Name: Diagnostyka ekto- i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Naucz się diagnostyki ektopasożytów i endopasożytów u szczurów i myszy laboratoryjnych. Poznaj metody badania sierści, kału oraz zawartości jelit w celu oceny zdrowia kolonii zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Badanie endopasożytów (Tabela 1)
1. Test taśmowy okolicy okołopierzkowej (patrz również sekcja 5; badania te są zazwyczaj wykonywane jednocześnie)
<ol>
	<li>Oderwij z dyspensera kawałek przezroczystej, matowej taśmy celofanowej. Taśma powinna być na tyle długa, aby można było ją trzymać za jeden koniec bez dotykania środka (około 5 cm). Łatwiej może być oderwać kilka kawałków naraz, przykleić je do krawędzi czystej powierzchni roboczej i używać w miarę potrzeb.</li>
	<li>Wyjmij mysz z klatki, trzymając ją za ogon, i połóż na pokrywie klatki. Czynność tę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli stan zdrowotny zwierzęcia tego wymaga.</li>
	<li>Utrzymaj mysz za ogon, unosząc jej tylne łapy znad klatki. Chwyć koniec taśmy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie kilkakrotnie mocno przyciśnij środek taśmy do krocza myszy, obejmując obszar okołoodbytniczy. Aby test uznano za udany, na taśmie powinny być widoczne przyklejone włosy.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
	<li>Na podpisanym, czystym szkiełku przedmiotowym umieść kroplę oleju mineralnego, przyklej do niego taśmę, a następnie dodaj kolejną kroplę oleju mineralnego. Przykryj całość szkiełkiem nakrywką.</li>
	<li>Oceń preparat na mikroskopie świetlnym, używając obiektywów 10x i 40x. Test taśmy okołoodbytniczej najlepiej wykrywa jaja Syphacia, choć czasami spotykane są jaja innych pasożytów.</li>
</ol>
2. Flotacja kału
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do flotacji, fiolkę z płaskim dnem (fiolkę na tabletki lub urządzenie do flotacji kału, np. Ovatector), szalkę Petriego, szkiełko nakrywką, szkiełko przedmiotowe oraz aplikatory/patyczki do mieszania. Roztwór do flotacji, taki jak Fecasol, powinien mieć gęstość względną 1,20-1,30 i może być sporządzony z różnych soli sodu, cukru, siarczanu cynku lub zakupiony komercyjnie. (Tabela 2)</li>
	<li>Do komory flotacyjnej zebrać 2-5 kulek kału z klatki lub bezpośrednio od zwierzęcia/zwierząt. Jeśli kał jest bardzo suchy, co może wynikać z wieku lub gatunku zwierzęcia, korzystne może być nawilżenie go 500 μl 0,9% soli fizjologicznej.</li>
	<li>Umieścić fiolkę w szalce Petriego, aby chronić powierzchnię roboczą przed wylaniem rozpuszczonego kału. Dodać niewielką objętość medium do flotacji, a następnie dokładnie rozgnieść i wymieszać zawartość. Nie powinny pozostać duże fragmenty materiału. Dodać medium do flotacji, aż nad krawędzią fiolki utworzy się menisk.</li>
	<li>Położyć szkiełko nakrywkę na menisku i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Jaja pasożytów oraz niektóre oocysty pierwotniaków wypłyną na górę i przywrą do szkiełka nakrywki.</li>
	<li>Po inkubacji podnieść i odwrócić szkiełko nakrywkę. Położyć szkiełko nakrywkę na szklanym szkiełku przedmiotowym.</li>
	<li>Zbadać preparat na szkiełku za pomocą obiektywów 10x i 40x pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Mimo że technika ta jest mało zaawansowana i łatwa do przeprowadzenia, ogólnie nie jest zalecana dla myszy lub szczurów. Zasadniczo jest ona bardziej odpowiednia dla zwierząt produkujących większą ilość kału.</li>
</ol>
3. Koncentracja i wirowanie kału
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do flotacji, probówkę do wirowania, szkiełko podstawne, szkiełko nakrywkowe oraz aplikatory/patyczki do mieszania i nakrętki do probówek. Roztwór do flotacji powinien mieć gęstość względną 1,18-1,30 i może być sporządzony z różnych soli sodu, cukru, siarczanu cynku lub zakupiony komercyjnie. (Tabela 2)</li>
	<li>zebrać od 2 do 10 pelletów kału z klatki lub świeżo od zwierzęcia/zwierząt do probówki zbiorczej. Jeśli kał jest bardzo suchy, co może wynikać z wieku lub gatunku zwierzęcia, korzystne może być nawilżenie go 500 μl 0,9% soli fizjologicznej lub stosowanym roztworem do flotacji.</li>
	<li>Wymieszać próbkę w odpowiednim roztworze do flotacji w szklanej probówce do wirowania. Do mieszania próbek można zastosować agitację mechaniczną za pomocą wortexera. W przypadku użycia wortexera należy założyć na probówki nakrętki zatrzaskowe, aby zapobiec rozlaniu zawartości i kontaminacji krzyżowej. Rutynowo próbki przygotowuje się w siarczanie cynku o gęstości względnej 1,18, jednak można stosować inne roztwory dodatkowo (w oddzielnej probówce) lub zamiennie.</li>
	<li>Dodać do każdej probówki dodatkowy roztwór do flotacji, aby utworzył się lekko wypukły menisk. Na każdą probówkę nałożyć plastikowe szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że przylega ono całkowicie do krawędzi probówki. Umieścić probówkę(i) w wirówce.</li>
	<li>Wirować przy prędkości około 616-760 RCF przez 10 minut. Jeśli szkiełka nakrywkowe zgubią się lub pękną podczas procesu wirowania, na probówkę z próbką można nałożyć nowe szkiełko i delikatnie przechylić probówkę tak, aby menisk dotknął nowego szkiełka nakrywkowego. Dodatkowe wirowanie nie jest konieczne.</li>
	<li>Zdjąć szkiełko nakrywkowe z probówki do wirowania i położyć je na opisanym, czystym szklanym szkiełku podstawnym. Jeśli do oceny jednej próbki kału użyto kilku różnych roztworów do wirowania, na jednym szkiełku podstawnym można umieścić dwa szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Zabarwić preparat jodkiem. Ułatwia to identyfikację cyst.</li>
	<li>Zbadać preparat pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywów 10x i 40x.</li>
</ol>
4. Bezpośrednie badanie jelit w kierunku helminthów i pierwotniaków
<ol>
