla gazów membranę silikonową u podstawy kolby, co zapobiega hipoksji, jednocześnie pozwalając na większą głębokość pożywki nad komórkami, co zapewnia więcej składników odżywczych i rozcieńcza produkty przemiany materii. Platformę tę można rozszerzyć o dodatkowe wirusy w miarę identyfikacji antygenów ochronnych.

<table><tbody><tr><td>CellGenix</td><td>CellGenix</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>IL4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>204-IL/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie surowica AB</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Nukleofektor</td><td>Amaxa</td><td>AAF-1001B &amp;amp; AAF-1001X</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do nukleofekcji</td><td>Amaxa</td><td>V4XP-3012</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy</td><td>NTC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>215-GM/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>201-LB-025</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>206-IL-CF</td><td></td></tr><tr><td>TNF&amp;#945;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA-010</td><td></td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6532-1MG</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex</td><td>Wilson Wolf Manufacturing</td><td>AY11-00027</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów t w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Zakażenia wirusowe powodują zachorowalność i śmiertelność u biorców allogenicznych przeszczepów krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT). My oraz inni badacze z sukcesem generowaliśmy i wlewaliśmy limfocyty T specyficzne dla wirusa Epsteina-Barr (EBV), cytomegalowirusa (CMV) i adenowirusa (Adv), wykorzystując monocyty oraz limfoblastoidalne linie komórkowe transformowane przez EBV (EBV-LCL), zmodyfikowane genetycznie za pomocą wektora adenowirusowego jako komórki prezentujące antygen (APCs). Już 2x105/kg cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla trzech wirusów proliferowały o kilka rzędów wielkości po infuzji i wydawały się zapobiegać oraz leczyć nawet ciężkie choroby wirusowe oporne na inne dostępne terapie. Szersze wdrożenie tego obiecującego podejścia jest ograniczone przez wysokie koszty produkcji, złożoność procesu wytwarzania oraz długi czas przygotowania (4-6 tygodni na generowanie EBV-LCL i 4-8 tygodni na produkcję CTL – łącznie 10-14 tygodni). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nowy protokół produkcji CTL zgodny z zasadami GMP. Po pierwsze, zamiast adeno-wektorów do stymulacji limfocytów T, stosujemy komórki dendrytyczne (DCs) poddane nukleofekcji plazmidami DNA kodującymi LMP2, EBNA1 i BZLF1 (EBV), Hexon i Penton (Adv) oraz pp65 i IE1 (CMV) jako komórki prezentujące antygen. Te APCs reaktywują limfocyty T specyficzne dla wszystkich stymulujących antygenów. Po drugie, hodowla aktywowanych limfocytów T w obecności IL-4 (1,000U/ml) i IL-7 (10ng/ml) zwiększa i podtrzymuje repertuar oraz częstotliwość specyficznych limfocytów T w naszych liniach. Po trzecie, zastosowaliśmy nowe, przepuszczalne dla gazów urządzenie do hodowli (G-Rex), które sprzyja ekspansji i przeżywalności dużych liczb komórek po pojedynczej stymulacji, co eliminuje konieczność stosowania EBV-LCL i zmniejsza interwencje techników. Dzięki wprowadzeniu tych zmian możemy obecnie produkować wielospecyficzne CTL nakierowane na EBV, CMV i Adv przy koszcie za 106 komórek zredukowanym o &gt;90%, w zaledwie 10 dni zamiast 10 tygodni, stosując podejście, które można rozszerzyć na dodatkowe ochronne antygeny wirusowe. Nasze zatwierdzone przez FDA podejście powinno mieć wartość w zastosowaniach profilaktycznych i terapeutycznych dla biorców allogenicznych HSCT z grupy wysokiego ryzyka.

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Infekcje wirusowe powodują zachorowalność i śmiertelność u biorców allogenicznych przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT). My oraz inni badacze z sukcesem...

