Bezkomórkowy system analizy szacujący zdolność neutralizacji przeciwciał przeciw GM-CSF z wykorzystaniem rekombinowanego rozpuszczalnego receptora GM-CSF

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest opracowanie bezkomórkowego testu ilościowo określającego zdolność neutralizacyjną autoprzeciwciał przeciwko G-M-C-S-F. Rozpoczynamy od pozyskania transgenicznych jedwabników. Wprowadzamy ludzki gen SGMR alpha w celu produkcji rekombinowanego SGMR alpha, a następnie przystępujemy do znakowania rekombinowanego ludzkiego G-M-C-S-F za pomocą bioTE.

Następnie oceniamy korelację między systemem wolnym od komórek a standardowym testem biologicznym, przeprowadzając badanie hamowania wiązania G-M-C-S-F z SGMR alfa przez autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F. Uzyskane wyniki wykazują istotną korelację między hamowaniem wzrostu w teście biologicznym a hamowaniem wiązania w systemie wolnym od komórek przez frakcje IgG surowicy oraz oczyszczone autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test TF one, jest to, że system ten charakteryzuje się wysoką czułością analizy i dobrą powtarzalnością w pomiarze zdolności neutralizacyjnej autoprzeciwciał przeciwko GM CSF.

Ponieważ autoprzeciwciała przeciwko GM CSF wywołują autoimmunologiczną pierwotną rokowaną ogólną, zastosowania tej techniki rozszerzają się na diagnostykę. Można ją również wykorzystać w konkurencyjnych testach wiązania z użyciem rekombinowanych receptorów cytokinowych, takich jak receptory dla BEGF i TNFA. Procedurę zaprezentuje ano, doktorant z mojego laboratorium. To on opracował ten system wolny od pH.

W tym filmie przedstawiono jedwabnika wykorzystywanego do produkcji rekombinowanego SGMR alpha. Pierwszym krokiem jest amplifikacja CDNA dla SGMR Alpha z biblioteki CD NA łożyska ludzkiego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy, co pozwala uzyskać produkt PCR. Następnie przeprowadza się drugą reakcję PCR, aby do końca 5' dodać 50-nukleotydową sekwencję 5' UTR polihydroonu wirusa ULA.

Aby oznaczyć R RRGs, do końca 3' klonowano produkt amplifikacji PCR R do plazmidy P MSG one one mg. Konstrukt PS GMR slash M1 one mg wstrzyknięto wraz z wektorem pomocniczym PHA three pig do jaj jedwabnika szczepu PNDW one. Wyklute larwy G zero hodowano do stadium ciem w temperaturze 25°C. Następnie przesiewano embriony G one, poprzez krzyżowanie rodzeństwa lub krzyżowanie z PNDW one, pod kątem ekspresji MG FP w oczach, co wskazywało na obecność transgenicznych jedwabników.

W celu wyekstrahowania rekombinowanego białka SGMR alpha z kokonów transgenicznych jedwabników, gen SGMR alpha poddano ekstrakcji przy użyciu buforu fosforanowego zawierającego 500 mM chlorku sodu, mieszając w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Próbki odwirowano przy 20 000 ×g przez 15 minut. Aby usunąć osady, nadsącz naniesiono na kolumnę powinowactwa do niklu.

Przemyj kolumnę i eluuj białka za pomocą gradientu liniowego NaCl od 10 millimolar do 250 millimolar. Połącz frakcje zawierające oczyszczone SGMR alpha i poddaj dializie przeciwko soli fosforanowo-buforowanej. Pierwszą dializę próbek przeprowadź z użyciem PBS.

Aby usunąć sorbitol z preparatu G-M-C-S-F, należy dodać jeden mililitr schłodzonego 20 milimolarnego roztworu meta-daty sodu i inkubować próbkę przez 30 minut na lodzie w ciemności. Następnie należy dodać glicerol do stężenia końcowego 15 milimolarnego i przeprowadzić dializę przeciwko 100 milimolarnemu buforowi octanu sodu. W kolejnym kroku należy dodać do roztworu azyd biotinowy do stężenia końcowego pięciu milimolarnych i mieszać przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Na koniec usunąć materiał niereaktywny poprzez dializę przeciwko PBS, a następnie pokryć płytkę mikrotitracyjną 50 µL przeciwciała monoklonalnego anty-polyhis, inkubując przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć pięciokrotnie PBST. Następnie dodać 100 µL roztworu blokującego i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4 °C.

Ponownie przemyj pięć razy PBST. Po pięciu przemyciach PBST dodaj 50 µL SGMR alpha w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Dodaj 25 µL próbek zawierających autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F, a następnie 25 µL biotynilowanego G-M-C-S-F i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.

Aby utworzyć kompleks SGMR alpha G-M-C-S-F, należy kontynuować płukanie pięciokrotnie za pomocą PBST, a następnie dodać 50 µL streptawidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C w celu wykrycia biotynilowanego G-M-C-S-F związanego z SGMR alpha. Po pięciokrotnym płukaniu PBST dodać 50 µL substratu chemiluminescencyjnego do roztworu, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i oznaczyć aktywność chemiluminescencyjną przy użyciu czytnika płytek. W analizie SDS-PAGE rekombinowane białko SDMR alpha pochodzące z jedwabnika występuje zarówno w formie monomeru, jak i dimeru w warunkach nieredukujących, natomiast jedynie w formie monomeru w warunkach redukujących.

Ta rekombinowana mieszanina monomerów oraz połączonych mostkami dwusiarczkowymi dimerów SGMR alpha jest funkcjonalna w konkurencyjnym teście wiązania. Kompleks biotynilowanego G-M-C-S-F z SGMR alpha wykazuje swoistość, ponieważ może zostać rozdzielony poprzez dodanie różnych stężeń przeciwciał neutralizujących, ale nie przeciwciał nieneutralizujących. Co więcej, zwiększające się stężenia neutralizujących przeciwciał przeciwko G-M-C-S-F korelują dodatnio ze wzrostem procentowego zahamowania wiązania w sposób zależny od dawki.

Zgodnie z oczekiwaniami, hamowanie wiązania przez nieneutralizujące przeciwciała przeciwko G-M-C-S-F nie było zależne od dawki. Ten system bezkomórkowy wykazuje ścisłą korelację hamowania wiązania G-M-C-S-F do SGMR alpha przez autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F, przy obliczonych wartościach r równych 0,988 i wartości P wynoszącej 0,002. Hamowanie wiązania przez autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F zwiększało się w sposób zależny od dawki.

Podobnie, hamowanie wiązania wykazało istotną korelację z hamowaniem wzrostu importu. Niniejszy test jest użyteczny do analizy frakcji IgG surowicy u pacjentów z autoimmunologicznym PAP, co wykazano tutaj poprzez zależność między IC 50 dla procentowego hamowania wiązania a procentowym hamowaniem wzrostu przez frakcje IgG surowicy. Ponadto współczynnik zmienności między eksperymentami wskazuje na przewagę systemu bezkomórkowego nad bioanalizą hamowania wzrostu.

Po raz pierwszy ten bezkomórkowy test wiązania liganda receptora GM GSF może zostać pomyślnie przeprowadzony w ciągu 38 godzin. Ważne jest, aby zachować odpowiednią temperaturę reakcji oraz czas inkubacji. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie przesiewowych badań aktywności biologicznej nowych leków przeciwciałowych, stanowiąc alternatywę dla konwencjonalnych testów biologicznych.