	<li>Umieść ciało uśpionego myszy lub szczura w pozycji grzbietowej na czystej płytce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej.</li>
	<li>Za pomocą pęsety unieś ścianę brzuszną w okolicy narządów płciowych. Używając nożyczek, ostrożnie rozetnij brzuszną ścianę brzucha od okolic narządów płciowych do podstawy klatki piersiowej, usuwając zarówno skórę, jak i mięśnie, aby odsłonić jelita. Usuń jelita, zaczynając od dwunastnicy (odcinka jelita zaczynającego się na wyjściu z żołądka) aż do okrężnicy zstępującej (odcinka jelita kończącego się w odbycie, który zazwyczaj zawiera uformowane kał).</li>
	<li>Umieść jelita w płytce Petriego o pojemności 100 ml. Pobierz fragmenty kątnicy i dwunastnicy z uśpionego zwierzęcia i umieść je na płytce sekcyjnej. Rozetnij każdy odcinek jelita wzdłuż, aby odsłonić błonę śluzową.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek potnij pozostałe jelita na małe fragmenty. Dolej do płytki odpowiednią ilość wody z kranu, tak aby ledwo przykryła zebraną tkankę.</li>
	<li>Inkubuj mieszaninę próbek w temperaturze 35-40°C w piecu laboratoryjnym lub inkubatorze przez minimum 10 minut. Pozwoli to na uwolnienie i odsłonięcie helminthów z lumenu. Podczas inkubacji próbki wykonaj następujące kroki.</li>
	<li>Nanieś dwie krople 0,9% soli fizjologicznej obok siebie na jedno opisane szkiełko, aby umożliwić przygotowanie próbek z dwóch odcinków jelita (dwunastnicy i kątnicy).</li>
	<li>Zesterylizuj termicznie i wystudź pętlę szczepielniczą lub odpowiedni zamiennik.</li>
	<li>Zeskrob błonę śluzową dwunastnicy i umieść zeskrobany materiał po lewej stronie szkiełka (bliżej matowej krawędzi).</li>
	<li>Zeskrob błonę śluzową kątnicy i umieść zeskrobany materiał po prawej stronie szkiełka.</li>
	<li>Przykryj zeskrobany materiał szkiełkiem nakrywką. Zbadaj przygotowane szkiełko za pomocą obiektywu 40x pod mikroskopem fazowo-kontrastowym; w razie potrzeby zwiększ powiększenie w celu identyfikacji. W przypadku wykrycia pasożytów, zidentyfikuj je na podstawie morfologii.</li>
	<li>Zawartość płytki powinna być już gotowa do badania. Zbadaj zawartość płytki pod mikroskopem sekcyjnym. W razie potrzeby użyj sondy lub patyczka aplikacyjnego, aby przesuwać zawartość w obrębie płytki w celu przeprowadzenia dokładnego badania. Jeśli obecne są oksyurice, będą one wyglądać jak małe, białe, nitkowate robaki. Jeśli obecne są tasiemce, będą one wyglądać jak segmentowane, płaskie robaki (większe niż nitkowate oksyurice).</li>
	<li>Jeśli wykryto lub podejrzewa się obecność helminthów, pobierz okaz za pomocą małej pęsety.</li>
	<li>Zamocuj okaz na opisanym, czystym szkiełku przedmiotowym w kropli parafiny lub oleju mineralnego i przykryj go szkiełkiem nakrywką. Zbadaj preparat za pomocą obiektywów 10x i 40x pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
2. Badanie ektopasożytów (Tabela 3)
5. Badanie wyplukanych włosów w kierunku ektopasożytów (test z taśmą klejącą)
<ol>
	<li>Oderwij z dozownika kawałek przezroczystej, niemrożonej taśmy celofanowej. Taśma powinna być wystarczająco długa, aby można ją było trzymać za jeden koniec bez dotykania środka (około 5 cm). Wygodniej może być oderwać kilka kawałków naraz, przykleić je do krawędzi czystej powierzchni roboczej i używać w miarę potrzeb.</li>
	<li>Wyjmij mysz lub szczura z klatki i połóż na jej pokrywie, trzymając zwierzę za ogon. Czynność tę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli stan zdrowia zwierzęcia tego wymaga.</li>
	<li>Utrzymaj mysz lub szczura w unieruchomieniu. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych chwyć sierść i delikatnie wyrywaj ją z okolicy łopatkowej, brzusznej części szyi, obszaru pachwinowego, pachwinowego oraz grzbietnej części zadka. Umieść sierść na taśmie. Aby test uznano za udany, włosy muszą przylegać do taśmy. Umieść mysz lub szczura z powrotem w klatce.</li>
	<li>Nanieś kroplę oleju mineralnego na opisane, czyste szkiełko przedmiotowe; przyłóż taśmę, a następnie nanieś kolejną kroplę oleju mineralnego. Przykryj całość szkiełkiem nakrywką.</li>
	<li>Obejrzyj preparat pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywów 10x i 40x.</li>
	<li>Ta metoda badania jest najskuteczniejsza w wykrywaniu roztoczy futra, takich jak Radfordia, Myobia i Myocoptes.</li>
</ol>
6. Zeskrobanie naskórka
<ol>
	<li>Przygotuj następujące materiały: zwierzę do badania, olej mineralny, szkiełko przedmiotowe, szkiełko nakrywkę, skalpel i nożyczki. Jeśli badanie ma być przeprowadzone na żywych zwierzętach, należy je zanaktywować przed rozpoczęciem procedury.</li>
	<li>Pobierz próbki z grzbietu w pobliżu nasady ogona oraz z okolicy skroniowej głowy. Alternatywnie można zeskrobać zmiany skórne i/lub inne obszary.</li>
	<li>Wykonaj głębokie zeskrobanie skóry ostrzem skalpela w kierunku przeciwnym do wzrostu włosa, aby usunąć naskórek. Przycięcie okrywy włosowej przed skrobaniem może zwiększyć czułość badania poprzez ograniczenie przeszkód wizualnych (nadmiaru włosów) na szkiełku.</li>
	<li>Nanieś kroplę oleju na szkiełko. Przenieś próbkę do kropli oleju, wycierając ostrze (z przyklejoną próbką) o powierzchnię szkiełka. W razie potrzeby dodaj dodatkowy olej na szkiełko i przykryj je szkiełkiem nakrywką.</li>
	<li>Przeanalizuj preparat na szkiełku za pomocą obiektywów 10x i 40x pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Zeskrobina skórna jest zazwyczaj stosowana do wykrywania Demodex (oraz grzybów dermatofitowych).</li>
</ol>
7. Bezpośrednie badanie okrywy włosowej
<ol>
	<li>Umieść uśpioną mysz lub szczura na stole mikroskopu sekcyjnego.</li>
	<li>Obejrzyj owłosienie skóry przy powiększeniu około 10X, używając patyczka aplikacyjnego lub podobnego narzędzia do rozdzielania włosów w celu obserwacji podstawy trzonu włosa.</li>
	<li>Zbadaj obszar czaszki, przestrzenie między oczami a małżowinami usznymi, obszar między małżowinami usznymi, przestrzeń między łopatkami, obszar pod żuchwą oraz okolice pachwinowe i pachowe. Alternatywnie można zbadać całe ciało zwierzęcia.</li>