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybkie generowanie pochodzących od dawcy wirusowo-specyficznych limfocytów T cytotoksycznych lub CTL, które nadają się do transferu adopcyjnego u biorców allogenicznego przeszczepienia komórek macierzystych krwiwłochotwórczych lub HSCT. Osiąga się to poprzez najpierw nuklefekcję komórek dendrytycznych lub dcs plazmidami kodującymi antygeny wirusowe, aby przygotować komórki do prezentacji antygenu. W drugim kroku nuklefekowane dcs są wykorzystywane do stymulacji antygenowo-specyficznych limfocytów T, które następnie są namnażane w obecności IL-4 i IL-7 w gazoprzepuszczalnym urządzeniu hodowlanym zwanym GASP.Następnie, po siedmiu dniach hodowli, komórki są pasażowane i wysiewane, a pożywka jest uzupełniana w celu utrzymania maksymalnej ekspansji CTL in vitro. W końcu, w dniu 12., komórki są zbierane i testowane pod kątem czystości, aktywności oraz bezpieczeństwa, a następnie krio konserwowane do późniejszego zastosowania klinicznego. W rezultacie można wygenerować linie CTL o wielowirusowej swoistości i minimalnej reaktywności allogenicznej, co potwierdzają barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, produkcja interferonu gamma oraz cytotoksyczność.Wytwarzanie linii cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla wielu wirusów jest czasochłonne i uciążliwe. Wymaga ono zastosowania linii komórek B transformowanych wirusem EBV oraz wektorów adenowirusowych, a cała procedura trwa około trzech miesięcy. Nasza nowa metoda nie wykorzystuje wektorów wirusowych.Komórki rosną w hodowli wykładniczo przy minimalnej utracie komórek, dzięki czemu procedura jest szybka i kosztowo efektywna. Procedurę tę prezentuje Eureka Gerdeman, stażysta kliniczny w laboratorium. Pozyskaj dcs pochodzące z monocytów, które zostały wygenerowane w pożywce Cellgenic uzupełnionej o IL-4 i G-M-CSF, a następnie dojrzewały przez 24 godziny w cytokinach dojrzewania, poprzez delikatne resuspensowanie za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml. Użyj błękitu trypanowego do policzenia dcs, a następnie przenieś je do trzech probówek o pojemności 15 ml, tak aby w każdej probówce znalazło się nie mniej niż 0,5 × 10⁶ i nie więcej niż 2 × 10⁶ komórek.Następnie odwiruj DCS przez 10 minut przy 200 ×g. W tym czasie przygotuj 6 mL pożywki cell genix uzupełnionej o ten sam koktajl cytokin do dojrzewania DC co poprzednio i nlej po 2 mL do trzech dołków 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej; niewykorzystane dołki wypełnij 2 mL sterylnej wody. Przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu wstępnego ogrzania.Po zakończeniu wirowania komórek odessać nadsączki i dodać odpowiednie plazmidy DNA do każdej probówki, tak aby końcowe stężenie wynosiło 5 µg DNA na probówkę. W tym przypadku do probówki nr 1 dodaje się plazmid kodujący IE1 pp65, do probówki nr 2 hcp5, a do probówki nr 3 EBNA1 LMP2 BZLF1. Resuspender komórki i DNA w 100 µL roztworu do nukleofekcji.Dokładnie wymieszać i przenieść mieszaninę do kuwet do nukleofekcji Nucleofector. Umieścić kuwety w urządzeniu Nucleofector 4D. Wybrać program CB 150 i nacisnąć start natychmiast po nukleofekcji.Do każdej probówki z zawiesiną komórek dodać 500 µL podgrzanego medium do dojrzewania CELLGENIC DC, wymieszać komórki, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół dwa do trzech razy, a następnie przenieść zainfekowane nukleazycznie DC do przygotowanej płytki 12-dołkowej zawierającej pozostałe 1,5 mL podgrzanego medium do dojrzewania DC. Płytkę przenieść do inkubatora na kolejne 12 do 18 godzin, po czym zebrać, policzyć i naświetlać zainfekowane nukleazycznie DC. Komórki przemyć raz 10 mL medium CTL, a następnie resuspender w stężeniu 3 × 10⁵ DC/mL medium. Z trzech infekcji nukleazycznych zebrać łącznie minimum 7,5 × 10⁵ (2,5 mL) i maksimum 15 × 10⁵ (5 mL) DC, a następnie przenieść połączone, przetransfekowane plazmidowo DC do urządzenia G Rex.Następnie umieść urządzenie w inkubatorze w celu przygotowania komórek odpowiadających. Wykorzystaj nieadherentne komórki mononuklearne pozostałe po selekcji DC. Przenieś