Name: Wibrodysocjacja neuronów z wycinków mózgu gryzoni w celu zbadania transmisji synaptycznej i obrazu zakończeń presynaptycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę wibrodysocjacji neuronów z wycinków mózgu gryzoni do badania transmisji synaptycznej i obrazowania zakończeń presynaptycznych. Technika umożliwia patch-clamp i kontrolę farmakologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Ping Jun Zhu oraz dr. Susumu Koyama za pomoc podczas wstępnego wdrażania techniki, a także dr Veronica Alvarez za pomoc w redagowaniu tekstu manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane przez Division of Intramural Clinical and Biomedical Research w ramach NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Skuteczna wibrodysocjacja wymaga, aby skrawki zawierały zdrowe neurony, a przestrzenie śródmiąższowe były wystarczająco elastyczne, by umożliwić neuronom opuszczenie skrawka bez uszkodzeń toksycznych. Zatem technika ta działa optymalnie w wczesnym okresie postnatalnym (P1-21), kiedy można przygotować zdrowe skrawki zawierające mniej materiału glejowego/śródmiąższowego niż w skrawkach mózgu dorosłych osobników. W naszym doświadczeniu optymalizacja przygotowania skrawka pod kątem przeżywalności neuronów w samym skrawku może być jednak przeciwskuteczna dla techniki wibrodysocjacji. Podczas gdy rutynowo przygotowujemy skrawki do rejestracji in situ przy użyciu zimnego zmodyfikowanego aCSF, w którym sacharoza zastąpiła znaczną część pozakomórkowego Na+ i Ca2+, skrawki do wibrodysocjacji mogą być przygotowywane (np. cięte) w naszym standardowym aCSF do rejestracji. Przygotowując skrawki do rejestracji z pojedynczych neuronów w samych skrawkach, umieszczamy je również w standardowym aCSF w temperaturze 35°C bezpośrednio po cięciu i pozostawiamy w tej temperaturze przez 30-60 min przed powrotem do temperatury pokojowej. Natomiast skrawki przygotowywane do wibrodysocjacji są przenoszone do temperatury pokojowej natychmiast po pocięciu. Procedury te zapewniają wyższą wydajność zdrowych neuronów po wibrodysocjacji, co prawdopodobnie wynika z braku sztywnej tkanki śródmiąższowej, co pozwala na łatwiejsze „wytrząśnięcie” neuronów ze skrawka. Nie zbadaliśmy wyczerpująco warunków przygotowania skrawków, ponieważ rutynowo otrzymujemy wystarczającą liczbę neuronów do naszych eksperymentów z rejestracją i obrazowaniem w danym dniu. Możliwe jest, że dodatkowe modyfikacje, takie jak zmiany grubości skrawka lub procedury preinkubacji, mogłyby zwiększyć wydajność zdrowych neuronów. W celu zwiększenia uzysków komórkowych i próby zastosowania tej techniki u starszych zwierząt testowano bardzo łagodne traktowanie proteazami. Jednakże, nawet łagodne traktowanie proteazami niezmiennie wydaje się zaburzać funkcję synaps. Zatem, choć kombinacja proteaz i dysocjacji mechanicznej może wciąż okazać się skuteczna, do tej pory nie okazała się ona niezawodna w przypadku neuronów przedmózgowia.
Należy również zauważyć, że stosunkowo niska wydajność zdrowych neuronów po wibrodysocjacji sprawia, iż technika ta jest przydatna głównie do badania licznych podtypów neuronów, przede wszystkim neuronów projekcyjnych. Dostępność myszy wykazujących ekspresję GFP, w których można łatwo zidentyfikować niewielkie subpopulacje neuronów, zwiększa szansę na zbadanie tych rzadszych neuronów. Jednakże, dopóki wydajność neuronów nie zostanie znacząco poprawiona, gromadzenie danych na temat tych neuronów prawdopodobnie będzie przebiegać stosunkowo powolnie.