	<li>Zbierz wszelkie zauważone ektopasożyty lub podejrzany materiał za pomocą małej pęsety. Ektopasożyty często przypominają łupież lub żółtawy, woskowy osad u podstawy trzonu włosa lub bezpośrednio na skórze.</li>
	<li>Zamocuj próbkę na czystym szkiełku przedmiotowym w kropli parafiny lub oleju mineralnego, a następnie przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Zbadaj preparat za pomocą obiektywów 10x i 40x pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki: 
Zapoznaj się z załączonymi plikami służącymi do identyfikacji następujących pasożytów: (Uwaga: procedury te pozwalają wykryć wszelkie jaja, helminty lub cysty obecne w kale lub na skórze i futrze; poniżej wymieniono tylko niektóre z nich)
Endopasożyty:
<table border="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Syphacia muris (jaja, nicienie)</td>
			<td >Chilomastix bettencourti</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Syphacia obvelata (jaja, nicienie)</td>
			<td >Hexamastix muris</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Aspiculuris tetraptera (jaja, nicienie)</td>
			<td >Retortamonas sp.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rodentolepis nana (jaja, nicienie)</td>
			<td >Giardia spp.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tritrichomonas muris</td>
			<td >Spironucleus muris</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Entamoeba muris</td>
			<td >&nbsp;</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>		
Ektopasożyty:
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myocoptes musculinis</td>
			<td>Radfordia affinis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Myocoptes musculinis*</td>
			<td>Radforida ensifera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myobia musculi</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Test taśmowy</td>
			<td>Flotacja kałowa</td>
			<td>FCC</td>
			<td>Badanie bezpośrednie1</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierwotniaki</td>
			<td>--</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+++/NA2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metazoa</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyura</td>
			<td>+/-3</td>
			<td>+/-4</td>
			<td>+4</td>
			<td>+++</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tasiemiec5</td>
			<td>--</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inne nicienie5</td>
			<td>--</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
1. Ta metoda wymaga eutanazji zwierzęcia. 
2. Obecnie nie są dostępne metody detekcji PCR dla każdego pierwotniaka. 
3. Ta metoda jest najodpowiedniejsza do wykrywania Syphacia spp. 
4. Ta metoda z większym prawdopodobieństwem wykryje Aspiculuris, a z mniejszym Syphacia. 
5. Tasiemce i nicienie inne niż nicienie jelitowe (oxyury) występują bardzo rzadko u współczesnych laboratoryjnych myszy i szczurów.
Tabela 1. Klasa endopasożyta i odpowiednia metoda detekcji. Niektóre metody będą wymagały eutanazji zwierzęcia. NA oznacza, że metoda nie jest obecnie dostępna dla tych pasożytów; + oznacza przydatność metody do detekcji danego pasożyta, a – oznacza, że metoda nie jest zalecana dla tego pasożyta.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Gęstość względna</td>
			<td>Składniki na 1 l $H_2O$2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>1.20</td>
			<td>311 g chlorku sodu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azotan sodu</td>
			<td>1.20</td>
			<td>338 g azotanu sodu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azotan sodu</td>
			<td>1.30</td>
			<td>616 g azotanu sodu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cukier</td>
			<td>1.20</td>
			<td>1170 g sacharozy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cukier Sheathera</td>
			<td>1.27-1.30</td>
			<td>1563 g sacharozy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siarczan cynku</td>
			<td>1.18</td>
			<td>493 g siarczanu cynku</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
1. Roztwory te wymagają przechowywania w chłodni lub dodania 9 ml fenolu jako konserwanta.
Tabela 2. Roztwory do flotacji kału (według Smith et al.)
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >&nbsp;</td>
			<td >Wycieranie futra (test taśmowy)</td>
			<td >Zeskrobiny skóry1</td>
			<td >Badanie bezpośrednie1</td>
			<td >PCR</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wszy</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >++</td>
			<td >NA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztocza</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+++</td>
			<td >+++/NA3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pchły4</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >+</td>
			<td >NA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kleszcze4</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >++</td>
			<td >NA</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
1. Metoda ta wymaga znieczulenia, jeśli ma być przeprowadzona na żywym zwierzęciu. 
2. Metoda ta wymaga eutanazji zwierzęcia. 
3. Obecnie nie są dostępne metody detekcji PCR dla każdego gatunku roztoczy. 
4. Pchły i kleszcze występują niezwykle rzadko w nowoczesnych laboratoriach hodowli zwierząt.
Tabela 3. Klasa ektopasożyta i odpowiednia metoda wykrywania. Niektóre metody wymagają eutanazji zwierzęcia, a inne wymagają znieczulenia w celu przeprowadzenia badania na żywych zwierzętach. NA oznacza, że metoda nie jest obecnie dostępna dla tych pasożytów. NA oznacza, że metoda nie jest obecnie dostępna dla tych pasożytów. Znak + oznacza przydatność metody do wykrycia danego pasożyta, a znak – oznacza, że metoda nie jest zalecana dla tego pasożyta.