komórki odpowiadające do podgrzanego wcześniej roztworu hodowlanego.Przemyć je raz podłożem CTL media reus. Zawiesić komórki w podłożu CTL media. Policzyć komórki i doprowadzić je do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml.Pobrać 15 × 10⁶ komórek lub 7,5 ml i uzupełnić cytokinami IL-4 oraz IL-7. Przenieść 7,5 ml PBMC do G-Rex i dopełnić bioreaktor pożywką do CTL do całkowitej objętości 30 ml. Na koniec umieścić G-Rex w inkubatorze na sześć do siedmiu dni; w szóstym lub siódmym dniu odessać 10 ml pożywki.Następnie wymieszać pozostałe 20 milliliters pożywki za pomocą pipety 10 milliliter. W przypadku, gdy liczba komórek jest mniejsza niż 50 × 10⁶, zastosować błękit trypanu w celu ich policzenia. Uzupełnić kulturę świeżą pożywką oraz cytokinami.Jeśli liczba komórek przekracza 50 × 10⁶, należy odjąć 10 ml zawiesiny komórkowej, przenieść komórki do nowego naczynia G rex, a następnie zasilić oba naczynia G rex świeżą pożywką CTL i cytokinami; komórki należy hodować przez kolejne cztery do sześciu dni, aby zwiększyć ich liczbę do poziomu wystarczającego do zbioru i policzenia. Następnie komórki, które nie zostaną wykorzystane do analiz fenotypowych lub funkcjonalnych, należy kriozachować do późniejszego użycia. Reprezentatywne wyniki wykazują, że multicytoniczne plazmidy DNA indukują specyficzne dla wielu wirusów limfocyty T, co zmierzono za pomocą testu ELISpot dla interferonu gamma, a częstotliwość komórek reaktywnych jest wyższa niż w przypadku linii generowanych przy użyciu konwencjonalnych plazmidów PHU wykazujących te same antygeny.Optymalny stosunek DC do PBMC jest istotny dla silnej stymulacji limfocytów T, co pokazano na tej rycinie, gdzie stosunek 1:50 daje suboptimalną reaktywację w porównaniu do stosunku stymulatora do respondenta 1:20. Hodowla CTL w systemie G rex, przedstawiona na tej rycinie, zapewnia lepszą ekspansję limfocytów T w porównaniu z konwencjonalnymi płytkami 24-dołkowymi. Dodanie IL-4 i IL-7 do hodowli zwiększa repertuar i specyficzność rozszerzonych komórek, co pokazano tutaj, oceniając częstotliwość limfocytów T reaktywnych przeciwko peptydowi NLV pochodzącemu z CMV PP65 z ograniczeniem do HLA-A2 w hodowlach generowanych w obecności lub nieobecności IL-4 i/lub IL-7. Ta rycina przedstawia reprezentatywną próbkę fenotypu szybko rozszerzonych wielowirusowych CTL, które są poliklonalne i stanowią mieszaninę limfocytów T CD4+ oraz CD8+, z których większość wykazuje markery pamięci CD45RO i CD62L. Rozszerzone CTL są specyficzne dla wszystkich antygenów stymulujących i są polifunkcyjne, co oceniono tutaj za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w celu wykrycia produkcji interferonu gamma i TNF-alpha po stymulacji antygenem, ocenionej za pomocą testu uwalniania chromu.Ekspandowane limfocyty CTL są w stanie specyficznie eliminować cele wirusowe, nie wykazując przy tym niespecyficznej aktywności przeciwko celom z niedopasowaniem HLA, co jest kluczowym aspektem bezpieczeństwa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko wytwarzać linie cytotoksycznych limfocytów T swoistych dla wielu wirusów, które są zgodne z normami GNP i nadają się do transferu adopcyjnego u pacjentów z chorobami związanymi z wirusami. Uproszczenie tej procedury powinno ułatwić jej wdrożenie poza specjalistycznymi zakładami produkcyjnymi i sprawić, że stanie się ona standardem opieki dla pacjentów z niedoborami odporności, którzy są szczególnie podatni na choroby związane z wirusami.

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wytwarzanie wielowirusospecyficznych komórek T w celu zapobiegania/leczenia infekcjom wirusowym po allogenicznym przeszczepie komórek macierzystych krwiotwórczych

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Poznaj szybką metodę wytwarzania wielowirusowych limfocytów T cytotoksycznych po allogenicznym przeszczepie komórek macierzystych. Protokół zgodny z GMP umożliwia ekspansję komórek w bioreaktorze G-Rex z minimalną aloreaktywnością.

Wytwarzanie wielowirusowych limfocytów T w celu zapobiegania/leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów