Bezkomórkowy system analizy szacujący zdolność neutralizacji przeciwciał przeciw GM-CSF z wykorzystaniem rekombinowanego rozpuszczalnego receptora GM-CSF

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest opracowanie bezkomórkowego testu ilościowo określającego zdolność neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko G-M-C-S-F. W pierwszej kolejności pozyskiwany jest transgeniczny jedwabnik. Wprowadza się ludzki gen SGMR alpha w celu produkcji rekombinowanego białka SGMR alpha, a następnie przystępuje się do znakowania rekombinowanego ludzkiego białka G-M-C-S-F za pomocą bioTE.

Następnie oceniamy korelację między systemem bezkomórkowym a standardowym testem biologicznym, przeprowadzając badanie hamowania wiązania G-M-C-S-F z SGMR alpha przez autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F. Uzyskane wyniki wykazują istotną korelację między hamowaniem wzrostu w teście biologicznym a hamowaniem wiązania w systemie bezkomórkowym przez frakcje IgG surowicy oraz oczyszczone autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test TF one, jest wysoka czułość analizy oraz dobra powtarzalność w pomiarze zdolności neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko GM CSF.

Ponieważ autoprzeciwciała przeciwko GM CSF wywołują autoimmunologiczną pierwotną prognozę ogólną, zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę. Może ona zostać również wykorzystana w konkurencyjnych testach wiązania z wykorzystaniem rekombinowanych receptorów cytokinowych, takich jak receptory dla BEGF i TNFA. Procedura demonstracyjna zostanie przedstawiona przez ano, doktoranta z mojego laboratorium, który opracował ten system wolny od pH.

W tym filmie przedstawiono jedwabnika wykorzystanego do produkcji rekombinowanej białka SGMR alpha. Pierwszym krokiem jest amplifikacja cDNA dla SGMR Alpha z biblioteki cDNA łożyska ludzkiego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Następnie, z otrzymanego amplikonu PCR, przeprowadza się drugą reakcję PCR w celu dodania do końca 5' sekwencji 5' UTR o długości 50 zasad z polihedronu wirusa ULA.

Aby oznakować R RRGs, do końca 3' klonowano amplifikowany produkt PCR R do plazmidu P MSG one one mg. Konstrukt PS GMR slash M1 one mg wstrzyknięto wraz z wektorem pomocniczym PHA three pig do jaj jedwabnika szczepu PNDW one. Wylęgnięte larwy G zero hodowano do stadium ćwień w temperaturze 25 °C. Następnie przesiewano embriony G one, poprzez kojarzenie rodzeństwa lub z PNDW one, analizując ekspresję MG FP w oczach, co wskazywało na obecność transgenicznych jedwabników.

W celu otrzymania rekombinowanego białka SGMR alpha z kokonów transgenicznych jedwabników, należy przeprowadzić ekstrakcję genem SGMR alpha w buforze fosforanowym zawierającym 500 millimolar sodium chloride, mieszając przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Próbki należy odwirować przy 20 000 ×g przez 15 minut. Aby usunąć osady, należy nanieść nadsącz na kolumnę z powinowactwem do niklu.

Przemyj kolumnę i wypłucz białka za pomocą gradientu liniowego ole od 10 millimolar do 250 millimolar. Połącz frakcje zawierające oczyszczone SGMR alpha i poddaj dializie przeciwko buforowi fosforanowo-solnemu. W pierwszej kolejności dializuj próbki w PBS.

Aby usunąć sorbitol z preparatu G-M-C-S-F, należy dodać 1 mL 20 mM schłodzonego roztworu meta-daty sodu i inkubować próbkę przez 30 minut na lodzie w ciemności. Następnie dodać glicerol do stężenia końcowego 15 mM i przeprowadzić dializę przeciwko 100 mM buforowi octanu sodu. Dalej, do roztworu należy dodać azydkową biotynę do stężenia końcowego 5 mM i mieszać przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Na koniec usuń materiał niereaktywny poprzez dializę przeciwko PBS, a następnie pokryj płytkę mikrotitracyjną 50 µL przeciwciała monoklonalnego anty-polyhis przez noc w temperaturze 4 °C. Przepłucz pięciokrotnie PBST. Następnie dodaj 100 µL roztworu blokującego i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 4 °C.

Ponownie przemyj pięć razy PBST. Po pięciu przemyciach PBST dodaj 50 µL SGMR alpha w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Dodaj 25 µL próbek zawierających autoprzeciwciała przeciwko G-M-C-S-F, a następnie 25 µL biotynilowanego G-M-C-S-F i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.

Aby utworzyć kompleks SGMR alpha G-M-C-S-F, należy kontynuować płukanie pięciokrotnie PBST, a następnie dodać 50 µL streptawidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C w celu wykrycia biotynilowanego G-M-C-S-F związanego z SGMR alpha. Następnie należy płukać pięciokrotnie PBST, dodać 50 µL substratu chemiluminescencyjnego do roztworu, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i określić aktywność chemiluminescencyjną przy użyciu czytnika płytek. W analizie SDS-PAGE rekombinowany SDMR alpha pochodzący z jedwabnika występuje w formie monomeru oraz dimeru w warunkach nieredukujących, natomiast wyłącznie w formie monomeru w warunkach redukujących.

Ta rekombinowana mieszanina monomerów i dimerów SGMR alfa połączonych mostkami disiarczkowymi jest funkcjonalna w konkurencyjnym teście wiązania. Kompleks biotynilowanego G-M-C-S-F z SGMR alfa wykazuje specyficzność, ponieważ może zostać rozdzielony poprzez dodanie różnych stężeń przeciwciała neutralizującego, ale nie przeciwciała nieneutralizującego. Co więcej, zwiększające się stężenia neutralizujących przeciwciał przeciwko G-M-C-S-F korelują dodatnio ze wzrostem procentowego hamowania wiązania w sposób zależny od dawki.

Zgodnie z oczekiwaniami, hamowanie wiązania przez nieneutralizujące przeciwciała G-M-C-S-F nie było zależne od dawki. Ten system wolny od komórek wykazuje ścisłą korelację hamowania wiązania G-M-C-S-F do SGMR alpha przez autoprzeciwciała G-M-C-S-F z obliczonymi wartościami r równymi 0,988 oraz wartością P wynoszącą 0,002. Hamowanie wiązania wzrastało w sposób zależny od dawki w przypadku autoprzeciwciał G-M-C-S-F.

Podobnie, hamowanie wiązania korelowało istotnie z hamowaniem wzrostu importu. Test ten jest użyteczny do analizy frakcji IgG surowicy pacjentów z autoimmunologicznym PAP, co wykazano tutaj poprzez zależność między IC 50 dla procentowego hamowania wiązania a procentowym hamowaniem wzrostu przez frakcje IgG surowicy. Ponadto współczynnik zmienności między eksperymentami wskazuje na przewagę systemu bezkomórkowego nad bioanalizą hamowania wzrostu.

Po opanowaniu metody, ten bezkomórkowy test wiązania ligandu receptora GSF zmodyfikowanego genetycznie może zostać pomyślnie przeprowadzony w ciągu 38 godzin. Ważne jest, aby zachować odpowiednią temperaturę reakcji oraz czas inkubacji. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie przesiewowego badania aktywności biologicznej nowych leków przeciwciałowych, stanowiąc alternatywę dla konwencjonalnych testów biologicznych.