<ol><li>Baker, D. G. Chapter 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+DG+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%3A+Diseases%22">The Mouse in Biomedical Research: Diseases</a>. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).</li>
<li>Baker, D. G. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+DG+%22Flynn%27s+Parasites+of+Laboratory+Animals%22">Flynn's Parasites of Laboratory Animals</a>. Baker, D. G. , Blackwell. 303-398 (2007).</li>
<li>Owen, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOwen%2C+DG+%22Parasites+of+Laboratory+Animals%22">Parasites of Laboratory Animals</a>. 12, Royal Society of Medicine. (1992).</li>
<li>Pritchett, K. R. Chapter 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPritchett%2C+KR+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%3A+Diseases%22">The Mouse in Biomedical Research: Diseases</a>. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).</li>
<li>Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+PH+%22Flynn%27s+Parasites+of+Laboratory+Animals%22">Flynn's Parasites of Laboratory Animals</a>. Baker, D. G. , Blackwell. 1-13 (2007).</li>
<li>Wasson, K. Chapter 21. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasson%2C+K+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%3A+Diseases%22">The Mouse in Biomedical Research: Diseases</a>. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Charles River, dostawcy testów diagnostycznych i odczynników, w tym testów opisanych powyżej.

Podczas pracy w laboratorium bezpieczeństwo powinno być zawsze priorytetem. Pamiętaj o stosowaniu odpowiedniego sprzętu ochronnego podczas pracy ze zwierzętami oraz o dezynfekcji stanowiska pracy przed i po wykonaniu procedur. Metody te zostały zaprojektowane przede wszystkim w celu wykrycia pasożytów gryzoni laboratoryjnych w badanych lokalizacjach; mogą one zatem wykryć pasożyty egzotyczne lub niezwykle rzadkie, tak jak i częściej występujące oksyurki oraz nużświeci. Choć metody te można z równym powodzeniem zastosować u innych gatunków, gryzonie dzikie mogą posiadać dodatkowe pasożyty w miejscach takich jak wątroba, tkanka podskórna i mózg, które nie są oceniane za pomocą powyższych metod.