Kilka etapów okazało się kluczowych dla skutecznego obciążania neuronów barwnikami wykrywającymi wapń. Ekspozycję na barwnik estryfikowany AM przeprowadza się w temperaturze 37°C; próby obciążania barwnikiem w niższych temperaturach nie przyniosły sukcesu. Stężenie barwników powinno zostać zoptymalizowane z uwzględnieniem zarówno czasu obciążania, jak i temperatury, ponieważ wydaje się, że wyższe stężenie barwnika obniża stężenie wapnia w boutonach presynaptycznych. Zaobserwowano, że obciążanie wyższymi stężeniami zmniejsza częstotliwość i amplitudę sIPSCs. Podczas wprowadzania barwników wykrywających wapń do zakończeń presynaptycznych neuronów dysocjowanych metodą wibracyjną należy zachować ostrożność, ponieważ pojemność buforowa małych boutonów presynaptycznych może różnić się od pojemności w somie, a rozmiary boutonów nie są jednorodne. Po obciążeniu barwnikiem naczynia zawierające neurony przemywa się zewnętrznym roztworem buforowanym HEPES; czas regeneracji po płukaniu jest kluczowy. Ponadto, aby uzyskać szczelną membranę (seal) do rejestracji whole-cell, komórki muszą zostać dokładnie przemyte w celu usunięcia niezinternalizowanych cząsteczek barwnika z zewnętrznej błony komórkowej.
Oprócz wykorzystania neuronów poddanych wibrodysocjacji do elektrofizjologii i obrazowania żywych komórek, do tych komórek można zastosować również techniki immunocytochemiczne11,12. Komórki można łatwo utrwalić i barwić za pomocą różnych przeciwciał oraz innych markerów komórkowych. Wykorzystanie tych komórek zapewnia czysty preparat do wizualizacji ekspresji białek w presynaptycznych zakończeniach GABAergicznych. Użycie myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych pod kontrolą promotorów specyficznych dla neuronów GABAergicznych pozwala badaczowi na identyfikację poszczególnych zakończeń synaptycznych w preparacie poddanym wibrodysocjacji (Rysunek 1). Obrazowanie markerów fluorescencyjnych tego typu może umożliwić pomiary morfologiczne zakończeń przy użyciu mikroskopii laserowej oraz nowszych technik, takich jak STED (mikroskopia stymulowanej emisji z wygaszaniem). W tym preparacie możliwa jest również wizualizacja przy użyciu barwników raportujących cykl pęcherzyków synaptycznych. Akaike i współpracownicy oznakowali zakończenia GABAergiczne barwnikiem styrylowym FM1-43 w celu wizualizacji zakończeń w żywych komórkach4.
Możliwe powinno być również przeprowadzenie jednokomórkowej odwrotnej transkrypcji i PCR w celu profilowania ekspresji RNA w neuronach rozdzielonych metodą wibrodysocjacji. Technika ta jest rutynowo stosowana w przypadku neuronów rozdzielonych enzymatycznie oraz neuronów hodowanych in vitro.

<table><tbody><tr><td>Wibrujący tomograf tkankowy (mikrotom)</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm)</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia z dnem szklanym</td><td>Willco-dish</td><td>GWSB-5040 lub GWSB-3522</td><td>Grubość szkła 0,16-0,19 mm do obrazowania</td></tr><tr><td>Manipulator piez&amp;#8211;elektryczny</td><td>EXFO</td><td>LSS-3000</td><td>Można również użyć przekaźnika itp.</td></tr><tr><td>Stymulator impulsów prostokątnych SD9</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9K</td><td>Do wyzwalania manipulatora piez&amp;#8211;elektrycznego</td></tr><tr><td>Stereomikroskop do sekcji</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>TYP 374590</td><td>Można również użyć dowolnego stereomikroskopu</td></tr><tr><td>Wytwarzarka mikropipet (wyciągacz płomieniowy/Brówna)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne kapilary szklane</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW-150F-4</td><td>Do mikropipet szklanych uszczelnianych płomieniem i mikropipet do patch-clampu</td></tr><tr><td>Sześciokanałowe systemy sterowania zaworami perfuzyjnymi</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 lub VC-6M</td><td></td></tr><tr><td>Szybki sterownik krokowy perfuzji</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony z obiektywami 20-63x</td><td>Nikon Instruments</td><td>TS200 Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon&lt;sup&gt;EM&lt;/sup&gt;+ DU-888</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła do wzbudzenia fluorescencji</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120PC</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźnik wapnia Fluo-4, AM</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>F14201</td><td></td></tr></tbody></table>

wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechaniczna dysocjacja neuronów z ośrodkowego układu nerwowego ma tę zaletę, że kolbki presynaptyczne pozostają przytwierdzone do izolowanego neuronu, który jest przedmiotem badania. Pozwala to na badanie transmisji synaptycznej w warunkach, w których środowisko pozakomórkowe oraz wewnątrzkomórkowe postsynaptyczne mogą być dobrze kontrolowane. Najpopularniejszą techniką izolacji mechanicznej jest metoda oparta na wibracjach, bez użycia proteaz, znana jako wibrodysocjacja. Mikropipetę, której końcówka została wypalona do kształtu małej kuleczki, umieszcza się w plastrze mózgu gryzonia w wieku P1-P21. Mikropipeta wibruje równolegle do powierzchni plastra i jest obniżana przez jego grubość, co prowadzi do uwolnienia izolowanych neuronów. Izolowane neurony są gotowe do badania w ciągu kilku minut od wibrodysocjacji. Technika ta wykazuje przewagę nad zastosowaniem pierwotnych kultur neuronalnych, plastrów mózgu i neuronów izolowanych enzymatycznie, obejmującą: szybką produkcję żywych, stosunkowo dojrzałych neuronów odpowiednich do badań elektrofizjologicznych i obrazowych; lepszą kontrolę środowiska pozakomórkowego, wolnego od wpływu sąsiednich komórek; przydatność do dobrze kontrolowanych eksperymentów farmakologicznych z wykorzystaniem szybkiej aplikacji leków i całkowitej superfuzji komórki; oraz poprawione zacepanie potencjału (space-clamp) podczas rejestracji w konfiguracji whole-cell w porównaniu do neuronów w plastrach mózgu lub preparatach kultur komórkowych. Preparat ten może być wykorzystywany do badania fizjologii, farmakologii, modulacji i plastyczności synaptycznej. Wykorzystując neurony poddane wibrodysocjacji, możliwe jest również obrazowanie w czasie rzeczywistym elementów przed- i postsynaptycznych w żywych komórkach i kolbkach. Charakterystykę składników molekularnych elementów przed- i postsynaptycznych można również przeprowadzić za pomocą metod immunologicznych oraz obrazowania.

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Mechaniczna dysocjacja neuronów z ośrodkowego układu nerwowego ma tę zaletę, że przyciskami presynaptycznymi pozostają one połączone z izolowanym neuronem...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest izolacja neuronów z zachowanymi, odciętymi batonami synaptycznymi, co umożliwia farmakologiczną kontrolę i poprawę klemowania przestrzennego przy jednoczesnym wyeliminowaniu wpływu sąsiednich komórek. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszym etapie ostrych skrawków mózgu szczura lub myszy z okresu postnatalnego od P1 do P21, zawierających interesujący obszar mózgu, a w drugim etapie izolację poszczególnych neuronów. Ostre skrawki umieszcza się w szalce, a następnie w obszarze zainteresowania wibruje się uszczelnioną ogniowo szklaną mikropipetę, przesuwając jej końcówkę przez skrawek, co uwalnia pojedyncze neurony.Neuronom zostawia się czas na przytwierdzenie do dna szalki. Następnie szalkę zawierającą neurony dysocjowane metodą fibro przenosi się pod mikroskop w celu zbadania fizjologii synaptycznej, farmakologii, modulacji i plastyczności, a także obrazowania w czasie rzeczywistym i charakterystyki elementów presynaptycznych i postsynaptycznych w żywej komórce; uzyskane wyniki wykazują charakterystykę fizjologiczną i farmakologiczną odpowiedzi synaptycznych oraz związane z nimi zmiany w funkcji terminali presynaptycznych poprzez rejestrację whole-cell z wysoką szczelnością (tight seal) oraz mikroskopię fluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak rejestracja z plastrów mózgu, hodowli neuronów i neuronów dysocjowanych enzymatycznie, jest to, że przytwierdzone synaptyczne bns umożliwiają kontrolę i wizualizację elementów presynaptycznych, podczas gdy stosunkowo kompaktowa struktura postsynaptyczna pozwala na lepsze zaciskanie napięcia (voltage clamp) i wyjątkową kontrolę środowiska zewnątrzkomórkowego.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wydajność uzyskiwania zdrowych neuronów może się znacząco różnić w zależności od kilku czynników, takich jak wiek zwierzęcia, parametry wibracji oraz wybrany obszar w skrawku. Ponadto u niektórych osób rejestracje komórkowe trwają krócej niż w przypadku konwencjonalnych rejestracji ze skrawków. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy dysocjacji VI są trudne do opanowania ze względu na trudność w dokładnym opisaniu dystansu ruchu i stopnia wnikania w skrawku. Aby przygotować się do wykonania skrawków mózgu, należy przygotować bąbel z sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) nasyconym karbogenem przez 15 minut.Następnie dodaj do roztworu 2 mM chlorku wapnia oraz 1 mM chlorku magnezu. Po znieczuleniu i dekapitacji zwierzęcia w wieku postnatalnym od P1 do P21, wyjmij mózg, a następnie przetnij go w odpowiedniej orientacji tak, aby objąć obszar zainteresowania. Przymocuj wypreparowany mózg do stolika i zanurz go w komorze wypełnionej A CSF.Następnie zamocuj komorę w slicerym do mózgu i wykonaj przekroje mózgu o grubości od 250 do 400 mikrometrów na plaster za pomocą wibracyjnego ostrza. Umieść plastry w A CSF i napowietrzaj je karbogenem w komorze do wstępnej inkubacji przez co najmniej jedną godzinę. Aby przygotować szklaną mikropipetę uszczelnioną ogniowo, najpierw wyciągnij standardową mikropipetę do patch clamp o średnicy końcówki 2 mikrometrów za pomocą wyciągarki Flaming Brown lub równoważnej mikropipetarki.Wprowadź końcówkę mikropipety w płomień palnika Bunsena na około dwie sekundy, aby utworzyć stopioną kulkę o średnicy od 200 do 300 mikrometrów. Następnie umieść tak przygotowaną pipetę z uszczelnioną końcówką w uchwycie mikromanipulatora, który umożliwia szybkie wibracje w płaszczyźnie bocznej o amplitudzie od 100 do 200 mikrometrów, wykorzystując piezoceramiczny przekaźnik bimorficzny lub równoważne urządzenie. Przygotuj roztwór soli fizjologicznej HEPES.Dostosować pH roztworu do wartości 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu oraz osmolarność do około 300 mOsm za pomocą sacharozy. Następnie napełnić szalkę hodowlaną o średnicy 35 mm roztworem soli buforowanej HEPES. Umieścić plaster w szalce hodowlanej i obserwować go pod stereomikroskopem sekcyjnym przy powiększeniu 250 x, posługując się zagiętym drutem.Przymocuj plasterek do dna naczynia, aby dysocjować komórki. Ustaw końcówkę mikro pipety z uszczelnionym płomieniem na powierzchni plasterka. Aktywuj mikromanipulator tak, aby końcówka wibrowała bocznie z częstotliwością od 10 do 30 hertz przy amplitudzie wychylenia wynoszącej około 100 micrometers.Za pomocą mikromanipulatora wprowadź końcówkę mikropipety w głąb skrawka w taki sposób, aby przecięła ona całą jego grubość w ciągu 30 sekund. Powtórz ten krok w razie potrzeby, aby zmaksymalizować liczbę wyizolowanych neuronów. Następnie wyjmij końcówkę ze skrawka.Chwyć plasterek pęsetą i delikatnie potrząśnij nim w roztworze. Następnie całkowicie wyjmij plasterek z roztworu. Pozostaw komórki na co najmniej 10 minut, aby osiadły na dnie naczynia.Umieść szalkę zawierającą neurony na stoliku mikroskopu odwróconego i zwizualizuj je za pomocą obiektywu od 1x do 63x. Poszukaj neuronów, które mają gładkie błony bez pęcherzyków oraz widoczne, ale nie powiększone jądra. W przypadku zastosowania optyki kontrastowej fazowej szukaj neuronów jasnych w fazie o żółtawym zabarwieniu, lecz nie zbyt niebieskich.Wyciągnij standardową mikropipetę do techniki patch-clamp, używając wyciągarki termicznej Brown lub odpowiednika, tak aby oporność końcówki pipety wynosiła od dwóch do czterech mega omów. Napełnij pipetę roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie chlorku cezu do pomiaru odpowiedzi synaptycznych lub roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie chlorku potasu do pomiaru wewnętrznych właściwości błony i potencjałów czynnościowych. Przeprowadź rejestrację w konfiguracji whole-cell na neuronie, stosując standardowe techniki elektrofizjologiczne.W pierwszej kolejności należy zarejestrować spontaniczne prądy postsynaptyczne, stosując protokół akwizycji danych bez przerw (gap-free). Następnie, aby zmienić skład środowiska zewnętrznego, należy zastosować 200 nM toksyny zwierzęcej lub tetrodotoksyny oraz/lub pozakomórkowy roztwór o niskiej zawartości wapnia w celu rejestracji miniaturowych prądów postsynaptycznych. Odpowiednie substancje wprowadza się pojedynczo do jednego z kanałów stopionej szklanej rurki o kwadratowym przekroju, którą umieszcza się w bliskim sąsiedztwie badanego neuronu.Pojedyncza kapilara jest dostarczana do neuronu za pomocą mikromanipulatora napędzanego silnikiem krokowym, który przemieszcza się bocznie, aby umożliwić wymianę roztworu w czasie od 10 do 100 milisekund. Pobrane bns należy obserwować przy dużym powiększeniu z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej w mikroskopie z kamerą lub mikroskopie wielofotonowym. Przedstawiony tutaj obraz neuronu i bns został zarejestrowany za pomocą kamery z urządzeniem ładunkowym CCD z mnożeniem elektronów.Moc źródła światła do wzbudzenia została osłabiona do 1,2% za pomocą filtra neutralnego o gęstości 1,0 oraz filtra przysłonowego ustawionego na 12% wyjścia podczas rejestracji metodą clampy napięciowej. Przy zastosowaniu wewnątrzkomórkowego roztworu opartego na chlorku cezu obserwuje się spontaniczne prądy synaptyczne w celu wizualizacji fuzji pęcherzyków. W batonach presynaptycznych wykorzystano myszy wykazujące ekspresję konstruktu synaptycznej floryny pod kontrolą promotora TH.Synaptic florin to konstrukt molekularny, w którym ecliptic Florin – mutant GFP o zwiększonej wrażliwości na pH – jest połączony z białkiem błony pęcherzykowej podczas fuzji pęcherzyków. Motyw ten zostaje wystawiony na działanie bardziej obojętnego środowiska zewnątrzkomórkowego, co skutkuje wzrostem fluorescencji w punktach odpowiadających pęcherzykom i zakończeniom presynaptycznym. Dysocjacja włókien neuronów hipokampa od tych myszy umożliwia wizualizację fluorescencyjnych punktów o wielkości i lokalizacji oczekiwanej dla zakończeń GABAergicznych podczas przeprowadzania tej procedury.Należy pamiętać, że aby uzyskać zdrowe neurony, konieczne jest zapewnienie zdrowych skrawków. Dlatego przygotowanie ostrych skrawków mózgu jest istotnym etapem w ramach tej procedury. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie białka i rodzaje mRNA są eksprymowane w batonach synaptycznych lub neuronach postsynaptycznych, można zastosować inne metody, np. immunohistochemię lub RT-PCR pojedynczych komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak uzyskać zdrowe izolowane neurony i wykorzystać je w elektrofizjologii oraz obrazowaniu w czasie rzeczywistym.

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wibracyjne oddzielanie neuronów z kromek mózgu gryzoni w celu badania przekazywania synaptycznego i obrazowania presynaptycznych zakończeń

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Film opisuje elektrofizjologiczny zapis synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych w wycinkach mózgu myszy. Plastry zawierające grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) umieszcza się w komorze rejestracyjnej. Pipetę stymulującą umieszcza się na przewodzie wzrokowym w celu stymulacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zbadania synaps retinogenikulacyjnych lub jądra reticularis thalami w celu stymulacji neuronów korowych i zbadania synaps kortogenicznych. Po stymulacji RGC i neurony...

Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Poznaj metodę wibrodysocjacji neuronów z wycinków mózgu gryzoni do badania transmisji synaptycznej i obrazowania zakończeń presynaptycznych. Technika umożliwia patch-clamp i kontrolę farmakologiczną.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Przeglądaj więcej filmów