<table><tbody><tr><td>Deska do krojenia</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Katalog nr 36114</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5910, G204</td><td>noże 23 mm, 3,5&amp;#8221; długość, prosty</td></tr><tr><td>Nożyczki średnie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6808, G207</td><td>5&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8254 (M1/21004)</td><td>4.5&amp;#8221;ząbkowany, lekko zakrzywiony</td></tr><tr><td>Pinceta do mikrodissekcji </td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5238</td><td>Hudson-(EWALD)</td></tr><tr><td>Pinceta-Pinceta anatomiczna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8160</td><td>Ząb szczura</td></tr><tr><td>Sonda metalowa</td><td>VWR International</td><td>Kat#25778-000</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne</td><td>Vantage</td><td>V97-48</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki aplikacyjne</td><td>Purytanin</td><td>Aplikatory 6-calowe, Ref#807</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51, Schott, ACE1</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR international</td><td>100 mm, nr kat. 3401PDNL</td><td></td></tr><tr><td>Szybki przykrywowe</td><td>VWR international</td><td>Mikropokrywek, kat. nr 48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>VWR International</td><td>szkiełka przedmiotowe do mikroskopu VistaVision nr kat. 16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Pętlą do posiewu</td><td>VWR international</td><td>Katalog nr 50815-040</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus Corporation</td><td>Model#BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka laboratoryjna</td><td>Quincy Lab Inc.</td><td>Suszarka laboratoryjna Model 10</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wierzchołkowe (Vortex)</td><td>VWR international</td><td>Mini-mieszadło wirówkowe</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td>Kimble Chase</td><td>jednorazowa probówka do wirowania 15 ml, nr kat. 73790-15</td><td></td></tr><tr><td>Kaelimki</td><td>VWR international</td><td>Plastikowe szkiełka nakrywki do mikroskopu, 22 mm, nr kat. 48376-049</td><td></td></tr><tr><td>Białe zakrętki</td><td>VWR international</td><td>Nr kat. 60869-089</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Instytut Biochemiczny Rowley</td><td>Kat#SO-364</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan cynku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat. nr 1000917519, Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>Katalog nr 8360-06</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>EMD Millipore</td><td>Nr kat. PX0510-1</td><td></td></tr><tr><td>Taśma celofanowa</td><td>Zszywki</td><td>Taśma niewidoczna, nr kat. 504712</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>Katalog nr 6358</td><td></td></tr></tbody></table>

diagnostyka ektopasożytów i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Pasożyty wewnętrzne i zewnętrzne nadal stanowią istotny problem w laboratoriach hodowli gryzoni, a w wielu placówkach badawczych przebywają zwierzęta zainfekowane pasożytami. Przed przystąpieniem do badania zwierząt pod kątem obecności pasożytów należy rozważyć dwie kwestie: po pierwsze, w jakim celu zostaną wykorzystane zebrane informacje, a po drugie, który test jest najbardziej odpowiedni. Świadomość, że zwierzęta są zapasożyczone, może być kwestią akceptowalną dla placówki, jednak często zachodzi potrzeba wyleczenia zwierząt, a następnie oceny skuteczności zastosowanego leczenia. Pasożyty można wykryć u zwierząt za pomocą różnych technik, w tym poprzez pobieranie próbek od zwierząt żywych lub uśpionych. Historycznie testy o największej czułości diagnostycznej wymagały eutanazji zwierzęcia, choć metoda PCR umożliwiła prowadzenie wysokoczułych testów w przypadku kilku rodzajów pasożytów. Niniejszy artykuł przedstawia procedury wykrywania endo- i ektopasożytów u myszy oraz szczurów. Te same procedury mają zastosowanie do innych gryzoni, choć gatunki stwierdzonych pasożytów będą się różnić.

Niniejszy artykuł opisuje różne procedury przesiewowe u szczurów i myszy w celu wykrycia endo- lub ektopasożytnictwa. Przedstawiono kilka testów diagnostycznych, zarówno tych odpowiednich do stosowania u żywych zwierząt, jak i tych wykonywanych po eutanazji zwierzęcia. Dołączono zdjęcia pomagające w identyfikacji pasożytów szczurów i myszy.

Diagnostyka ektopasożytów i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy

pasożyty wewnętrzne i zewnętrzne wciąż stanowią istotny problem w laboratoriach hodujących gryzonie, a wiele placówek badawczych gości zaparasytowane...

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie, czy w szczurach lub myszach laboratoryjnych występują pasożyty. Można to osiągnąć na różne sposoby, w tym poprzez badanie sierści i skóry, badanie kału oraz badanie zawartości jelit. Ostatecznie, dzięki rutynowemu badaniu tych próbek, można uzyskać wyniki dostarczające istotnych informacji na temat ogólnego stanu zdrowia kolonii.Wizualna demonstracja tych metod jest kluczowa, ponieważ jeśli nie zostaną one przeprowadzone rzetelnie i starannie, infekcja pasożytnicza może zostać przeoczona. Zazwyczaj osoby początkujące w stosowaniu tych metod napotykają trudności, gdyż nawet przy prawidłowo wykonanych technikach pasożyty mogą zostać błędnie zidentyfikowane.Metody, które zaprezentujemy, mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące stanu zdrowotnego szczurów i myszy wykorzystywanych w badaniach. Przed pobraniem próbek sierści i wymazów z okolic odbytu należy przygotować co najmniej dwa szkiełka przedmiotowe na każde zwierzę, nanosząc na nie krople oleju mineralnego. Wyjąć badaną mysz z klatki i umieścić ją na wewnętrznej stronie odwróconej pokrywy klatki.Trzymając mysz za ogon, mocno przyklej pięciocentymetrowy odcinek taśmy celofanowej do krocza i obszaru okołoodbytniczego myszy. W przypadku powodzenia, do taśmy powinny przykleić się włosy.Kontynuuj unieruchamianie zwierzęcia i chwyć jego futro pęsetą. Delikatnie wyrywaj próbki futra z obszaru łopatkowego, brzusznej części szyi, obszaru pachowego, pachwinowego oraz grzbietnej części krupca. Umieść te próbki na pięciocentymetrowym odcinku taśmy celofanowej.Wraz z pobieraniem każdej próbki, naklejaj taśmę stroną klejącą do szkiełka. Po pobraniu wszystkich próbek, nanieś na każdą z nich kolejną kroplę oleju mineralnego i nałóż szkiełka nakrywki. Podczas badania szkiełek z okolic okołoprzypływowych mało prawdopodobne jest znalezienie jaj jakiegokolwiek pasożyta innego niż si facia.W celu badania kału należy pobrać od dwóch do pięciu kulek kałowych od każdego zwierzęcia lub z klatki. Jeśli próbki są bardzo suche, należy zwilżyć je 500 µL 0,9% soli fizjologicznej. Próbki należy umieścić w fiolce na leki o pojemności 10 ml lub w urządzeniu do flotacji kału.Umieść probówkę do pobierania w szalce Petriego i wypełnij ją w jednej czwartej gęstym medium flotacyjnym. Następnie rozgnieć i wymieszaj kał z roztworem w probówce, aż do momentu, gdy nie pozostaną duże fragmenty. Dopełniaj medium flotacyjnym, aż nad krawędzią probówki utworzy się menisk.Następnie należy położyć szkiełko nakrywkę na menisku i inkubować fiolkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Podczas inkubacji pasożyty, jaja oraz proteasomy i oazy unoszą się i przylegają do szkiełka nakrywki, które następnie zostaje przymocowane do preparatu do dalszych badań. Analizę tę można przeprowadzić w tak prostym naczyniu, jak fiolka na leki.Jeśli zamrażarki nie są dostępne, należy zacząć od zebrania od dwóch do 10 odchodów od każdego zwierzęcia, a w przypadku ich wysuszenia – nawodnić je w 500 µL 0,9% soli fizjologicznej. Napełnić szklaną probówkę wirnikową o pojemności 15 ml w jednej czwartej roztworem do fluktuacji o wysokiej gęstości i wymieszać próbkę. Przykryć szklaną probówkę plastikową zakrętką typu snap i mieszać na wstrząsarze wortexowym przez 15 do 30 s, aż mieszanina stanie się homogeniczna.Następnie do każdej probówki z próbką należy dodać dodatkowy roztwór flotacyjny, tak aby utworzył się lekki wypukły menisk. Na każdą probówkę nałożyć plastikowe szkiełko przykrywkowe, upewniając się, że w pełni przylega ono do krawędzi probówki.Aby uzyskać najlepsze uszczelnienie, należy oczyścić probówkę za pomocą tamponu. Następnie odwiruj probówki i szkiełka nakrywowe przez 10 minut. Jeśli którekolwiek ze szkiełek nakrywowych zostanie zgubione lub rozbite, należy je wymienić i delikatnie przechylić probówki tak, aby menisk dotykał nowego szkiełka nakrywowego.Następnie należy zdjąć wszystkie szkiełka nakrywkowe i umieścić je na opisanym, czystym szkiełku mikroskopowym. Barwienie jodem pomoże w identyfikacji cyst u zwierzęcia poddanego anestezji lub eutanazji. Przytrzyj sierść na grzbiecie w pobliżu nasady ogona, w okolicy skroni głowy lub wokół jakiejkolwiek zmiany skórnej bądź innego miejsca poddanego zabiegowi, a następnie głęboko zeskrob skórę ostrzem skalpela, prowadząc go w kierunku przeciwnym do wzrostu włosa.Powoduje to usunięcie naskórka. Przetrzyj ostrze w oleju mineralnym naniesionym na opisany szkiełko. W razie potrzeby dodaj dodatkową kroplę oleju.Przed przykryciem próbki szkiełkiem nakrywką, należy położyć uśpione zwierzę na czystej kasetce sekcyjnej i za pomocą pęsety unieść ścianę brzucha w okolicy narządów płciowych. Następnie, używając nożyczek, ostrożnie nacinamy brzuszną ścianę brzucha od okolicy narządów płciowych do podstawy klatki piersiowej, a następnie usuwamy skórę i mięśnie, aby odsłonić jelita. Po tym czasie należy zebrać fragment kątnicy i dwunastnicy do pokrywki szalki Petriego.Nacinamy każdy segment jelita wzdłuż. Aby odsłonić błonę śluzową, należy nanieść dwie krople 0,9% soli fizjologicznej na pojedynczy opisany szkiełko. Następnie, używając wysterylizowanej pętli do szczepień, zeskrobujemy błonę śluzową dwunastnicy i umieszczamy zdrapane fragmenty w jednej kropli soli fizjologicznej.Powtórz proces, przenosząc próbkę z kątnicy do drugiej kropli. Usuń pozostałą część jelit. Zacznij od dwunastnicy i kontynuuj aż do okrężnicy zstępującej.Przenieś jelita na dno 100 mililitrowej szalki Petriego. Za pomocą nożyczek przetnij jelita na mniejsze fragmenty. Dolej do szalki odpowiednią ilość wody z kranu, tak aby zebrać tkankę całkowicie przykryć.Inkubuj mieszaninę próbki w temperaturze od 35 do 40 °C przez minimum 10 minut. Pozwoli to na uwolnienie i odsłonięcie helmintów z lumenum podczas inkubacji zmacerowanej próbki jelita. Wykorzystaj mikroskopię kontrastową do zbadania próbek dwunastnicy oraz SQL pod kątem obecności pasożytów.Po zakończeniu inkubacji pełnej próbki jelitowej należy zbadać zawartość szalki pod stereomikroskopem. Używając zgłębnika, przeprowadź dokładną inspekcję. Owsiki będą widoczne jako małe, białe, przypominające włosy robaki.Tasiemce będą widoczne jako podzielone na członami płaskie robaki. Należy zebrać wszelkie robaki lub podejrzane materiały za pomocą małej pęsety i umieścić je na preparacie. W celu dalszej analizy pod mikroskopem świetlnym, uśmierconą mysz lub szczura należy umieścić bezpośrednio na stoliku mikroskopu stereoskopowego pod obiektywem 10 x, a następnie za pomocą patyczka aplikacyjnego rozsunąć sierść i zbadać podstawy włosów.Ektopasożyty mogą wyglądać jak łupież lub żółtawka woskowa wydzielina u podstawy włosa lub bezpośrednio na skórze. Należy przeprowadzić badanie w kierunku ektopasożytów co najmniej w obszarze czaszki, a także w okolicach pachwin i pach.Dokładnie sprawdź obszary między oczami, wokół monet, między łopatką a dolną częścią żuchwy. Za pomocą małej pęsety przenieś ewentualne ektopasożyty i inne podejrzane materiały na szkiełko przedmiotowe.Zamontuj je w oleju mineralnym w celu identyfikacji. Procedury te pozwalają na wykrycie wielu powszechnych pasożytów. Oto kilka przykładów.Są to jaja SE facia znalezione w próbkach z taśmy okołodbytkowej. W czopie z futra stwierdzono obecność roztocza myopia musculi w preparacie z wirówki kałowej. Są to jaja picis tetter.W tym bezpośrednim badaniu błony śluzowej jelit można dostrzec trioni; badanie macerowanych jelit ujawniło te dorosłe oksyuriki. Po opanowaniu techniki, pełne badanie pod kątem pasożytów może zająć mniej niż godzinę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania różnych badań pasożytniczych u szczurów i myszy. Pamiętaj, że niektóre z tych pasożytów mogą być przenoszone na ludzi.Zawsze przestrzegaj podstawowych zasad bezpieczeństwa w laboratorium.

diagnosis-of-ecto-and-endoparasites-in-laboratory-rats-and-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozpoznawanie ekto- i endoparazytów u szczurów laboratoryjnych i myszy

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Niniejszy artykuł opisuje procedury przeprowadzania podstawowego badania pośmiertnego myszy lub szczura oraz pobierania podstawowych organów, a także trudniejszych do pozyskania typów próbek do oceny histologicznej, mikrobiologicznej i PCR.

Diagnostyczna sekcja zwłok oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Opracowaliśmy prosty i wszechstronny system do karmienia królików laboratoryjnych twardymi kleszczami. Nasz niepracochłonny protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i może być dostosowywany w zależności od wymagań różnych ustawień eksperymentalnych. Metoda ta pozwala na komfortowe monitorowanie i/lub pobieranie próbek kleszczy przez cały okres karmienia.

Wszechstronny model inwazji kleszczy twardych na królikach laboratoryjnych

Ten protokół wprowadza metodę zmiany klatki dla szczurów poprzez trening klikerowy. Szczury uczą się pożądanego zachowania nie tylko poprzez bezpośrednie szkolenie, ale także poprzez uczenie się przez obserwację. Wdrożenie tego szybkiego i łatwego protokołu może przyczynić się do poprawy samopoczucia i higieny w obiektach dla gryzoni.

Wykorzystanie treningu klikerowego i obserwacji społecznej do nauczenia szczurów dobrowolnej zmiany klatek

Aspiracja cienkoigłowa to technika, dzięki której komórki są uzyskiwane z uszkodzenia lub narządu za pomocą cienkiej igły. Odessany materiał jest rozmazywany, barwiony i badany pod mikroskopem w celu diagnozy lub wykorzystywany do biologii molekularnej, cytometrii lub analizy in vitro. Jest tani, prosty, szybki i powoduje minimalną traumę.

Wykrywanie pasożytów trypanosoma zewnątrznaczyniowego za pomocą aspiracji cienkoigłowej

Strongyloides ratti to pasożytniczy nicień, który powoduje przejściowe infekcje u myszy laboratoryjnych, wykazując migrację tkanek i etapy życia jelitowego. W tym miejscu przedstawiamy protokół utrzymania cyklu pasożytniczego u szczurów i eksperymentalnego zakażenia myszy, w tym kwantyfikację pasożytów w głowie, płucach i jelicie.

Eksperymentalne zakażenie myszy pasożytniczym nicieniem Strongyloides ratti

W niniejszej pracy opisujemy procedurę ortotopowego przeszczepienia kończyny tylnej szczura, która wydaje się być złotym standardem modelu in vivo w badaniach nad allotransplantacją tkanek złożonych.

Ortotopowe przeszczepianie kończyny tylnej u szczurów

Naucz się diagnostyki ektopasożytów i endopasożytów u szczurów i myszy laboratoryjnych. Poznaj metody badania sierści, kału oraz zawartości jelit w celu oceny zdrowia kolonii zwierząt.

Diagnostyka ektopasożytów i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy

Przeglądaj więcej filmów